CN101486651A - 一种杜仲叶中提取绿原酸的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杜仲叶中提取绿原酸的方法，本发明还公开了一种绿原酸在鱼病防治物中的应用，该方法包括粉碎、酶处理、超声波处理、过滤、提取、浓缩与纯化等步骤，本发明的方法具有工艺操作简便、成本低、无有害溶剂、得率高、适用于工业化生产等优点，而且绿原酸对水产养殖中常见的病原菌具有良好的抑菌效果，对嗜水气单胞菌的抑菌效果与抗生素类抗菌药物相当，能够增强机体免疫力，对细菌性疾病具有较强的预防作用。

Description

一种杜仲叶中提取绿原酸的方法及其应用

技术领域

本发明公开了一种杜仲叶中提取绿原酸的方法，本发明还公开了一种绿原酸在鱼病防治物中的应用。

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides)在我国是一种具有2000多年历史的中药材，其功效为补肝肾，强筋骨，安胎等；同时杜仲对治疗高血压症有特效。绿原酸为杜仲叶主要有效成分之一，具有显著的生理活性。绿原酸为咖啡酰奎尼酸衍生物，具有利胆、抗菌、抗病毒、降压、升高白细胞及兴奋中枢神经系统等多种药理作用，是保健食品、药品、化妆品等工业的重要原料。绿原酸多从植物中提取，以往国内外提取绿原酸主要从生咖啡豆和金银花中获得。

杜仲叶为杜仲科落叶乔木杜仲的叶子，其绿原酸含量为1％～5.5％，一直以来人们都是以杜仲皮入药，而叶子往往被废弃。现代医学研究证实了杜仲叶与皮的化学成分基本一致，具有同等功效，可以以叶代皮。我国杜仲资源储备丰富，广泛分布于长江、黄河中上游地区，干叶年产量相当大，完全能够满足鱼饲料中添加的要求。以杜仲叶为原料提取绿原酸具有广阔的开发前景。

在马希汉等所撰写的“从杜仲叶中提取绿原酸纯品的研究”(参见《西北林学院学报》1996，11(2)：58-60)，采用氯仿脱脂、化学萃取、无机盐析，此工艺方法未能有效的去除杜仲叶中的杂质(如蛋白质、胶质、纤维素)，使绿原酸很难溶出，且只适用于实验室小剂量制备。在王洪武等所撰写的“杜仲叶中绿原酸类物质的提取研究”(参见《江西师范大学学报》)(自然科学版)1977，21(4)：339-341)中，采用的是溶剂提取、碱性Pb(OAc)和KOAc沉淀，再溶解萃取重结晶制得，但铅会在绿原酸产品中存有残留，含铅提取液会对环境造成不良影响，因此，该方法不适宜工业化大规模生产。在戚向阳等撰写的《杜仲叶绿原酸的提取、分离和鉴定》(参见《植物资源与环境》1998，7(1)：61-62)中，采用水浸提、101树脂分离、有机溶剂萃取纯化，其绿原酸的含量仅为24.33％。以上工艺技术未对绿原酸提取、纯化过程中的各种影响因素没有给以综合考虑和解决，且要求达到99％以上的含量，生产成本大和有的并未达到工业化生产的规模。专利98112603.0“一种鱼杜仲饲料的生产方法”是将杜仲叶直接粉碎后添加饲料中，且添加量在5-8％，添加量过大，不仅影响了饲料的营养配比，而且还在一定程度上影响了饲料产品外观和适口性(吕武兴“杜仲饲料添加剂应用研究现状与展望”(参见《饲料世界》2004年4期)。专利200410045040.4“杜仲饲料添加剂”主要是以杜仲叶的提取物为全部添加，而2000年王纪亭等在“杜仲叶对肉鸡生产性能影响的研究”一文中表明在肉仔鸡日粮中添加杜仲提取物，对肉仔鸡全期生长并无显著影响。这可能是由于杜仲有效成分中的黄酮类化合物，对许多酶的活性有抑制作用(参见《国外医药》1998彭芳“黄酮类化合物的生物活性”)能抑制动物的生长，降低其饲料的利用率。本发明主要以杜仲叶中绿原酸活性成分为添加物。

发明内容

本发明的目的之一是克服现有技术中存在的不足，提供一种工艺操作简便、成本低、无有害溶剂、得率高、适用于工业化生产的杜仲叶中提取绿原酸的方法。

本发明的另一目的是提供一种绿原酸在鱼病防治物中的应用。

按照本发明提供的技术方案，所述杜仲叶中提取绿原酸的方法包括如下步骤：

1.1.1 粉碎：将新鲜或干燥的杜仲叶粉碎，过80目筛，得到杜仲叶粉末；

1.1.2 酶处理：在杜仲叶粉末中添加活力为500～1000U/g的植物纤维素酶并放入密闭容器中，植物纤维素酶的添加量为杜仲叶粉末重量的0.4％～0.6％倍，再在密闭容器中加入pH4～5的去离子水并搅拌均匀，去离子水的加入量为杜仲叶粉末重量的8～12倍，控制混合物的温度为35～50℃，恒温浸泡20小时以上；

