CN109364110B - 一种从美藤果壳提取黄酮的方法及其应用 - Google Patents

一种从美藤果壳提取黄酮的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从美藤果壳提取黄酮的方法，先取美藤果壳烘干、粉碎，再将粉碎后的美藤果壳与水混匀，并加入复合酶进行水解，然后酶解液内加入乙醇，超声处理，过滤后减压蒸馏，将得到粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩后真空干燥，得到黄酮提取物。本发明利用大量废弃的美藤果壳作为原料提取分离黄酮，原料易得，提升了美藤果的附加值。

Description

一种从美藤果壳提取黄酮的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种从美藤果壳提取黄酮的方法及其应用。
背景技术
美藤果又名南美油藤，生长于南美洲安第斯山脉地区热带雨林。现在我国云南普洱和西双版纳等地广泛种植。 美藤果果仁营养丰富，富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素及矿物质，能够促进骨骼生长及神经系统发育，预防心血管疾病，防癌等方面具有重要功能作用。2013年1月正式公告批准美藤果油为国家新资源食品。现阶段主要是利用果仁提炼美藤果油及加工相关终端产品，脱壳生产后留下的美藤果外壳含有丰富的多酚及黄酮等活性成分。这些副产物的丢弃一方面污染了环境，另一方面浪费了其中的大量资源。因此，研究一种从果壳兼具高提取率及高纯度的提取方法，加强美藤果壳的综合利用，变废为宝，提高其附加值具有很大经济价值。
对果壳中总黄酮提取方法有超声波辅助提取法（CN104857031B一种刺头复叶耳蕨总黄酮提取物的制备方法）、乙醇浸提法（CN105560330 A一种火龙果皮总黄酮的提取方法）、逆流提取法（CN101669980 B从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法）。超声波辅助提取法因为其提取率高、用时短是目前使用较多的一种提取黄酮的方法，但是由于提取过程中掺杂了多糖、蛋白等大分子，使其提取纯度较低；乙醇浸提法虽然方法简单，对设备要求低，但是提取率低、纯度低；逆流提取法耗时较长，并且对设备要求高。另外，现有的纯化方法多为聚酰胺纯化法，纯化后黄酮产品纯度低，洗脱麻烦，对黄酮类成分的不可逆吸附值高。
发明内容
为了解决目前美藤果壳资源大量浪费的现象，更好的开发和利用美藤果壳资源，本发明的提出了一种高效、节能的从美藤果壳中提取黄酮的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种从美藤果壳提取黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，取美藤果壳烘干、粉碎；
步骤2，将粉碎后的美藤果壳与水混匀，并加入复合酶进行水解；
步骤3，向步骤2的酶解液内加入乙醇，超声处理，过滤后减压蒸馏，得粗提物；
步骤4，将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩后真空干燥，得到黄酮提取物。
进一步地，步骤2中美藤果壳与水按重量比1：10混匀。
进一步地，步骤2中复合酶是纤维素酶和果胶酶按重量比1:1-3:1混合得到，加酶量为美藤果壳粉重量的0.2-1.2%，酶解温度为40℃-50℃。
进一步地，步骤3中酶解液和乙醇的体积比为1：1，超声处理的温度为40-70℃，超声功率为100-300W，超声处理时间为40min。
进一步地，步骤4中大孔树脂层析的吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂，上样液体浓度为0.5-2.0mg/mL，上样速率为1.0-5.0BV/h。
有益效果：
1、本发明利用大量废弃的美藤果壳作为原料提取分离黄酮，原料易得，提升了美藤果的附加值。
2、本发明选用复合酶（纤维素酶-果胶酶）充分破坏了以纤维素和果胶为主的细胞壁结构，使细胞内的黄酮类物质充分地释放出来。酶法-超声辅助技术结合，加快了美藤果壳中总黄酮的浸出，反应条件温和，提高了生产效率；AB-8型大孔树脂层析，提高了黄酮的纯度产品品质佳。
3、本提取工艺的提取物对胆固醇酯酶活性具有很好的抑制效果，可降低胆固醇浓度，因此可作为保健食品或药品原料，更好的开发和利用了美藤果壳资源。
附图说明
图1为实施例1中酶解时间对总黄酮得率的影响结果图。
图2为实施例1中酶解pH值对总黄酮得率的影响结果图。
图3为实施例1中超声时间对总黄酮提取率的影响结果图。
具体实施方式
