CN108752252A - 一种利用中性蛋白酶提取纯化虾壳和蟹壳中虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用中性蛋白酶提取纯化虾壳和蟹壳中虾青素的方法；首先将新鲜的虾壳或蟹壳粉碎，配制成酶溶液，将虾壳或蟹壳与酶溶液进行酶解反应，固体和有机溶剂混合，在一定条件下提取虾青素，经过滤、蒸发和干燥后得到虾青素，并使用高效液相色谱对虾青素进行定性定量分析。北极甜虾虾壳的虾青素得率为145μg/g，虾青素粗提物纯度为1.12mg/g，纯化后虾青素含量为92％。克氏原螯虾壳的虾青素得率为294μg/g；虾青素粗提物纯度为2.06mg/g，虾青素提取物粗品经过纯化后，纯度达到了95％。本发明具有原料价格低廉、反应条件温和、操作简单、易普及生产和环境友好的优点。该方法不仅能快速提取得到虾青素单体，而且有较高的提取率、稳定性和纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取虾青素单体的方法，具体涉及一种利用中性蛋白酶提取纯化虾壳和蟹壳中虾青素的方法。
背景技术
虾青素(3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素)广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼、藻体中含量较高，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一。虾青素具有极强的抗氧化活性，是维生素E的500倍以上，并具有抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等多重生理功效。不仅如此，虾青素对视力的改善和保护具有独特的效果，可预防和治疗年龄相关性黄斑退化，改善视网膜功能。此外，虾青素具有极强的清除自由基的能力，可预防癌症和心血管等疾病的发生以及帮助修复中枢神经系统。由此可知，虾青素在保健品、药品、食品和化妆品等领域具有广阔的应用前景。
虾、蟹外壳主要来源于海产品加工厂虾、蟹的下脚料和餐桌的废弃物，来源不仅广泛，而且价格低廉。其中除了含有大量的甲壳素、脂肪、蛋白质外，还含有重要的红色类胡萝卜素——虾青素。目前虾壳多被用于饲料的加工或作为废弃物处理，从中提取虾青素，既能够对废弃物进行有效的处理，保护环境，同时能够带来巨大的经济效益，使其“变废为宝”。
为了提高虾壳的经济价值，有人通过有机溶剂萃取法或超临界CO2提取法从虾壳中提取了虾青素，提取的虾青素可以应用于天然的食品色素、保健品、化妆品和药品等领域，具有巨大的经济潜力。然而，有机溶剂萃取法使用的有机溶剂量大，提取率低，生产成本高，且虾青素酯需要强碱水解成单体，对环境有较大的污染。超临界CO2提取法较为安全无毒害，但是设备要求较高，且需要较高的生产成本，较难在工业化生产中普及。
CN105420326A公开了一种木瓜蛋白酶水解虾壳提取蛋白质、虾青素的方法，其利用木瓜蛋白酶水解虾壳提取虾青素，其最终结果得到总类胡萝卜素，其水解作用的选择性差，并没有得到高纯度的虾青素。因此，利用合适的酶进行高选择性的水解虾青素，是提高虾青素的提取率，并进行纯化是迫切需要解决的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，该方法不仅安全、环境友好，而且对设备要求较低，最关键的是，提取步骤少、选择性高、虾青素的提取效率高，且经过硅胶纯化即可得到高纯度的虾青素。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
本发明涉及一种利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将新鲜或干燥的虾壳或蟹壳粉碎，作为原料；
(2)将中性蛋白酶溶于水，原料在酶的水溶液中恒温进行酶解反应；酶解反应结束后，70℃灭活后离心，收集酶解后固体；
(3)将固体与乙酸乙酯有机溶剂混匀，在40-60℃条件下，通过超声或搅拌进行提取，收集提取液，浓缩，得到天然的虾青素粗提物；
(4)将粗提物通过硅胶或大孔吸附树脂柱色谱，以石油醚和甲醇混合溶液为洗脱溶剂，进行分离纯化，得到虾青素的纯品，高效液相色谱测定，纯度为90％。
优选地，在步骤(1)中，所述原料包括：阿根廷红虾虾壳、北极甜虾虾壳、克氏原螯虾虾壳、南极磷虾虾壳、梭子蟹蟹壳和闸蟹蟹壳中的一种或几种混合。
优选地，在步骤(2)中，所述中性蛋白酶与底物的用量比为：1000-10000U/g；酶解反应的条件为：酶解温度35-55℃，酶解时间30-300min，酶解环境pH值5-8。
优选地，在步骤(2)中，所述原料与水用量比为：1:5-30。
优选地，在步骤(3)中，所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、丙酮和正己烷中的任意一种，或者任意几种的混合。
优选地，在步骤(3)中，所述固体与有机溶剂的料液比为1-5g:5-20mL；提取的条件为：提取温度30-60℃，提取时间20-120min，提取1-3次。
优选地，在步骤(4)中，所述硅胶为100-400目。
优选地，在步骤(4)中，所述大孔吸附树脂为AB-8、D101、D201、XDA-1大孔吸附树脂。
优选地，在步骤(4)中，所述洗脱溶剂为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈、水溶剂的混合溶液。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明方法条件简单，不使用强碱等物质水解，虽然使用有机溶剂，但用量少，对环境友好。
(2)本发明方法步骤少，对设备要求较低，降低了生产成本，易于在工业化生产中普及。
(3)本发明方法中性蛋白酶可虾青素与蛋白质脱离，所以本发明的提取方法获得的虾青素的提取收率高，并且虾青素粗提物纯度后的纯度高。
(4)本发明方法反应条件平和，使得提取到的虾青素更为稳定。
(5)本发明方法纯化过程简单，一步纯化，就可以得到高纯度虾青素纯品。
附图说明
