CN102659652B

CN102659652B - 从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法

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Publication number: CN102659652B
Application number: CN201210106234.5A
Authority: CN
Inventors: 王建刚; 秦宝富; 曹斌云; 廖光红; 郑立飞
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2012-04-12
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-04-12
Also published as: CN102659652A

Abstract

本发明提供一种从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，包括如下步骤：（1）固相萃取：将雨生红球藻粉与硅胶以重量比1∶1-5∶1混合均匀，然后每10g雨生红球藻加入1～5mL的甲醇、10～20mL的石油醚及1～5mL的二氯甲烷，搅拌萃取0.1～1h，将萃取混合物装入层析柱中；（2）洗脱：用甲醇洗脱，收集红色流出液部分；（3）浓缩：将所述红色部分流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。本发明提供的固相萃取方法操作步骤简单、时间短、回收率高、有机溶剂消耗少，环境污染小、生产成本低，且易工业放大。

Description

从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法

技术领域

本发明涉及一种虾青素的固相萃取方法，具体涉及一种从雨生红球藻中提取虾青素的固相萃取方法。属于分离富集化学的固相萃取工艺技术领域。

背景技术

虾青素（Astanxantin）是一种具有邻羟基酮结构的类胡萝卜素，其化学名称为3,3-二羟基-4，4-二酮基-β, β′-胡萝卜素，分子式为C₄₀H₅₂O₄，相对分子量为596.86，纯虾青素是暗红棕色晶体，熔点224℃，不溶于水，能溶于大多数有机溶剂。

虾青素具有超强的抗氧化性和清除自由基的能力，远远超过β-胡萝卜素（约为10倍）、维生素E（约为550倍），被誉为“超级维生素E”和“健康软黄金”。临床及动物学实验表明虾青素具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗衰老、保护皮肤、增强机体免疫、预防心血管疾病、维护眼睛健康、提高动物的繁殖力等多方面重要的生物学功能。

除此之外，虾青素还具有显著的着色性能，目前主要作为水产品、禽蛋、观赏动物养殖和畜牧产品的着色剂。因此虾青素在食品、医药、化妆品、保健品和饲料等行业具有非常大的应用潜力，市场前景广阔。全球虾青素产量每年不超过4吨，国际市场天然虾青素的价格在3500美元/公斤以上（NatuRose (astaxanthin) powder）。

我国天然虾青素的生产目前还处于初级阶段，大量工作主要集中在实验室研究水平。国内虾青素粉（虾青素含量为2～3%）的市场价格为3500元/公斤。因此虾青素的生产具有很大的市场潜力。

商品虾青素的生产主要有两种途径，一是人工化学合成，二是生物提取。

目前，化学合成虾青素在市场上还占据着主导地位，主要供应商有Roche及BASF等公司。但是，采用人工化学合成方法生产虾青素必须面对生产过程中所产生的环境污染问题，另外其产品中还含有不能被人体和动物体所利用的非天然异构体。随着科技的发展、人们生活水平的提高和环保意识的增强，化学合成虾青素在食品、饲料、医药品及化妆品上的应用受到很大的限制，例如美国食品与药物管理局(FDA)仅批准反式结构的虾青素用于水产养殖的添加剂，不允许任何化学合成产品进入保健食品市场。因此，从含虾青素的生物原料中提取天然虾青素已经引起国内外商家的高度关注。

虾青素在生物界分布较为广泛，特别是水产动物如虾、蟹和鱼等，以及鸟类的羽毛中，作为生产原料，人们多采用甲壳动物的壳，酵母菌、藻类和虾青素生产菌。雨生红球藻中虾青素的含量可高达细胞干重的2.0-3.0％，被看作是天然虾青素的“浓缩品”，其所含的虾青素无论从含量、结构、生物可利用性，还是从游离虾青素所占的比例上讲，都具有很强的竞争优势，被公认为是自然界中虾青素的最佳来源。在虾青素含量较高的生物体中，如雨生红球藻、红发夫酵母、短杆菌等，虾青素大多数是以酯类形式存在，如雨生红球藻中就含有70%的单酯和25%的双酯形式的虾青素。