实施例1
从美藤果壳中提取黄酮的方法研究试验：
(一)工艺参数的研究
申请人经过多次研究，发现酶解过程中，酶解时间、酶解pH值；超声提取过程中超声时间及粗提物纯化过程中树脂类型影响黄酮纯度，因此申请人对此深入研究，确定最佳参数。
以下实验中，总黄酮含量测定：利用紫外-可见分光光度法，以芦丁为标准品，采用Al(NO3)3显色法，根据标准曲线法测定各样品中总黄酮的含量。
1、酶解时间对总黄酮得率的影响
取美藤果壳烘干、粉碎；将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀；加入复合酶水解，复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为2:1；加酶量为美藤果壳粉0.8%；酶解温度为45℃，pH4.0，酶解时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）；酶解液内加入等体积乙醇，超声时间：40min；超声温度：50℃；超声功率：200W。得粗提物。
酶解时间对总黄酮得率的影响如图1所示，随着酶解时间的增加，提取率先增加后降低。但酶解时间为1.5h时，总黄酮提取率最大，所以选用1.5h为最佳酶解时间。
2、酶解pH值对总黄酮得率的影响
取美藤果壳烘干、粉碎；将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀；加入复合酶水解，复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为：2:1；加酶量为美藤果壳粉0.8%；酶解温度为45℃，酶解时间1.5h, PH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）,酶解时间2h；酶解液内加入等体积乙醇，超声时间：30 min；超声温度：50℃；超声功率：200W。得粗提物。
酶解pH对总黄酮得率的影响如图2所示，随着酶解pH的增加，提取率先增加后降低。但酶解pH为4.5时，总黄酮提取率最大，所以选用pH4.5为最佳酶解PH值。
3、超声时间对总黄酮得率的影响
取美藤果壳烘干、粉碎；将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀；加入复合酶水解，复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为：2:1；加酶量为美藤果壳粉0.8%；酶解温度为45℃，酶解时间1.5h, PH值4.0,酶解时间2h；酶解液内加入等体积乙醇，超声时间（10、20、30、40、50min）；超声温度：50℃；超声功率：200W。得粗提物。
超声时间对总黄酮得率的影响如图3所示，随着超声时间的增加，提取率增加。但当超声功率达到40min时，总黄酮得率最大，所以选用超声时间为40min。
4、根据静态吸附率和解吸率选择大孔树脂
取美藤果壳烘干、粉碎；将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀；加入复合酶水解，复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为：2:1；加酶量为美藤果壳粉0.8%；酶解温度为45℃，酶解时间1.5h, PH值4.0,酶解时间2h；酶解液内加入等体积乙醇，超声时间（10、20、30、40、50min）；超声温度：50℃；超声功率：200W。得粗提物。取4 种树脂（D101、HPD-450、AB-8、HPD-100），加入样品液吸附后，测吸附率；用 90%的乙醇解吸，测解析率。选出吸附和解吸效果好的树脂。
由表1 可以得出，AB-8 树脂和 D101 树脂对黄酮的吸附效果和解吸效果相对较好，但是AB-8 树脂的吸附效果更优，综合考虑，本实验采用 AB-8 树脂作为纯化美藤果壳黄酮的树脂。
表1 四种树脂对黄酮的吸附、解吸结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
一种从美藤果壳提取黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
1）取美藤果壳烘干、粉碎；
2）将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀，加入复合酶水解。
3）酶解液内加入乙醇，超声处理40min，过滤后减压蒸馏得粗提物。
4）将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩真空干燥，得到纯化黄酮。