测定虾青素高效液相色谱的条件：C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为乙腈：甲醇：二氯甲烷＝80：13：7(v/v/v)，流速1.0mL·min-1，检测波长为474nm，柱温为室温。
图1是实施例1所得到的虾青素的色谱图；
图2是实施例2所得到的虾青素的色谱图；
图3是实施例3所得到的虾青素的色谱图；
图4是实施例4所得到的虾青素的色谱图；
图5是实施例5所得到的虾青素的色谱图；
图6是实施例6所得到的虾青素的色谱图；
图7是实施例7所得到的虾青素的色谱图；
图8是实施例8所得到的虾青素的色谱图；
图9是实施例9所得到的虾青素的色谱图；
图10是实施例10所得到的虾青素的色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
在虾壳或蟹壳中，虾青素多与虾壳和蟹壳中的脂肪酸结合形成虾青素酯，同时又被蛋白质网格结构所包裹。
本发明所使用的中性蛋白酶可用于水解虾壳和蟹壳中的蛋白质，在一定温度、一定pH值下，能将大分子蛋白质水解为氨基酸和多肽链等产物，从而将虾青素和虾青素酯与蛋白质脱离，有利于虾青素的提取。
实施例1
以阿根廷红虾鲜虾壳为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取1g中性蛋白酶溶于500mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将阿根廷红虾鲜虾壳粉碎，取100g与上述中性蛋白酶溶液混合，然后在pH为7，温度为35℃条件下酶解300min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与500mL有机溶剂乙醇混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温40℃磁力搅拌提取120min，过滤，提取3次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到13.65g粉状提取物。以200-300目硅胶为分离介质，以甲醇和水为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，10mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物和纯品中的虾青素含量进行了测定。测定结果见图1。虾青素粗提物的得率为120μg/g；虾青素粗提物纯度为1.22mg/g，纯化后虾青素的纯度为91％
实施例2
以阿根廷红虾鲜虾头为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取10g中性蛋白酶溶于2L水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将阿根廷红虾鲜虾头粉碎，取200g与上述中性蛋白酶溶液混合，然后在pH为5、温度为55℃条件下酶解30min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与700mL有机溶剂乙酸乙酯混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温50℃机械搅拌加25KHz超声提取20min，提取3次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将虾青素粗提物冷冻干燥，经称量，得到24.34g粉状提取物。以100-200目硅胶为分离介质，以乙腈和水为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，22mg。
通过高效液相色谱对虾青素提取物和纯品中虾青素含量进行了测定。测定结果见图2。虾青素粗提物的得率为148μg/g；虾青素粗提物纯度为1.13mg/g，纯化后虾青素的纯度为93％。
实施例3
以北极甜虾鲜虾壳为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取0.15g中性蛋白酶溶于700mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将北极甜虾鲜虾壳粉碎，取100g与上述生物酶溶液混合，然后在pH为5.5、温度为55℃条件下酶解300min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与900mL有机溶剂丙酮混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温60℃40KHz超声提取80min，提取1次，之后对提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到12.8g粉状提取物。以200-300目硅胶为分离介质，以乙腈和石油醚为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，8mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物中虾青素含量进行了测定。测定结果见图3。虾青素的得率为145μg/g；虾青素粗提物纯度为1.12mg/g，纯化后虾青素含量为92％。
实施例4
以北极甜虾鲜虾头为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取0.3g中性蛋白酶溶于900mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将北极甜虾鲜虾头粉碎，取100g与上述中性蛋白酶溶液混合，然后在pH为7.5、温度为40℃条件下酶解200min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与1200mL有机溶剂石油醚混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液60KHz超声+机械搅拌提取60min，提取2次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到14.5g粉状提取物。以200-300目硅胶为分离介质，以甲醇和石油醚为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，11mg。