虾青素提取的研究主要涉及破孢、粗提、纯化、皂化和结晶等五阶段。目前报道较多的破孢法有：匀浆法（以水为介质，破壁22min）、冻融温差法（水介质中，- 70℃，处理2次，每次12h）、超声波法（功率400W，超声处理300次，每次5 s）和微波法等，另外还有资料报导采用直接研磨法、液氮低温研磨法、负压空化法和高压均质法等。不同的方法，提取率存在一定差异，以直接研磨法最好，但太过耗时，不利于工业化生产，而负压空化法明显优于其它方法。

目前，国内虾青素提取的研究主要集中在粗提工艺的探索，已报导的方法有碱解法、酸提法和溶剂萃取法等。通常是采用各种非极性或弱极性的溶剂，如植物油，有机溶剂，超临界流体等方法进行萃取，其工艺简单、无需特殊设备，但存在浸提时间长、提取的纯度和效率低，而且有机溶剂的残留问题影响了其在食品和药品等对安全性要求较高领域的应用。

油溶法提取虾青素所用的油脂主要为可食用油脂类，最常见的是大豆油，也可用鱼油。油溶法的优点是产品安全，提取效率高，而其缺点是提取物不易与高沸点的油分离，产品浓度不高，应用范围受到限制。若要进一步纯化，需要采用层析或分子蒸馏等方法。

低沸点有机溶剂是一类提取虾青素的有效溶剂。由于选择的萃取剂沸点低，故可借助蒸馏技术将溶剂回收而循环利用，并可得到浓度较大的虾青素油。常见的溶剂有丙酮、乙醇、氯仿、二氯甲烷等，可单独使用也可将不同的溶剂按一定比例混合使用。

专利02135919.9 介绍了一种从甲壳素工厂加工废水中采用絮凝法提取法虾青素的生产工艺，其实现方案是：用酸处理甲壳素工厂加工的废水或甲壳类生产加工的废水，使其pH为6-7，按加工废水与絮凝剂体积比为100∶1-100∶5加入絮凝剂壳聚糖胶体溶液，反应4-10 h，再用酸调pH至1.5-2.5，产生泡沫，用滤网或泡沫收集器收集泡沫中悬浮的含有虾青素的颗粒，真空干燥，即为虾青素粗品。该工艺过程变废为宝，但需大量酸调解pH，会对环境造成污染，成产成本高，而且需要消耗大量壳聚糖，况且收集泡沫的劳动强度较高，所得产品含杂质较多。

专利02122565.6公开了一种从鲜虾壳生产甲壳素、虾青素和蛋白的方法。其中生产虾青素的方法是将鲜虾壳经机械破碎挤压得到虾液体和虾壳体，对虾液体用有机溶剂萃取1-3次，得到虾青素和油脂的萃取液；对虾壳体部分，先用有机酸脱钙，再用碱液浸泡，然后用有机酸中和碱性浸泡液，沉淀虾青素蛋白复合物。有机溶剂消耗量大、成本高，操作费时，劳动强度高。

专利CN200810236028.X是一种利用克氏原螯虾壳提取虾青素的方法。以克氏原螯虾壳为原料，虾壳烘干后粉碎，用0.5-3mol/L的盐酸浸泡1-8h，干燥虾壳粉与盐酸的比例为1-20g/100mL，离心去盐酸，沉淀物用氯仿提取 8-13h、虾壳粉与氯仿的比例为：1-10g/100mL，离心取上清液，真空浓缩回收氯仿，得到虾青素粗提物。

专利CN200410013634.7是一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的工艺，它是将物料与提取溶媒——乙醇按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，经离心得提取液，提取液减压浓缩至小体积与萃取溶剂——二氯甲烷进行负压空化混旋液萃取，萃取液水洗、脱水后减压浓缩至油状物。

以上由于萃取操作有机溶媒用量大，萃取时间长，萃取物中杂质含量多，有机溶媒回收能耗大，而且需要多次萃取才能获得理想回收率，大量有机溶剂的使用更是带来了高昂的成本和潜在的污染威胁。

超临界流体萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)技术是近年来发展起来的高新技术，由于其提取的产品具有纯度高、溶剂残留少、无毒副作用等优点，在食品和药品加工领域的应用日益增加。CO₂因为具有低毒和低临界温度的优点，而成为在食品和天然产物的超临界提取中最常用的溶剂。