所述步骤2中加入复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为：1:1；加酶量为美藤果壳粉0.2%；酶解温度为40℃，酶解pH值4.5。所述步骤3酶解液内加入等体积乙醇，超声温度：40℃；超声功率：100W。所述步骤4粗提物通过大孔树脂层析，吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂。上样液体浓度为0.5mg/mL，上样速率为1.0BV/h。
本方法所得美藤果壳黄酮的提取率为8.7%，黄酮纯度为87.32%。
通过胆固醇酯酶活性检测，验证纯化后黄酮对胆固醇酯酶的抑制效果。对胆固醇酯酶活性检测方法为：对胆固醇酯酶的抑制活性测试，测试温度保持在（25.0±0.2）℃。 所有的反应在含有 NaCl （0.1 mol/L）、对硝基苯基丁酸酯（4-Nitrophenyl butyrate，PNPB0.2 mmol/L）、牛磺胆酸钠（ 5.16 mmol/L）的磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0） 中进行。胆固醇酯酶预先溶解在高纯水中20 ug/mL；底物PNPB和抑制剂预先溶解在乙腈中，在-20℃保存。加入猪胰腺胆固醇酯酶（0.72 U/mL）启动反应，25.0 ℃反应 5 min， 在405 nm 紫外可见分光光度计检测。
当黄酮提取物浓度在500μg/mL时对胆固醇酯酶活性抑制率到了63.31％，其IC50值为0.58mg/mL。
实施例3
一种从美藤果壳提取黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
1）取美藤果壳烘干、粉碎；
2）将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀，加入复合酶水解。
3）酶解液内加入乙醇，超声处理40min，过滤后减压蒸馏得粗提物。
4）将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩真空干燥，得到纯化黄酮。
所述步骤2中加入复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为1:2；加酶量为美藤果壳粉0.4%；酶解温度为43℃，酶解pH值4.5。所述步骤3酶解液内加入等体积乙醇，超声温度：50℃；超声功率：150W。所述步骤4粗提物通过大孔树脂层析，吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂，上样液体浓度为1.0mg/mL，上样速率为2.0BV/h。
本方法所得美藤果壳黄酮的提取率为9.4%，黄酮纯度为85.32%。
对胆固醇酯酶活性检测方法与实施例1相同。
当黄酮提取物浓度在500μg/mL时对胆固醇酯酶活性抑制率到了58.27％，其IC50值为0.59mg/mL。
实施例4
一种从美藤果壳提取黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
1）取美藤果壳烘干、粉碎；
2）将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀，加入复合酶水解。
3）酶解液内加入乙醇，超声处理40min，过滤后减压蒸馏得粗提物。
4）将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩真空干燥，得到黄酮提取物。
所述步骤2中加入复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为：1:3；加酶量为美藤果壳粉0.6%；酶解温度为46℃，酶解pH值4.5。所述步骤3酶解液内加入等体积乙醇，超声温度：60℃；超声功率：200W。所述步骤4粗提物通过大孔树脂层析，吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂，上样液体浓度为1.5mg/mL，上样速率为3.0BV/h。
本方法所得美藤果壳黄酮的提取率为10.4%，黄酮纯度为91.2%。
对胆固醇酯酶活性检测方法与实施例1相同。
当黄酮提取物浓度在500μg/mL时对胆固醇酯酶活性抑制率到了68.27％，其IC50值为0.47mg/mL。
实施例5
一种从美藤果壳提取黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
1）取美藤果壳烘干、粉碎；
2）将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀，加入复合酶水解。