1.1.3 超声波处理：将酶处理后的混合物在常温、超声波频率为20～100KHz条件下波处理20～40min；

1.1.4 过滤：将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤或者用板框压滤机在0.1～0.4Mpa的压力范围内压滤出滤液；

1.1.5 提取：过滤后的滤渣用滤渣重量8～12倍的、50～80℃的去离子水强制回流0.5～1小时，重复提取1～3次得到提取液；

1.1.6 浓缩：合并步骤1.14的滤液和步骤1.15的提取液，在-0.085～-0.1Mpa的真空度条件下浓缩，浓缩液中加入浓缩液重量0.5％～2％倍的壳聚糖，搅拌，絮凝，使混合物在40～60℃条件下避光静置40～60min，然后过滤，滤液用滤液重量1％～3％倍的活性炭脱色，得到脱色后的浓缩液；

1.1.7 纯化：脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附，吸附后用体积百分含量为20％～30％的乙醇水洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品，将粗品用2～6倍去离子水重结晶得到绿原酸成品。

上述方法提取的绿原酸在鱼病防治物中的应用，具体为每公斤鱼饲料中添加1.3～2.1g的绿原酸成品，制成饲料颗粒；或者，每亩水域泼洒500～800g的绿原酸。

本发明的方法具有工艺操作简便、成本低、无有害溶剂、得率高、适用于工业化生产等优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

杜仲叶中提取绿原酸的方法包括如下步骤：

1.1.1 粉碎：采集7～10月份的杜仲叶，烘干，干燥后的含水量≤10％，将干燥的杜仲叶粉碎，过80目筛，得到1000g杜仲叶粉末；

1.1.2 酶处理：在杜仲叶粉末中添加活力为500～1000U/g的植物纤维素酶5g并放入密闭容器中，再在密闭容器中加入pH4.5的去离子水10Kg并搅拌均匀，控制混合物的温度为40℃，恒温浸泡20小时以上；

1.1.3 超声波处理：将酶处理后的混合物在常温、超声波频率为50KHz条件下波处理30min；

1.1.4 过滤：将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤出滤液，得到1480克滤渣；

1.1.5 提取：过滤后的滤渣用滤渣重量10倍的(合14.8kg)、60℃的去离子水强制回流45分钟，重复提取2次得到提取液；

1.1.6 浓缩：合并步骤1.14的滤液和步骤1.15的提取液，在-0.09Mpa的真空度条件下浓缩，得到5公斤浓缩液，浓缩液中加入浓缩液重量1％倍的壳聚糖，搅拌，絮凝，使混合物在50℃条件下避光静置50min，然后过滤、洗涤，得到4.9公斤滤液，滤液用滤液重量2％倍的活性炭脱色，得到脱色后的浓缩液；

1.1.7 纯化：脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附，吸附后用体积百分含量为25％的乙醇水洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品，将粗品用4倍去离子水重结晶得到绿原酸成品，得到24.1克绿原酸成品，绿原酸成品的得率为2.41％，含量95.1％。

实施例2

生产工艺如实施例1所述，所不同的是用新鲜的杜仲叶，获得绿原酸的含量为90.5％。

实施例3

生产工艺如实例1所述，所不同的是纤维素酶为1％，获得绿原酸是含量为92.7％。

实施例4

生产工艺如实例3所述，所不同的是纤维素酶解温度为50℃，获得绿原酸是含量为94.2％。

实施例5

生产工艺如实例1所述，所不同的是超声波处理时间是1小时，获得绿原酸是含量为90.1％。

实施例6

生产工艺如实例3所述，所不同的是壳聚糖絮凝是在室温下进行，获得绿原酸是含量为91.7％。

实施例7

生产工艺如实例1所述，所不同的是用40％的乙醇溶液进行NKA-9大孔树脂柱洗脱剂，获得绿原酸是含量为93.7％。

实施例8

1.1.1 粉碎：采集7～10月份的杜仲叶，烘干，干燥后的含水量≤10％，将干燥的杜仲叶粉碎，过80目筛，得到1000g杜仲叶粉末；

1.1.2 酶处理：在杜仲叶粉末中添加活力为500～1000U/g的植物纤维素酶4g并放入密闭容器中，再在密闭容器中加入8Kg的pH4的去离子水并搅拌均匀，控制混合物的温度为35℃，恒温浸泡20小时以上；

