CN104688801B - 一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺 - Google Patents
一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺 Download PDFInfo
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Abstract
一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，包括以下步骤：(1)将杜仲叶粉碎，过50目筛，向粉末中加入3～5倍质量的水，浸泡半小时；向其中加入纤维素酶和果胶酶；(2)用盐酸溶液调节pH为4.0～5.0，于45～55℃酶解2～3h，然后煮沸2～4min，使酶失活；(3)向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，超声波浸提15～25min，温度为90～100℃，功率为70～80％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液；(4)将提取液采用大孔吸附树脂进行分离，依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液，用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩。本发明简单易行、成本低廉、经济环保，且能最大程度的提取出杜仲中的有效物质，并能用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，属于中药制药或原料加工领域。
背景技术
杜仲是一种用途极广的中药材，黄酮类化合物是杜仲的主要有效成分之一，其含量的高低是判断杜仲生药及其产品质量的重要指标，杜仲中所含黄酮类化合物主要为山奈酚、槲皮素、紫云英苷、陆地锦苷、芦丁等。临床及药理研究表明杜仲黄酮具有抗癌、抗衰老、降血压、抗菌消炎、增强机体免疫等多种药理作用，被广泛用于药品和疗效食品的研究与开发近年来还发现杜仲黄酮在食品、医药和化妆品工业中有广泛的用途，因此对杜仲黄酮提取分离的研究越来越引起世人的关注。
目前采用的水提法、双水相体系萃取、微波提取等方法，提取及精制的生产方法尚比较落后。这些常规方法存在明显的不足之处，如水提法由于操作温度高，杜仲中的杜仲黄酮易发生分解；超声波提取、微波提取，设备成本高，新的工艺尚不成熟，不适合工业生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，该工艺简单易行、成本低廉、经济环保，且能最大程度的提取出杜仲中的有效物质，并能用于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，包括以下步骤：
(1)将杜仲叶粉碎，过50目筛，向粉末中加入3～5倍质量的水，浸泡半小时；向其中加入纤维素酶和果胶酶；
(2)用盐酸溶液调节pH为4.0～5.0，于45～55℃酶解2～3h，然后煮沸2～4min，使酶失活；
(3)向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，超声波浸提15～25min，温度为90～100℃，功率为70～80％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液；
(4)将提取液采用大孔吸附树脂进行分离，依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液，用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩。
所述步骤(4)中浓度为90wt％的乙醇的用量为树脂体积的3～4倍。
所述大孔吸附树脂为D-101、AB-8或X-5型树脂。
在天然产物的提取过程中，通过酶的前期处理，可以破除植物的细胞壁，使细胞内物质充分溶解出来，不仅可以缩短提取时间，减少溶剂用量，而且也可以有效地提高有效成分的提取率。在本发明的生产工艺中，所述杜仲叶粉末与纤维素酶、果胶酶的质量比优选为100：0.12～0.24：0.48～0.96。
本发明的优点在于：
本发明与传统提取法相比具有提取速度快，成本低，不用重结晶，省时、省力，提取率高，杂质含量少，易于纯化，提取工艺不使用有毒溶剂，对环境友好等特点；本发明能最大程度的提取出杜仲中的有效物质，并能用于工业化生产。
附图说明
图1为用于实施例1～9中杜仲叶黄酮的含量检测的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不意味着对本发明保护范围的限制。
实施例1
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶1.2g、果胶酶3.9g；用盐酸溶液调节pH为5.0，于49℃酶解3h，然后煮沸4min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：42(体积比，下同)，超声波浸提22min，温度为95℃，功率为76％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到D-101型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达87.6％。
实施例2
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶0.6g、果胶酶2.4g；用盐酸溶液调节pH为4.0，于45℃酶解2h，然后煮沸2min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：40，超声波浸提15min，温度为90℃，功率为70％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.2得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到D-101型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达85.8％。
实施例3
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶1.2g、果胶酶4.8g；用盐酸溶液调节pH为5.0，于55℃酶解3h，然后煮沸4min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：45，超声波浸提25min，温度为100℃，功率为80％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到AB-8型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达91.3％。
实施例4
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶0.6g、果胶酶4.8g；用盐酸溶液调节pH为4.5，于50℃酶解2.5h，然后煮沸3min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：40，超声波浸提20min，温度为93℃，功率为75％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.2得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到X-5型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达88.7％。