3）酶解液内加入乙醇，超声处理40min，过滤后减压蒸馏得粗提物。
4）将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩真空干燥。
所述步骤2中加入复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为2:1；加酶量为美藤果壳粉0.8%；酶解温度为48℃，酶解pH值4.5。本发明所述步骤3酶解液内加入等体积乙醇，超声温度：60℃；超声功率：250W。所述步骤4粗提物通过大孔树脂层析，吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂，上样液体浓度为2.0 mg/mL，上样速率为4.0BV/h。
本方法所得美藤果壳黄酮的提取率为9.1%，黄酮纯度为93.2%。
对胆固醇酯酶活性检测方法与实施例1相同。
当黄酮提取物浓度在500μg/mL时对胆固醇酯酶活性抑制率到了71.27％，其IC50值为0.43mg/mL。
实施例6
一种从美藤果壳提取黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：
1）取美藤果壳烘干、粉碎；
2）将粉碎后的美藤果壳按1:10的比例加水混匀，加入复合酶水解。
3）酶解液内加入乙醇，超声处理40min，过滤后减压蒸馏得粗提物。
4）将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩真空干燥。
所述步骤2中加入复合酶纤维素酶和果胶酶的比例为：3:1；加酶量为美藤果壳粉1.0%；酶解温度为50℃，酶解PH值4.5。所述步骤3酶解液内加入等体积乙醇，超声温度：70℃；超声功率：300W。所述步骤4粗提物通过大孔树脂层析，吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂，上样液体浓度为2.0 mg/mL，上样速率为5.0BV/h。
本方法所得美藤果壳黄酮的提取率为8.7%，黄酮纯度为88.3%。
对胆固醇酯酶活性检测方法与实施例1相同。
当黄酮提取物浓度在500μg/mL时对胆固醇酯酶活性抑制率到了67.27％，其IC50值为0.57mg/mL。
本发明针对现有技术的不足，提供了一种美藤果壳黄酮提取及纯化工艺。该方法以纤维素酶和果胶酶的预处理方法充分降解美藤果壳的纤维素、木质素及果胶等成分，分解原来紧密的细胞壁及细胞间层的结构，有效增加美藤果壳黄酮的溶出率，提高美藤果壳黄酮的提取效率。超声提取法的超声场与物质之间会产生空化作用，溶液中会产生共振现象，具有缩短试验操作时间，降低实验成本，使有效成分充分溶出的优势。提取物经AB-8型大孔树脂层析，提高了黄酮的纯度。纯化后黄酮对胆固醇酯酶有明显抑制效果，可用于保健食品或药品领域。
高血脂、高胆固醇是目前影响人们健康的危险因素，目前降低胆固醇的药物主要是西药，例如洛伐他丁，但是西药副作用大，且价格昂贵，易产生药物依赖性，因此，从天然产物探求降低胆固醇的活性因子是目前的研究热点。胆固醇酯酶可以在小肠内水解食品中胆固醇酯为游离胆固醇，增加其在胆固醇胶束中的溶解度，促进小肠对胆固醇吸收。因此，抑制胆固醇酯酶的活性，可以降低小肠对胆固醇吸收。目前胆固醇酯酶抑制剂主要是黄酮或黄酮衍生物，本发明提取纯化后的美藤果壳黄酮对胆固醇酯酶具有很强的抑制效果，CN106038672A公布了美藤果壳提取物在制备降压药物中的应用，但是该申请得到的只是粗提物，没有研究是哪一种活性因子起作用，且提取过程很简单。本发明深入探究了美藤果壳黄酮的提取过程，并且发现其降胆固醇的效果。美藤果壳黄酮提取物其应用效果促进了美藤果资源深加工。

Claims (1)

1.美藤果壳黄酮提取物在制备降低胆固醇的药物中的应用，所述美藤果壳黄酮提取物的提取方法包括以下步骤：
步骤1，取美藤果壳烘干、粉碎；
步骤2，将粉碎后的美藤果壳与水按重量比1：10混匀，并加入复合酶进行水解，复合酶是纤维素酶和果胶酶按重量比1:1-3:1混合得到，加酶量为美藤果壳粉重量的0.2-1.2%，酶解温度为40℃-50℃，酶解pH值4.5；
步骤3，向步骤2的酶解液内加入乙醇，超声处理，过滤后减压蒸馏，得粗提物，酶解液和乙醇的体积比为1：1，超声处理的温度为40-70℃，超声功率为100-300W，超声处理时间为40min；
步骤4，将粗提物通过大孔树脂层析，收集洗脱液，浓缩后真空干燥，得到黄酮提取物，大孔树脂层析的吸附剂为AB-8型大孔吸附树脂，上样液体浓度为0.5-2.0mg/mL，上样速率为1.0-5.0BV/h。
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