CN103086889B - 一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，属于绿原酸提取技术领域。本发明以金银花叶固体废弃物为原料，经金银花叶原料处理、酶解反应、超声波协同浸提、绿原酸制备的简单工艺而得到产品。本发明方法的原料廉价易得，具有废物利用充分，制备的绿原酸产品提取率和纯度高、且生物活性完备，生产过程中能耗低，生产设备腐蚀小，有机溶剂使用量少，有利于环境保护等特点。本发明可广泛应用于从金银花叶固体废弃物中提取绿原酸、异绿原酸和白果醇等天然产物，有效实现了金银花叶的资源化再利用。
Description
技术领域
本发明属于绿原酸提取技术领域，具体涉及酶催化活化金银花叶提取绿原酸方法。
背景技术
绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，属于苯丙素类化合物，主要存于金银花、杜仲、可可树以及咖啡等植物中。绿原酸作为药物合成的重要原料，对防治心血管系统疾病、糖尿病有显著的疗效，也广泛应用与食品保鲜、化妆品中抗衰老以及预防肥预等方面，在医药及人口健康等领域具有广阔的市场应用前景。但绿原酸本身具有不稳定性，从植物中提取的过程中，高温、强光以及长时间加热等条件可加速绿原酸水解以及分子内酯基迁移，发生绿原酸异构化。因此，研究绿原酸的提取方法，具有可观的经济价值和现实意义。
现有提取绿原酸的方法，如2012年3月28日公开的公开号为CN102391116A的“从金银花叶中提取绿原酸的方法”，公开的方法是：以金银花叶为原料，将金银花叶粉碎后，三次浸泡后得提取液，提取液中加入澄清剂，搅拌后静置10～14h，分离得含绿原酸的上层清液滤液，经大孔树脂吸附、0.5～1倍树脂体积量的纯化水洗脱后，再用pH值为2～3的3倍树脂体积量的食品级乙醇溶液(浓度为45～65％)洗脱得含绿原酸的洗脱液，于50℃浓缩、真空干燥后得绿原酸粉末，其绿原酸纯度达35～95％。该方法的主要缺点是：(1)该方法采用直接浸泡金银花叶、洗脱浸泡液后获得绿原酸，因绿原酸在25℃时水中溶解度约为4％，常温下金银花叶中绿原酸溶于浸泡液的量少，导致金银花叶中绿原酸资源浪费，直接影响产品的提取量，从而降低金银花叶中绿原酸资源开发的经济价值；(2)该方法先后经三次浸泡，纯化水、乙醇两次洗脱，生产步骤共7步，所得绿原酸提取纯度介于35～95％之间，生产过程繁琐增加生产工序和设备，从而增加生产成本，繁多的步骤导致绿原酸提取、纯化工艺的不稳定，影响绿原酸产品品质，直接影响绿原酸产品经济开发价值；(3)生产过程中，繁多的步骤中仅静置需10～14h，且采用的洗脱剂乙醇为食品级，进一步增加了生产能耗和成本。
发明内容
本发明的目的是，针对现有提取绿原酸方法的不足，提供一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，具有提取条件常温(压)、操作步骤少且简单、生产能耗和成本低、绿原酸溶浸充分且稳定、提取率和纯度高、有机溶剂使用量减少等特点。
本发明的机理是：本发明以金银花叶固体废弃物为原料，选用工程酶(纤维素酶和木质素酶)作为催化活化木质纤维素的活化剂，通过木质素酶降解金银花叶中桎梏纤维素的木质素，增加纤维素酶对纤维素的水解作用，有效打断阻碍绿原酸溶出的金银花叶植物纤维组织，提高植物组织通透性，减小绿原酸传质阻力，增大绿原酸提取率。采用酶活化处理金银花叶植物组织，避免高温、强光及长时间加热等条件破坏绿原酸稳定性，提高绿原酸提取率及产品品质；同时，减少预处理金银花叶的化学活化剂酸、碱以及浸提绿原酸的有机溶剂的使用量，减少了生产安全隐患，避免酸碱使用加大对环境造成的二次污染，有利于环境保护，实现金银花叶的资源化再利用。
实现发明目的的技术方案是：一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，以金银花叶固体废物为原料，经原料处理、酶解反应、超声波协同浸提、绿原酸制备的简单工艺而得到产品。所述方法的具体步骤如下：
(1)原料处理
以金银花叶固体废弃物为原料。先将原料用水清洗干净后，放置于烘箱中，先在85～110℃的烘箱中烘30～90min，再经粉碎机粉碎后、并过20～160目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料(即为处理后的原料)。
(2)酶解反应