通过高效液相色谱对虾青素提取物中虾青素的含量进行了测定。测定结果见图4。虾青素提取物中虾青素的得率为141μg/g；虾青素粗提物纯度为1.12mg/g，纯化后虾青素含量为91％。
实施例5
以克氏原螯虾鲜虾壳为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取0.5g中性蛋白酶溶于1500mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将克氏原螯虾鲜虾壳粉碎，取100g与上述生物酶溶液混合，然后在pH为7、温度为50℃条件下酶解180min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与1500mL有机溶剂正己烷混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温55℃80KHz超声+磁力搅拌提取40min，提取3次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到13.5g粉状提取物。以200-300目硅胶为分离介质，以乙醇和石油醚为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，21mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物中虾青素的含量进行了测定。测定结果见图5。虾青素提取物中虾青素的得率为280μg/g；虾青素粗提物纯度为2.12mg/g，纯化后虾青素的纯度为95％。
实施例6
以克氏原螯虾鲜虾头为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取0.25g中性蛋白酶溶于1600mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将克氏原螯虾鲜虾头粉碎，取100g与上述生物酶溶液混合，然后在pH为6、温度为50℃条件下酶解150min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与1700mL由丙酮和石油醚等体积混合组成的有机溶剂混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温50℃机械搅拌提取30min，提取1次，之后对提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到15.2g粉状提取物。以300-400目硅胶为分离介质，以乙醇和石油醚为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，25mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物中虾青素的含量进行了测定。测定结果见图6。虾青素提取物中虾青素的得率为294μg/g；虾青素粗提物纯度为2.06mg/g，纯化后虾青素的纯度为93％。
实施例7
以南极磷虾鲜虾壳为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取1.8g中性蛋白酶溶于1800mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将南极磷虾鲜虾壳粉碎，取100g与上述生物酶溶液混合，然后在pH为7、温度为45℃条件下酶解100min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与2000mL有机溶剂乙酸乙酯混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温30℃机械搅拌提取120min，提取2次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到14.3g粉状提取物。以大孔吸附树脂D101为分离介质，以乙醇和水为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，11mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物中虾青素的含量进行了测定。测定结果见图7。虾青素提取物中虾青素的得率为144μg/g；虾青素粗提物纯度为1.03mg/g，纯化后虾青素的纯度为93％。
实施例8
以南极磷虾鲜虾头为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取5g中性蛋白酶溶于2000mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将玉米蛋白粉粉碎，取100g与上述生物酶溶液混合，然后在pH为6、温度为40℃条件下酶解80min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与1000mL由乙醇、乙酸乙酯和正己烷等体积混合组成的有机溶剂混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温50℃80KHz超声+磁力搅拌提取20min，提取3次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到16.2g粉状提取物。以大孔吸附树脂D201为分离介质，以甲醇和水为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，12mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物中虾青素进行了测定。测定结果见图8。虾青素提取物中虾青素的得率为154μg/g；虾青素粗提物纯度为1.15mg/g，纯化后虾青素的纯度为93％。
