CN101870668B - 从三孢布拉霉菌发酵液中制备β-胡萝卜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的方法，包括：过滤三孢布拉霉菌发酵液，得到湿菌丝体；将湿菌丝体真空干燥，得到水分小于10％的干菌丝体；研磨粉碎干菌丝体；用相当于干菌丝体质量15～20倍的二氯甲烷浸提过筛后的干菌丝体，蒸发浓缩浸提液至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，保温、过滤得到β-胡萝卜素晶体的湿粗品；再用二氯甲烷溶解所述湿粗品，将溶解液过滤、蒸发浓缩至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，保温、过滤、真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。本方法工艺流程短，操作步骤少，全过程仅使用一种溶剂，生产过程易于控制，产品含量高，且成本低，收率高，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于食品、医药、化工领域，涉及微生物发酵液提取技术，具体涉及一种从三孢布拉霉菌发酵液中制备β-胡萝卜素的方法。
背景技术
类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等)具有增强免疫、抗氧化等多种重要的生理作用，其中的β-胡萝卜素是一种广泛存在的脂溶性类胡萝卜素，与人体的健康密切相关，不仅具有抗癌、抗氧化、抗辐射等很高的药用价值，而且在人和动物体内可转化为维生素A，是人体必需的维生素A的重要来源。大量资料表明，人的血浆中β-胡萝卜素含量过低，与肺癌发生率高密切相关，与乳腺癌，胃癌，膀胱癌，宫颈癌等的发生率呈负相关，同时还会引起眼疾，轻度者发生夜盲症，重度者造成角膜溃疡，晶体脱落甚至失明。因此β-胡萝卜素兼具营养和很高的药用价值，目前已被广泛地应用于食品、药品、化妆品、保健品等行业。
天然β-胡萝卜素可从植物、藻类等含量较高的生物中提取，但受产量、条件等限制，产量有限。发酵法生产的β-胡萝卜素具有与天然产物相同的单一的手性结构产物，且不需复杂的光照等过程、生物量大，因此从上世纪70年代起就得到广泛的关注和研究。其中，三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的正负菌是目前为止发酵生产β-胡萝卜素最为高产的生产菌株，可发酵产生大量的β-胡萝卜素。从植物、藻类等含量较高的生物中提取β-胡萝卜素的研究较多，但从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的研究较少。
现有从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的技术常因浸提不完全导致收率不高，为了提高收率，通常要采取破壁技术。而采用各种破壁的方法又往往造成固液不易分离，工业化应用性不强。如专利申请00116697.2一种β-胡萝卜素的提取方法，就是从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素，其包括：过滤发酵液得到湿菌丝体；将湿菌丝体进行细胞破壁；破壁后的湿菌丝体固液分离，用脱水剂进行脱水；脱水后用有机溶剂提取β-胡萝卜素；提取液经结晶、真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。该专利中使用了破壁技术，因此后续引出了固液分离的步骤，增加了该方法提取β-胡萝卜素的难度。
而本发明在对本申请人三孢布拉霉菌发酵液开展研究的基础上，开发了一种适于工业化生产的方法。本发明不需要采取破壁技术，可以简便的从三孢布拉霉菌发酵液中制备β-胡萝卜素。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种不需采用破壁技术，减少溶剂使用量及种类，更适于工业化生产的从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的方法。
本发明的主要目的在于提供一种从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)过滤三孢布拉霉菌发酵液，得到湿菌丝体；
(2)将所述湿菌丝体在30～50℃真空干燥，得到水分小于10％的干菌丝体；
(3)研磨粉碎所述干菌丝体，过40～60目筛；
(4)用相当于干菌丝体质量15～20倍的二氯甲烷浸提过筛后的干菌丝体，蒸发浓缩浸提液至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，在-5℃～15℃保温，过滤得到β-胡萝卜素晶体的湿粗品；
(5)再用二氯甲烷溶解所述湿粗品，将溶解液过滤、蒸发浓缩至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，在-5℃～15℃保温，过滤、真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。
最好，步骤(2)中所述湿菌丝体在30～50℃真空干燥20～30小时。
最好，步骤(3)中经粉碎后的干菌丝体70％以上能通过40目筛。
最好，步骤(4)中二氯甲烷浸提的温度为32～36℃，浸提时间为1～2小时。
最好，步骤(4)中浸提液浓缩后在-5℃～15℃保温3～6小时。
最好，步骤(5)中湿粗品与二氯甲烷的质量比为1∶5～1∶10，溶解温度为32～36℃。
最好，步骤(5)中溶解液浓缩后在-5℃～15℃保温3～6小时。
最好，步骤(5)中在30～45℃真空干燥8～16小时。
最好，所述β-胡萝卜素晶体中β-胡萝卜素含量高于98％。
其中，粗品或成品的固液分离采用工业上常用的离心或过滤的方式。
本发明提供的从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的方法，与现有技术相比，有以下有益效果：
本发明的方法不需要采用破壁技术，工艺流程短，操作步骤少，全过程仅使用一种溶剂，生产过程易于控制，成本低，收率高，适于工业化生产，产品含量高。按USP标准，β-胡萝卜素含量要求是96.0～101％，本发明所得产品含量均超过98％。
具体实施方式
下面通过对本发明的具体实施例的详细描述来进一步说明本发明，但实施例不是对本发明的限制。
实施例1
采用三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)发酵后的发酵液，用板框过滤得到湿菌丝体，取100g湿菌丝体在30℃真空干燥30小时，干菌丝体重40g，水分9.5％，研磨过40目筛后，菌丝体用800ml(20倍菌丝体重)二氯甲烷32℃浸提2小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml后，在-5℃保温3小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.51g，用17.6ml(5倍湿粗品)二氯甲烷36℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml在-5℃保温3小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过30℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体1.12g，产品含量为98.5％。
实施例2
取100g湿菌丝体在50℃真空干燥20小时，干菌丝体重39g，水分7.2％，研磨过40目筛后，585ml(15倍菌丝体重)二氯甲烷36℃浸提1小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml后，在15℃保温6小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.54g，用35.4ml(10倍湿粗品)二氯甲烷32℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml在15℃保温6小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过45℃真空干燥8小时，得到β-胡萝卜素晶体1.14g，含量为98.8％。