实施例5
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶1.2g、果胶酶2.4g；用盐酸溶液调节pH为4.5，于52℃酶解3h，然后煮沸4min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：42，超声波浸提22min，温度为92℃，功率为77％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.4得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到AB-8型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达86.2％。
实施例6
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶0.8g、果胶酶4.0g；用盐酸溶液调节pH为4.6，于55℃酶解3h，然后煮沸3min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：43，超声波浸提24min，温度为96℃，功率为76％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到AB-8型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达89.4％。
实施例7
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶1.0g、果胶酶4.0g；用盐酸溶液调节pH为5.0，于50℃酶解3h，然后煮沸4min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：42，超声波浸提18min，温度为95℃，功率为76％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.2得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到D-101型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达92.2％。
实施例8
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶1.2g、果胶酶3.5g；用盐酸溶液调节pH为5.0，于45℃酶解2.5h，然后煮沸4min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：41，超声波浸提20min，温度为95℃，功率为73％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到X-5型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达87.0％。
实施例9
称取杜仲干燥叶500g，粉碎，过50目，向粉末中加水浸泡半小时；向其中加入纤维素酶0.6g、果胶酶4.5g；用盐酸溶液调节pH为4.0，于45℃酶解3h，然后煮沸4min，使酶失活；向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，料液比为1：40，超声波浸提19min，温度为90℃，功率为80％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液。
将上述提取液缓慢滴加到AB-8型大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液。然后用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，制得的杜仲黄酮含量达90.5％。
杜仲叶黄酮的含量检测
制作标准曲线
精密称取标准品芦丁10mg，置10mL容量瓶中，加适量甲醇完全溶解后，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5mL移至50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述标准液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于10mL容量瓶中，先加入浓度为5wt％的亚硝酸钠溶液0.6mL，摇匀，放置6min，加入浓度为10wt％的硝酸铝溶液0.6mL，摇匀，放置6min，加入浓度为4wt％的氢氧化钠溶液3mL，再用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置15min后以第一管作空白，在510nm波长处测吸收度。以吸收度A为纵坐标，浓度C(μg/mg)为横坐标，制作标准曲线(见图1)，求得回归方程为A＝0.1259x-0.9129，其中r2＝0.999，符合标准要求。
杜仲叶黄酮的含量检测
不同实施例1～9中90wt％乙醇洗脱得到的洗脱液进行含量测定，根据标准曲线计算纯度和总黄酮收率，结果如表1所示。
表1实施例1～9杜仲叶提取后所得黄酮的纯度及收率
| 实施例 | 黄酮纯度(％) | 总黄酮收率(g/100g药材) |
| 1 | 87.6 | 1.81％ |
| 2 | 85.8 | 1.92％ |
| 3 | 91.3 | 1.73％ |
| 4 | 88.7 | 1.94％ |
| 5 | 86.2 | 1.76％ |
| 6 | 89.4 | 1.67％ |
| 7 | 92.2 | 1.85％ |
| 8 | 87.0 | 1.79％ |
| 9 | 90.5 | 1.80％ |
从表1的数据可以看出，杜仲叶经复合酶预处理，超声提取，用浓度为90wt％的乙醇洗脱，所得产品中杜仲黄酮的含量可达85％以上，本发明能富集药材中46％的杜仲黄酮，说明通过使用本发明的复合酶酶解结合超声提取可将大部分的杜仲叶黄酮富集，且纯度较高。
Claims (3)
1.一种复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将杜仲叶粉碎，过50目筛，向粉末中加入3～5倍质量的水，浸泡半小时；向其中加入纤维素酶和果胶酶，杜仲叶粉末与纤维素酶、果胶酶的质量比为100:0.12～0.24:0.48～0.96；
(2)用盐酸溶液调节pH为4.0～5.0，于45～55℃酶解2～3h，然后煮沸2～4min，使酶失活；
(3)向混合液中加入乙醇至乙醇的浓度为50wt％，超声波浸提15～25min，温度为90～100℃，功率为70～80％，超声产物过滤，滤液浓缩，调pH至6.5得到提取液；
(4)将提取液采用大孔吸附树脂进行分离，依次选用水、浓度为10wt％的乙醇进行洗脱，弃洗脱液，用浓度为90wt％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩。
2.根据权利要求1所述的复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，其特征在于，所述步骤(4)中浓度为90wt％的乙醇的用量为树脂体积的3～4倍。
3.根据权利要求1所述的复合酶结合超声自杜仲叶提取杜仲黄酮的生产工艺，其特征在于，所述大孔吸附树脂为D-101、AB-8或X-5型树脂。
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