例如专利CN200910102291.4中从雨生红球藻中采用超临界萃取法提取虾青素，是取粉碎的雨生红球藻粉末，装入超临界萃取装置中的萃取釜中，设定萃取釜的温度为30-50℃，压力为20-30MPa，分离釜I的温度和压力分别为30-40℃和8-10MPa，分离釜II的温度为30-40℃，CO₂流体的流速为20-40L/h，萃取时间为2-4h，收集萃取物于容器中保存，萃取物为暗红色粘稠状物质。

又如专利CN201010548303.9一种雨生红球藻提取物的制备方法，以CO₂为萃取介质的超临界流体萃取方法，萃取条件：温度60～80℃，压力35～45MPa，CO₂流速15～25L/h，时间2～4小时，虾青素的含量可达到2～20％(w/w)。

又如专利CN200510053294.5从天然植物福寿草中提取天然虾青素，是利用天然植物福寿草，将其置于超临界流体萃取装置内，通过加热、升压、注入 CO₂流体等手段获得天然虾青素。

超临界萃取技术与油溶法和有机溶剂法等传统技术相比具有：简单、快速、操作方便；萃取过程中所用的提取溶剂为CO₂，使生产过程绿色环保，提取物无有机溶剂残留；萃取过程中温度较低，可以有效的避免有效物质高温分解等优点。但利用超临界萃取技术生产虾青素具有设备前期投资大、生产技术要求高和成品纯度较低等缺点，目前用于大规模工业生产尚存在很大困难。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种操作步骤简单、时间短、回收率高、有机溶剂消耗少，环境污染小、生产成本低且易工业放大的固相萃取方法。

本发明提供一种从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，所述方法包括步骤：（1）固相萃取：将雨生红球藻粉与硅胶以重量比1:1-5:1混合均匀，然后每10g雨生红球藻粉加入1～5 mL甲醇、10～20 mL石油醚及1～5 mL二氯甲烷，搅拌萃取0.1～1 h后，将萃取混合物装入层析柱中；（2）洗脱：用甲醇洗脱，收集红色流出液；（3）浓缩：将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。

洗脱前需对层析柱进行淋洗：即将层析柱抽干后，用石油醚和二氯甲烷依次淋洗，待流出液无色后，抽干。

进一步，所述虾青素油状液体按照如下步骤精提：（4）皂化：将所述油状液体与6～40g/L的氢氧化钾-甲醇溶液按体积比2∶1～10∶1混合，4～15℃，氮气保护条件下，避光皂化1-2 h；（5）离心：在所述皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。

进一步，所述虾青素沉淀按照如下步骤获得结晶产品：(6) 纯化：将所述虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比1:4混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液；(7) 结晶：在所述红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于-10℃-4℃，育晶2-24 h，3000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，无需物料溶剂预处理，有机溶剂消耗少，萃取剂能循环再利用，环境污染小、生产成本低。

2.本发明以少量有机溶媒为中介，将物料中的虾青素萃取到固体萃取剂上，通过固相萃取一步即可从含虾青素的物料中获得虾青素油；操作时间短、速度快，回收率高，杂质少；所用的试剂种类和用量少，而且易回收，成本低。

3.固相萃取物通过选择性淋洗和洗脱，即可获得高纯度的虾青素，且操作简便，回收率高，易工业放大。

4.本发明方法可适用于除雨生红球藻外的多种含虾青素生物源料的加工，也易于作为提取虾青素的生产环节，整合到多种含虾青素生物原料的综合加工工艺中。

具体实施方式：

实施例1 从雨生红球藻中快速分离总虾青素

按照以下步骤进行操作：

1.固相萃取：在200 mL的烧杯中，将10 g雨生红球藻粉与2 g硅胶混合均匀，加入5 mL甲醇，13 mL石油醚、5 mL二氯甲烷，搅拌萃取1 h，再将混合物装入直径为30 mm的层析柱中；

2.淋洗：将层析柱抽干，用石油醚、二氯甲烷依次淋洗，待流出液无色后，抽干；

3.洗脱：用甲醇洗脱，收集红色部分；

4.浓缩：将洗脱液减压蒸馏，得到暗红色油状液体——虾青素油。

实施例2 制备高纯度虾青素

按照以下步骤进行操作：

1.固相萃取：在200 mL的烧杯中，将10 g雨生红球藻粉与10 g硅胶混合均匀，加入1 mL甲醇， 20 mL石油醚、3mL二氯甲烷，搅拌萃取0.5 小时，再将混合物装入直径为30 mm的层析柱中；