实施例3
取100g湿菌丝体在40℃真空干燥25小时，干菌丝体重39.2g，水分7.3％，研磨过40目筛后，686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml后，在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.56g，用26.7ml(7.5倍湿粗品)二氯甲烷34℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过38℃真空干燥14小时，得到β-胡萝卜素晶体1.15g，含量为99.1％。
实施例4
取100g湿菌丝体在40℃真空干燥25小时，干菌丝体重39.2g，水分7.3％，研磨，70％能过40目筛，合并干菌丝，用686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml后，在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.48g，用26.1ml(7.5倍湿粗品)二氯甲烷34℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过38℃真空干燥14小时，得到β-胡萝卜素晶体1.10g，含量为98.8％。
实施例5
取100g湿菌丝体在40℃真空干燥25小时，干菌丝体重39.2g，水分7.3％，研磨，50％能过40目筛，合并干菌丝，用686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml后，在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.32g，用24.9ml(7.5倍湿粗品)二氯甲烷34℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过38℃真空干燥14小时，得到β-胡萝卜素晶体0.96g，含量为98.5％。
实施例6
取100g湿菌丝体在40℃真空干燥25小时，干菌丝体重39.2g，水分7.3％，研磨过60目筛后，用686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml后，在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.58g，用26.8ml(7.5倍湿粗品)二氯甲烷34℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度50000μg/ml在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过38℃真空干燥14小时得到β-胡萝卜素晶体1.16g，含量为99.2％。
实施例7
取100g湿菌丝体在40℃真空干燥25小时，干菌丝体重39.2g，水分7.3％，研磨过60目筛后，用686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度60000μg/ml后，在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.64g，用27.3ml(7.5倍湿粗品)二氯甲烷34℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度60000μg/ml在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过38℃真空干燥14小时得到β-胡萝卜素晶体1.17g，含量为98.3％
比较实施例1(两次浸提)
取100g湿菌丝体在40℃真空干燥25小时，干菌丝体重39.2g，水分7.3％，研磨过60目筛后，用686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，再用686ml(17.5倍菌丝体重)二氯甲烷34℃浸提1.5小时，合并浸提液浓缩至β-胡萝卜素浓度60000μg/ml后，在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体3.74g，用28ml(7.5倍湿粗品)二氯甲烷34℃溶解、过滤后浓缩至β-胡萝卜素浓度60000μg/ml在5℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过38℃真空干燥14小时得到β-胡萝卜素晶体1.19g，含量为98.1％。
与实施例7相比，本实施例经过二次浸提，虽然所得产量有所增加，但提高不超过2％，且含量有所下降，溶剂单耗上升20％。
比较实施例2
根据日本《食品与科学》1994年公开的方法，取100g湿菌丝体用无水甲醇室温脱水两次，每次加入400ml，湿菌丝体滤饼用二氯甲烷30℃浸提两次，每次加入300ml，浸提液35℃真空浓缩至油状溶液，加入丙酮100ml混合后过滤，粗品溶于氯仿，减压蒸发，20℃下结晶、过滤，得到的β-胡萝卜素溶于苯和95％乙醇混合液中结晶，过滤，干燥得到纯化的β-胡萝卜素晶体0.84g，含量为98.8％。
与本发明相比，由此方法所得β-胡萝卜素含量较好，但收率明显较低，且使用了除二氯甲烷外的多种溶剂，如甲醇、丙酮、氯仿、苯和乙醇，其中甲醇、氯仿等溶剂毒性过大。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
Claims (9)
1.一种从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)过滤三孢布拉霉菌发酵液，得到湿菌丝体；
(2)将所述湿菌丝体在30～50℃真空干燥，得到水分小于10％的干菌丝体；
(3)研磨粉碎所述干菌丝体，过40～60目筛；
(4)用相当于干菌丝体质量15～20倍的二氯甲烷浸提过筛后的干菌丝体，蒸发浓缩浸提液至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，在-5℃～15℃保温，过滤得到β-胡萝卜素晶体的湿粗品；
(5)再用二氯甲烷溶解所述湿粗品，将溶解液过滤、蒸发浓缩至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/m1后，在-5℃～15℃保温，过滤、真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述湿菌丝体在30～50℃真空干燥20～30小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中经粉碎后的干菌丝体70％以上能通过40目筛。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中二氯甲烷浸提的温度为32～36℃，浸提时间为1～2小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中浸提液浓缩后在-5℃～15℃保温3～6小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中湿粗品与二氯甲烷的质量比为1∶5～1∶10，溶解温度为32～36℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中溶解液浓缩后在-5℃～15℃保温3～6小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中在30～45℃真空干燥8～16小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-胡萝卜素晶体中β-胡萝卜素含量高于98％。
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