第(1)步骤完成后，先按照第(1)步处理后的原料的质量(g)∶酶的质量(g)∶水的体积(ml)之比为1∶0.05～0.3∶5～30的比例，在第(1)步预处理后的原料中，加入酶及水，搅拌均匀后，再用硫酸或氢氧化钠溶液调节体系的pH值为3～8，然后将调节pH值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度为20～65℃下进行酶解活化2～14h，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。收集的滤渣为金银花叶酶解活化基料，收集的滤液处理达标后排放。所述的酶为纤维素酶或木质素酶或纤维素酶和木质素酶复配酶，所述的复配酶为木质素酶∶纤维素酶的质量比为1∶0.5～3。
(3)超声波协同浸提
第(2)步骤完成后，先将第(2)步收集的滤渣，即金银花叶酶解活化基料转入到浸提容器中，再按照第(1)步骤预处理后原料的质量(g)∶乙醇溶液的体积(ml)之比为1∶8～15的比例，在浸提容器中加入乙醇溶液，搅拌混合均匀，并在超声波功率40～200W、温度25～55℃条件下进行超声波处理10～45min后，用抽滤机进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。对收集的滤渣作为制备吸附材料的原料；将收集的滤液转入离心机中，在离心转速为2500～4000r/min条件下，进行离心分离5～15min后，分别收集离心清液(即为含绿原酸的提取液)和离心渣，对收集的离心渣作为制备吸附材料的原料。
(4)绿原酸产品制备
第(3)步骤完成后，先将第(3)步收集的离心清液，即含绿原酸的提取液，通过分光光度法测定绿原酸的浓度，即检测波长325～335nm，乙醇溶液体积浓度为50～65％的条件下，测定第(3)步收集的离心清液的绿原酸的溶液。再将第(3)步收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.1～0.6Mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩至粘稠状得绿原酸粗制品。然后，按照绿原酸粗制品的质量(g)∶乙醇的体积(ml)之比为1∶2～10的比例，在浸提容器中加入绿原酸粗品和乙醇溶液，混合溶解均匀。最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.1～0.6Mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩重复2～4次，制得绿原酸产品。绿原酸提取率高达83.0～97.2％，纯度高达84.0～92.6％。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
(1)本发明选用纤维素酶、木质素酶协同作为催化活化木质纤维素的活化剂，提高绿原酸的提取率。再经复配酶催化降解金银花叶木质纤维素，能提高金银花叶内部通透性，减少绿原酸溶出传质阻力，促使绿原酸浸取充分，因此，本发明方法所得绿原酸提取率高达97.0％。
(2)本发明采用的固体废弃物金银花叶经酶(纤维素酶或木质素或纤维素酶和木质素酶复配酶)催化活化条件在45℃最佳，酶解时间仅为11小时，操作简单，反应条件温和，避免高温、强光以及长时间加热等条件对绿原酸的影响，保障绿原酸提取能效与产品品质，又降低生产能耗；用酶制剂代替传统化学活化剂预处理金银花叶提取绿原酸，且有机溶剂为乙醇，减少了生产过程中环境治理成本，提高生产安全性能，进一步降低生产成本。
(3)本发明方法的原料廉价易得，生产成本低，操作简单，方法绿色环保。本发明方法可广泛应用于固体金银花叶为原料提制绿原酸，也可广泛应用于从金银花叶中异绿原酸、咖啡酸和白果醇等的提取。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例1
一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法的具体步骤如下：
(1)原料预处理
将金银花叶洗净，晾干后，放置于烘箱中，在100℃的烘箱中烘60min后取出，经粉碎机粉碎后过60目的分子筛筛分，得到粒径小于60目的金银花叶，用塑料袋分装，备用。
(2)酶解反应
第(1)步完成后，先按照第(1)步预处理后的金银花叶固体废弃物的质量∶酶的质量∶水的体积比为1∶0.1∶25的比例。所述酶为木质素酶∶纤维素酶质量比为1∶2。在第(1)步预处理的原料中，加入复配酶及水，搅拌均匀后，再用硫酸溶液调节体系的pH值为4，然后将调节pH值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度45℃下进行酶解活化11h后，用抽滤泵抽滤，分别收集滤液和滤渣。收集的滤渣即为金银花叶酶解活化基料，收集的滤液处理达标后排放。
(3)超声波协同浸提