3.洗脱：用甲醇洗脱，收集红色流出液；

4.浓缩：将红色流出液减压蒸馏，得到暗红色油状液体——虾青素油；

5.皂化：将虾青素油与40g/L的氢氧化钾-甲醇溶液,按体积比10∶1混合，15℃，氮气保护条件下，避光皂化约2 h，

6.离心：在皂化液中加入适量去离子水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。

实施例3 制备虾青素结晶

按照以下步骤进行操作：

1.固相萃取：在200 mL的烧杯中，将10 g雨生红球藻粉与5g硅胶混合均匀，加入3 mL甲醇，10 mL石油醚、1 mL二氯甲烷，搅拌萃取0.1 h，再将混合物装入直径为30 mm的层析柱中；

3.洗脱：用甲醇洗脱，收集红色流出液；

5.皂化：将虾青素油与40g/L的氢氧化钾-甲醇溶液按体积比10∶1混合，15℃，氮气保护条件下，避光皂化约1 h；

6.离心：在皂化液中加入适量蒸馏水，离心可得到虾青素沉淀；

7.纯化：将所述虾青素沉淀通氮气吹干，用少量石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷-丙酮按体积比4:1混合作为洗脱液洗脱，收集红色条带的洗脱液；

8.结晶：在洗脱液中加入适量去离子水，混匀，置于冰箱中育晶，控制温度降至-10℃时，育晶24小时，然后3000转/min离心，再用去离子水洗涤两次，收集晶体，氮气吹干，获得最终产品。

实施例4

基本与实施例3相同，所不同之处在于：

在结晶时控制温度为-8℃，育晶2小时。

实施例5

基本与实施例3相同，所不同之处在于：

在结晶时控制温度为4℃，育晶12小时。

实施例6

基本与实施例3相同，所不同之处在于：

在结晶时控制温度为0℃，育晶6小时。

实施例7

基本与实施例3相同，所不同之处在于：

在结晶时控制温度为-5℃，育晶18小时。

实施例1中，每10 g雨生红球藻中可获得5 g以上虾青素油，其收率达到虾青素实际含量（依据索氏提取法微量分析数据）的90%以上，实施例3、4、5、6和7中粗提物经过皂化、纯化、结晶等步骤，均可得到0.26 g以上纯度为95%以上的虾青素结晶，其收率亦达到虾青素实际含量的90%以上。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内作出的变化，都应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，其特征在于，所述方法包括步骤：（1）固相萃取：将雨生红球藻粉与硅胶以重量比1:1-5:1混合均匀，然后每10g雨生红球藻粉加入1～5 mL甲醇、10～20 mL石油醚及1～5 mL二氯甲烷，搅拌萃取0.1～1 h后，将萃取混合物装入层析柱中；（2）洗脱：用甲醇洗脱，收集红色流出液部分；（3）浓缩：将所述红色流出液减压蒸馏，得到暗红色虾青素油状液体。

2.按照权利要求1所述的从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，其特征在于，所述虾青素油状液体按照如下步骤精提：（4）皂化：将所述油状液体与6～40g/L的氢氧化钾-甲醇溶液按体积比2∶1～10∶1混合为皂化液，4～15℃，氮气保护条件下，避光皂化1-2 h；（5）离心：在所述皂化液中加入去离子蒸馏水，至红色絮状沉淀产生，离心得到虾青素沉淀。

3.按照权利要求2所述的从雨生红球藻中提取总虾青素的固相萃取方法，其特征在于，所述虾青素沉淀按照如下步骤获得结晶产品：(6) 纯化：将所述虾青素沉淀通氮气吹干，用石油醚溶解，再通过硅胶柱层析纯化，用正己烷与丙酮按体积比1:4混合作为洗脱液洗脱，收集红色流出液；(7) 结晶：在所述红色流出液中加入等体积去离子水混匀，置于-10℃-4℃，育晶2-24 h，3000转/min离心，用去离子水洗涤沉淀两次，收集晶体，氮气吹干，获得结晶产品。