1.1.3 超声波处理：将酶处理后的混合物在常温、超声波频率为20KHz条件下波处理20min；

1.1.4 过滤：将超声波处理后的混合物用板框压滤机在0.1Mpa的压力范围内压滤出滤液，得到1620克滤渣；

1.1.5 提取：过滤后的滤渣用滤渣重量8倍的(合计12.96公斤)、50℃的去离子水强制回流1小时，重复提取1次得到提取液；

1.1.6 浓缩：合并步骤1.14的滤液和步骤1.15的提取液，在-0.085Mpa的真空度条件下浓缩，得到4千克浓缩液，浓缩液中加入浓缩液重量0.5％倍的壳聚糖，搅拌，絮凝，使混合物在40℃条件下避光静置40min，然后过滤，得到3.9千克滤液，滤液用滤液重量1％倍的活性炭脱色，得到脱色后的浓缩液；

1.1.7 纯化：脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附，吸附后用体积百分含量为20％的乙醇水洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品，将粗品用2倍去离子水重结晶得到绿原酸成品，得到23.6克绿原酸成品，绿原酸成品的得率为2.36％，纯度90.0％。

实施例9

1.1.1 粉碎：采集7～10月份的杜仲叶，烘干，干燥后的含水量≤10％，将干燥的杜仲叶粉碎，过80目筛，得到1000g杜仲叶粉末；

1.1.2 酶处理：在杜仲叶粉末中添加活力为500～1000U/g的植物纤维素酶6g并放入密闭容器中，再在密闭容器中加入12千克的pH5的去离子水并搅拌均匀，控制混合物的温度为50℃，恒温浸泡20小时以上；

1.1.3 超声波处理：将酶处理后的混合物在常温、超声波频率为100KHz条件下波处理20min；

1.1.4 过滤：将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤出滤液；得到1410克滤渣；

1.1.5 提取：过滤后的滤渣用滤渣重量12倍的(合计16.92kg)、50～80℃的去离子水强制回流1小时，重复提取3次得到提取液；

1.1.6 浓缩：合并步骤1.14的滤液和步骤1.15的提取液，在-0.1Mpa的真空度条件下浓缩，得到7.8千克浓缩液，浓缩液中加入浓缩液重量2％倍的壳聚糖，搅拌，絮凝，使混合物在60℃条件下避光静置60min，然后过滤，得到7.0千克滤液，滤液用滤液重量3％倍的活性炭脱色，得到脱色后的浓缩液；

1.1.7 纯化：脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附，吸附后用体积百分含量为30％的乙醇水洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品，将粗品用6倍去离子水重结晶得到绿原酸成品，得到2.54克绿原酸成品，绿原酸成品的得率为2.54％，纯度96.1％。

通过对杜仲叶主要提取物绿原酸对水产养殖中常见病原菌嗜水气单胞菌体外和体内抑菌实验研究表明，绿原酸对水产养殖中常见的病原菌具有良好的抑菌效果，对嗜水气单胞菌的抑菌效果与抗生素类抗菌药物相当，能够增强机体免疫力，对细菌性疾病具有较强的预防作用。

Claims (2)

1、一种杜仲叶中提取绿原酸的方法，其特征是该方法包括如下步骤：

(1)、粉碎：将新鲜或干燥的杜仲叶粉碎，过80目筛，得到杜仲叶粉末；

(2)、酶处理：在杜仲叶粉末中添加活力为500～1000U/g的植物纤维素酶并放入密闭容器中，植物纤维素酶的添加量为杜仲叶粉末重量的0.4％～0.6％倍，再在密闭容器中加入pH4～5的去离子水并搅拌均匀，去离子水的加入量为杜仲叶粉末重量的8～12倍，控制混合物的温度为35～50℃，恒温浸泡20小时以上；

(3)、超声波处理：将酶处理后的混合物在常温、超声波频率为20～100KHz条件下波处理20～40min；

(4)、过滤：将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤或者用板框压滤机在0.1～0.4Mpa的压力范围内压滤出滤液；

(5)、提取：过滤后的滤渣用滤渣重量8～12倍的、50～80℃的去离子水强制回流0.5～1小时，重复提取1～3次得到提取液；

(6)、浓缩：合并过滤步骤和提取步骤中的提取液，在-0.085～-0.1Mpa的真空度条件下浓缩，浓缩液中加入浓缩液重量0.5％～2％倍的壳聚糖，搅拌，絮凝，使混合物在40～60℃条件下避光静置40～60min，然后过滤，滤液用滤液重量1％～3％倍的活性炭脱色，得到脱色后的浓缩液；

(7)、纯化：脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附，吸附后用体积百分含量为20％～30％的乙醇水洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品，将粗品用2～6倍去离子水重结晶得到绿原酸成品。

2、根据权利要求1所述的一种杜仲叶中提取绿原酸的方法，其特征在于所述提取的绿原酸在鱼病防治物中的应用。