第(2)步骤完成后，先将第(2)步所得金银花叶酶解活化基料转入250ml的浸提容器中，再按照第(1)步预处理后的金银花叶固体废弃物的质量∶乙醇溶液体积之比为1∶12的比例，在浸提容器中加入乙醇溶液，搅拌混合均匀，并在超声波功率100W、温度30℃条件下超声30min后，用抽滤机进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。对滤渣收集后作为制备吸附材料的原料；将滤液转入离心管中，在离心转速为3000r/min条件下，进行离心分离10min后，分别收集上层离心清液和离心渣。收集的上层离心清液，即得含绿原酸的提取液；对收集的离心渣作为制备吸附材料的原料。
(4)绿原酸产品制备
第(3)步骤完成后，先将第(3)步所得含绿原酸的提取液取1ml，通过分光光度计测定绿原酸的浓度。检测波长为329nm，乙醇溶液体积溶度为62.5％的条件下，测定第(3)步收集的离心清液的绿原酸的溶液。再将第(3)步收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.2Mpa、温度为50℃下，进行减压浓缩至粘稠状得绿原酸粗制品。然后按照绿原酸粗制品的质量∶乙醇的体积之比为1∶5的比例，在浸提容器中加入绿原酸粗品和乙醇溶液，混合溶解均匀。最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.2Mpa、温度为50℃下，进行减压浓缩重复3次，制得绿原酸产品。绿原酸提取率高达97.0％，纯度高达92.2％。
实施例2
一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，选用金银花叶目数为160目，烘箱温度为110℃，烘干时间为30min。
第(2)步中，金银花叶固体废弃物的质量∶酶的质量∶水的体积比为1∶0.05∶5，所述酶为木质素酶∶纤维素酶质量比为1∶0.5。采用盐酸溶液调节体系的pH值为8，水浴温度为65℃。酶解活化金银花叶基料2h。
第(3)步中，预处理后的金银花叶固体废弃物的质量∶乙醇溶液体积比为1∶8。超声波功率为40W、超声温度为55℃，超声时间为10min；滤液离心转数为4000r/min，离心时间为5min。
第(4)步中，分光光度计检测波长为325nm，乙醇溶液体积浓度为50％。抽滤真空压强为0.6Mpa、浓缩温度为30℃。绿原酸粗制品的质量∶乙醇的体积之比为1∶2，绿原酸提取率达90.9％，纯度达88.5％。
实施例3
一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，选用金银花叶目数为20目，烘箱温度为85℃，烘干时间为90min。
第(2)步中，预处理后的金银花叶固体废弃物的质量∶酶的质量∶水的体积比为1∶0.3∶30，所述酶为木质素酶∶纤维素酶质量比为1∶3。采用盐酸溶液调节体系的pH值为3，水浴温度为20℃。酶解活化金银花叶基料14h。
第(3)步中，金银花叶酶解活化基料的质量∶乙醇溶液的体积比为1∶15。超声波功率为200W、超声温度为25℃，超声时间为45min；滤液离心转数为2500r/min，离心时间为15min。
第(4)步中，分光光度计检测波长为335nm，乙醇溶液体积浓度为65％。抽滤真空压强为0.1Mpa、浓缩温度为60℃。绿原酸粗制品的质量∶乙醇的体积之比为1∶10，绿原酸提取率达93.2％，纯度达91.0％。
实施例4
一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，同实施例1，其中：
第(2)步中，酶为纤维素酶，采用盐酸溶液调节体系的pH值为6，酶解水浴温度为35℃，酶解时间为12h。
第(3)步中，金银花叶酶解活化基料的质量∶乙醇溶液的体积比为1∶15。
第(4)步中，乙醇溶液体积浓度为50％；绿原酸提取率达87.6％，纯度达86.2％。
实施例5
一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，同实施例1，其中：
第(2)步中，复配酶改为木质素酶，预处理后的金银花叶固体废弃物的质量∶木质素酶的质量∶水的体积比为1∶0.1∶25，采用盐酸溶液调节体系的pH值为6，酶解水浴温度为35℃，酶解时间为12h。
第(3)步中，金银花叶酶解活化基料的质量∶乙醇溶液的体积比为1∶15。
第(4)步中，乙醇溶液体积浓度为50％；绿原酸提取率达83.2％，纯度达84.5％。
实验结果
1、不同条件提取并制备绿原酸的实验结果如下：
表1-1不同酶比例对绿原酸提取的影响
表1-2复配酶不同酶解时间对绿原酸提取的影响
表1-3用实施例1、4、5、6的方法提取绿原酸比较
表1-4采用实施例1的方法提制产品与化学回流方法的比较
