发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从金银花中提取高纯度绿原酸的方法,以解决目前绿原酸提取物在去杂纯化过程中因沉淀量大而导致的过滤困难,提高产品的纯度和获得率。
其技术方案是:一种从金银花中提取高纯度绿原酸的方法,是将金银花物料用低温超音速气流粉碎,得到细胞级金银花微粉;经酶化,超声波处理,水提过滤,得到绿原酸初液,再经絮凝,脱色、纯化、浓缩干燥,即得高纯度绿原酸。
按照本发明提供的技术方案,所述从金银花中提取绿原酸的方法包括如下步骤:
(1)粉碎:将新鲜或干燥的金银花物料放入不锈钢材质的密闭容器中,向其通液氮冷冻,使金银花物料的温度降至-196℃呈玻璃脆化状态;再向密闭容器中通入超音速氮气气流,使低温的金银花物料在超音速气流冲击和摩擦下迅速粉碎,得到细胞级金银花微粉;
(2)酶处理:在金银花微粉中加入pH5.5~6的去离子水并搅拌均匀,浸泡1小时,去离子水的加入量为金银花微粉重量的10~15倍;再向浸泡液中添加外切葡聚糖酶(简称Cex)并转放入密闭容器中,再搅拌均匀;外切葡聚糖酶的添加量为金银花微粉重量的0.2%~0.3%倍,在该密闭容器中控制混合物的温度为25℃,恒温浸泡10小时以上;
(3)超声波处理:将酶处理后的混合物在25℃常温、超声波频率为60~100KHz条件下波处理30min;
(4)过滤:将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤或者用板框压滤机在0.5~0.7Mpa的压力范围内压滤出滤液;
(5)提取:过滤后的滤渣用滤渣重量8~12倍的、30~40℃的去离子水强制回流1小时,重复提取3次得到提取液;
(6)浓缩:合并步骤(4)的滤液和步骤(5)的提取液得绿原酸初液,绿原酸初液在0.05Mpa的真空度条件下浓缩,浓缩液中加入浓缩液重量3%倍的壳聚糖,搅拌,絮凝;使混合物严格控制在在25℃条件下避光静置30min;然后过滤,滤液用滤液重量1%~3%倍的活性炭脱色,得到脱色后的浓缩液;
(7)纯化:脱色后的浓缩液用强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附,吸附后用体积百分含量为20%~30%的乙醇水洗脱,收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸的含量为95.8~98%的高纯度绿原酸成品。
上述壳聚糖,英文名称Chitosan,是甲壳质经脱乙酰反应后的产品,由于壳聚糖和甲壳质具有高化学反应活性和絮凝性,本发明就是利用壳聚糖具有优良的生物相容性,吸水溶胀性和良好的温敏性能,充当从细胞分离的绿原酸的载体,并固定酶化,产生絮凝,解决了目前绿原酸提取物在去杂纯化过程中因沉淀量大而导致的过滤困难的技术问题。
本发明对金银花物料进行超低温可以粉碎常温无法粉碎的特质;得到比常温粉碎更细的粉末;得到已打破细胞壁的金银花物料粉末,不氧化,粒度分布均匀,破壁率可达95%;并可防止有效待提取成分由于粉碎发热而变质;在粉碎过程中不产生局部过热现象,甚至可在低温或深低温状态下进行,粉碎速度快.因而能最大限度地保留金银花粉体中的生物活性成分;生产过程全密闭,没有粉尘益出,符合GMP要求,金银花物料无损耗。本发明通过超低温粉碎技术得到已打破细胞壁的金银花物料粉末,有效待提取成分直接暴露出来,酶处理的浸泡过程中,使有效成分的浸润溶出更迅速,完全,减少去离子水的消耗,有利于提取有效成分,提高浸提效率。
此外,本发明在酶处理工序中先加入pH5.5~6的去离子水浸泡,对含纤维素物料的金银花微粉有很大影响;经pH5.5~6的去离子水预处理后,金银花微粉中纤维素在弱酸性环境中明显得到润胀,纤维素结晶指数降低,纤维素结晶区受到破坏;绿原酸成分已经部分析出,再经外切葡聚糖酶处理后,纤维素结晶指数有所增强,在经超声波的洗涤作用处理,绿原酸从纤维素结晶区中得到完全分离。用活性炭脱色,浓缩液用强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附属于成熟的生物制药除杂技术,应用于本工艺中,能保证本发明产品的纯度。
据上所述,本发明的技术效果是:本发明的方法具有工艺先进、操作简便、过滤容易、成本低、无有害溶剂、纯度高、得率高,适用于工业化大批量生产等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种从金银花中提取高纯度绿原酸的方法,包括如下步骤:
(1)粉碎:采集7~10月份的金银花,烘干,干燥后的含水量≤10%,将金银花物料放入不锈钢材质的密闭容器中,向其通液氮冷冻,使金银花物料的温度降至-196℃呈玻璃脆化状态;再向密闭容器中通入超音速氮气气流,使低温的金银花物料在超音速气流冲击和摩擦下迅速粉碎,得到细胞级金银花微粉;
(2)酶处理:在金银花微粉中加入pH=5.5的去离子水并搅拌均匀,浸泡1小时,去离子水的加入量为金银花微粉重量的15倍;再向浸泡液中添加外切葡聚糖酶并转放入密闭容器中,再搅拌均匀;外切葡聚糖酶的添加量为金银花微粉重量的0.2%倍,在该密闭容器中控制混合物的温度为25℃,恒温浸泡10小时以上;