实施例9
以梭子蟹壳为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取2.5g中性蛋白酶溶于900mL水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将梭子蟹壳粉碎，取100g与上述混合生物酶溶液混合，然后在pH为5、温度为40℃条件下酶解50min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与1000mL由乙醇、乙酸乙酯和正己烷等体积混合组成的有机溶剂混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温45℃机械80KHz超声+磁力搅拌提取20min，提取3次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到11.6g粉状提取物。以大孔吸附树脂AB-8为分离介质，以乙腈和水为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，10mg。
通过高效液相色谱粉状提取物中虾青素的含量进行了测定。测定结果见图9。虾青素提取物中虾青素的得率为129μg/g；虾青素粗提物纯度为1.31mg/g，纯化后虾青素的纯度为90％。
实施例10
以闸蟹壳为原料，按以下步骤提取虾青素：
第1步：溶解生物酶
取3.5g中性蛋白酶，溶于1L水中。
第2步：进行酶解反应、灭活和预处理
将闸蟹壳粉碎，取100g与上述混合生物酶溶液混合，然后在pH为8、温度为40℃条件下酶解90min。酶解反应结束后，70℃灭活，之后离心，并将下层固体与1000mL有机溶剂二氯甲烷混匀，得到预处理后的酶解液。
第3步：提取和浓缩
对上一步得到的预处理后的酶解液恒温55℃80KHz超声+磁力搅拌提取20min，提取3次，合并提取液，之后对合并的提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到天然的虾青素粗提物。
第4步：分离纯化
将粗提物冷冻干燥，经称量，得到11.6g粉状提取物。以大孔吸附树脂XDA-1为分离介质，以乙醇和水为洗脱液，旋转蒸发仪旋干，得到虾青素纯品，干燥，8mg。
通过高效液相色谱对粉状提取物中虾青素的含量进行了测定。测定结果见图10。虾青素提取物中虾青素的得率为112μg/g；虾青素粗提物纯度为1.16mg/g，纯化后虾青素的纯度为90％。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将新鲜或干燥的虾壳或蟹壳粉碎，作为原料；
(2)将中性蛋白酶溶于水，原料在酶的水溶液中恒温进行酶解反应；酶解反应结束后，70℃灭活后离心，收集酶解后固体；
(3)将固体与乙酸乙酯有机溶剂混匀，在40-60℃条件下，通过超声或搅拌进行提取，收集提取液，浓缩，得到天然的虾青素粗提物；
(4)将粗提物通过硅胶或大孔吸附树脂柱色谱，以石油醚和甲醇混合溶液为洗脱溶剂，进行分离纯化，得到虾青素的纯品，高效液相色谱测定，纯度为90％。
2.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述原料包括：阿根廷红虾虾壳、北极甜虾虾壳、克氏原螯虾虾壳、南极磷虾虾壳、梭子蟹蟹壳和闸蟹蟹壳中的一种或几种混合。
3.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述中性蛋白酶与底物的用量比为：1000-10000U/g；酶解反应的条件为：酶解温度35-55℃，酶解时间30-300min，酶解环境pH值5-8。
4.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述原料与水用量比为：1:5-30。
5.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、丙酮和正己烷中的任意一种，或者任意几种的混合。
6.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述固体与有机溶剂的料液比为1-5g:5-20mL；提取的条件为：提取温度30-60℃，提取时间20-120min，提取1-3次。
7.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述硅胶为100-400目。
8.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述大孔吸附树脂为AB-8、D101、D201、XDA-1大孔吸附树脂。
9.根据权利要求1所述的利用中性蛋白酶提取纯化虾/蟹壳中虾青素的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述洗脱溶剂为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈、水溶剂的混合溶液。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN1715255A (zh) * | 2005-05-20 | 2006-01-04 | 林大昌 | 一种用虾壳生产甲壳素、虾青素、蛋白质、钙粉和生物肥料的方法 |
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- 2018-08-23 CN CN201810966551.1A patent/CN108752252B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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