从上述实验知：本发明采用酶解活化处理金银花叶固体废弃物制备活性炭，当金银花叶质量比为1∶0.1的酶(木质素酶与纤维素酶复配比为1∶2)，加入水体积比为1∶25，在水浴近室温条件下45℃，酶解时间为11h，经乙醇提取剂协同超声处理可制得绿原酸产品。其中金银花叶酶解活化基料质量(g)∶乙醇溶液体积(ml)之比为1∶12，超声波功率为100W、超声温度为30℃，超声浸提时间为30min。该方法绿原酸溶出充分，其提取率高达97.0％，明显高于传统化学回流提取方法想(提取率为79.16％)；且酶代替酸碱活化剂，制备条件温和，操作简单，绿原酸产品提取率和纯度高，且生物活性完备；本发明方法的原料廉价易得，操作简单，生产过程中酸碱及有机溶剂的使用量减少，避免对生产设备的腐蚀以及对环境造成的二次污染，有利于环境保护，降低生产成本。
Claims (2)
1.一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：
(1)原料预处理
以金银花叶固体废弃物为原料，先将原料用水清洗干净后，放置于烘箱中，先在85～110℃的烘箱中烘30～90min，再经粉碎机粉碎后、并过20～160目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料，即为预处理后的金银花叶固体废弃物；
(2)酶解反应
第(1)步骤完成后，先按照第(1)步处理后的原料的质量∶酶的质量∶水的体积之比为1g∶0.05～0.3g∶5～30ml的比例，所述的酶为纤维素酶或木质素酶或纤维素酶和木质素酶复配酶，所述的复配酶为木质素酶∶纤维素酶的质量比为1g∶0.5～3g，在第(1)步预处理后的原料中，加入酶及水，搅拌均匀后，再用硫酸或氢氧化钠溶液调节体系的pH值为3～8，然后将调节pH值后的混合液放置于摇床中，在水浴温度为20～65℃下进行酶解活化2～14h，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和滤渣，收集的滤渣为金银花叶酶解活化基料；滤液处理达标后排放；
(3)超声波处理
第(2)步骤完成后，先将第(2)步收集的滤渣，即金银花叶酶解活化基料转入到浸提容器中，再按照第(1)步骤预处理后的金银花叶固体废弃物的质量∶乙醇溶液的体积之比为1g∶8～15ml的比例，在浸提容器中加入乙醇溶液，搅拌混合均匀，并在超声波功率40～200W、温度25～55℃条件下进行超声波处理10～45min后，用抽滤机进行抽滤，分别收集滤液和滤渣，对收集的滤渣作为制备吸附材料的原料，将收集的滤液转入离心机中，在离心转速为2500～4000r/min条件下，进行离心分离5～15min后，分别收集离心清液和离心渣，离心清液即为含绿原酸的提取液，对收集的离心渣作为制备吸附材料的原料；
(4)绿原酸产品制备
第(3)步骤完成后，先将第(3)步收集的离心清液，即含绿原酸的提取液通过分光光度法测定绿原酸的浓度，检测波长为325～335nm、乙醇溶液体积溶度为50～65％的条件下，测定第(3)步收集的离心清液中绿原酸的浓度，再将第(3)步收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.1～0.6Mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩至粘稠状得绿原酸粗制品，然后，按照绿原酸粗制品的质量∶乙醇溶液的体积之比为1g∶2～10ml的比例，在浸提容器中加入绿原酸粗品和乙醇溶液，混合溶解均匀，最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.1～0.6Mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩重复2～4次，制得绿原酸产品，绿原酸提取率达83.0～97.2％，纯度达84.0％～92.6％。
2.根据权利要求1所述的酶催化活化金银花叶提取绿原酸方法，其特征在于：
第(1)步中，金银花叶目数为60目，烘箱的温度为100℃，烘干时间为60min；
第(2)步中，按照第(1)步预处理后的金银花叶固体废弃物原料的质量∶酶的质量∶水的体积比为1g∶0.1g∶25ml，所述的酶为纤维素酶和木质素酶的复配酶，所述复配酶为木质素酶∶纤维素酶的质量比为1g∶2g，用硫酸调节体系的pH值为4，摇床的水浴温度为45℃，酶解活化时间为11h；
第(3)步中，预处理后的金银花叶的质量∶乙醇溶液体积比为1g∶12ml，超声波功率为100W、超声温度为30℃，超声时间为30min；滤液离心转速为3000r/min，离心时间为10min；
第(4)步中，分光光度计检测波长为329nm，乙醇溶液浓度为62.5％，绿原酸粗制品的质量∶乙醇的体积之比为1g∶5ml，抽滤真空压强为0.2Mpa、浓缩温度为50℃，绿原酸提取率达97.0％，纯度达92.2％。
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