(3)超声波处理:将酶处理后的混合物在25℃常温、超声波频率为60~100KHz条件下波处理30min;
(4)过滤:将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤或者用板框压滤机在0.7Mpa的压力范围内压滤出滤液;
(5)提取:过滤后的滤渣用滤渣重量8倍的、40℃的去离子水强制回流1小时,重复提取3次得到提取液;
(6)浓缩:合并步骤(4)的滤液和步骤(5)的提取液得绿原酸初液,绿原酸初液在0.05Mpa的真空度条件下浓缩,浓缩液中加入浓缩液重量3%倍的壳聚糖,搅拌,絮凝;使混合物严格控制在在25℃条件下避光静置30min;然后过滤,滤液用滤液重量1%倍的活性炭脱色,得到脱色后的浓缩液;
(7)纯化:脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附,吸附后用体积百分含量为30%的乙醇水洗脱,收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品,将粗品用2倍去离子水重结晶得到绿原酸成品,得到绿原酸成品,绿原酸成品含量95.8%。
实施例2
一种从金银花中提取高纯度绿原酸的方法,包括如下步骤:
(1)粉碎:采集7~10月份的金银花,烘干,干燥后的含水量≤10%,将金银花物料放入不锈钢材质的密闭容器中,向其通液氮冷冻,使金银花物料的温度降至-196℃呈玻璃脆化状态;再向密闭容器中通入超音速氮气气流,使低温的金银花物料在超音速气流冲击和摩擦下迅速粉碎,得到细胞级金银花微粉;
(2)酶处理:在金银花微粉中加入pH=5.8的去离子水并搅拌均匀,浸泡1小时,去离子水的加入量为金银花微粉重量的10倍;再向浸泡液中添加外切葡聚糖酶并转放入密闭容器中,再搅拌均匀;外切葡聚糖酶的添加量为金银花微粉重量的0.25%倍,在该密闭容器中控制混合物的温度为25℃,恒温浸泡10小时以上;
(3)超声波处理:将酶处理后的混合物在25℃常温、超声波频率为60~100KHz条件下波处理30min;
(4)过滤:将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤或者用板框压滤机在0.6Mpa的压力范围内压滤出滤液;
(5)提取:过滤后的滤渣用滤渣重量12倍的、30℃的去离子水强制回流1小时,重复提取3次得到提取液;
(6)浓缩:合并步骤(4)的滤液和步骤(5)的提取液得绿原酸初液,绿原酸初液在0.05Mpa的真空度条件下浓缩,浓缩液中加入浓缩液重量3%倍的壳聚糖,搅拌,絮凝;使混合物严格控制在在25℃条件下避光静置30min;然后过滤,滤液用滤液重量2%倍的活性炭脱色,得到脱色后的浓缩液;
(7)纯化:脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附,吸附后用体积百分含量为25%的乙醇水洗脱,收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品,将粗品用3倍去离子水重结晶得到绿原酸成品,得到绿原酸成品,绿原酸成品含量97%。
实施例3
一种从金银花中提取高纯度绿原酸的方法,包括如下步骤:
(1)粉碎:采集7~10月份的金银花,烘干,干燥后的含水量≤10%,将金银花物料放入不锈钢材质的密闭容器中,向其通液氮冷冻,使金银花物料的温度降至-196℃呈玻璃脆化状态;再向密闭容器中通入超音速氮气气流,使低温的金银花物料在超音速气流冲击和摩擦下迅速粉碎,得到细胞级金银花微粉;
(2)酶处理:在金银花微粉中加入pH=6的去离子水并搅拌均匀,浸泡1小时,去离子水的加入量为金银花微粉重量的12倍;再向浸泡液中添加外切葡聚糖酶并转放入密闭容器中,再搅拌均匀;外切葡聚糖酶的添加量为金银花微粉重量的0.3%倍,在该密闭容器中控制混合物的温度为25℃,恒温浸泡10小时以上;
(3)超声波处理:将酶处理后的混合物在25℃常温、超声波频率为60~100KHz条件下波处理30min;
(4)过滤:将超声波处理后的混合物用高速离心机过滤或者用板框压滤机在0.5Mpa的压力范围内压滤出滤液;
(5)提取:过滤后的滤渣用滤渣重量10倍的、35℃的去离子水强制回流1小时,重复提取3次得到提取液;
(6)浓缩:合并步骤(4)的滤液和步骤(5)的提取液得绿原酸初液,绿原酸初液在0.05Mpa的真空度条件下浓缩,浓缩液中加入浓缩液重量3%倍的壳聚糖,搅拌,絮凝;使混合物严格控制在在25℃条件下避光静置30min;然后过滤,滤液用滤液重量3%倍的活性炭脱色,得到脱色后的浓缩液;
(7)纯化:脱色后的浓缩液上强极性大孔型大孔树脂柱进行饱和吸附,吸附后用体积百分含量为20%的乙醇水洗脱,收集洗脱液浓缩、干燥后制得绿原酸粗品,将粗品用4倍去离子水重结晶得到绿原酸成品,得到绿原酸成品,绿原酸成品含量98%。