CN1746149A - 一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，包括如下步骤：醇沉步骤：将金银花粗提物用去离子水溶解、充分搅拌，配制成金银花粗提物的水溶液，再加入乙醇进行醇沉，再过滤；逆流萃取步骤：将过滤液加热蒸去乙醇，剩余溶液将pH值调节至1～4，然后用含乙酸乙酯的混合溶剂进行多级逆流萃取；浓缩步骤：合并萃取液并浓缩回收乙酸乙酯，得到浓缩液S1；配制水相步骤：将浓缩液S1加水配制成水相；柱析步骤：将上述水相流过层析柱，随后用洗脱液进行洗脱，分段收集解吸液；结晶干燥步骤：将分段收集到的解吸液浓缩、结晶、干燥后得到绿原酸含量50～92％的产品。本发明兼顾产品收率和纯度，生产成本低，适宜于规模化生产。

Description

一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法

【技术领域】

本发明涉及一种绿原酸的制备方法，尤其是涉及一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法。

【背景技术】

金银花是忍冬科忍冬植物的干燥花蕾，是常用中药材。绿原酸是金银花中重要的生理活性物质，具有清热解毒、抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压血脂、清除自由基等显著药理活性，可应用于食品工业、化妆品工业、医药工业中。随着中药现代化进程的加快，制药厂家对金银花等的提取物要求越来越高，特别是欧、美国家制药企业要求中药提取物中的单体成份越纯越好，以便定性定量分析、使用。比如发明名称为“高纯度绿原酸制剂”的中国发明专利申请第200410022438.6号涉及的就是以含量大于95％的绿原酸为原料，制成用于临床的各种剂型的药品。

目前生产医用或化学纯绿原酸的厂家非常少见。纯品绿原酸主要依靠进口，价格十分昂贵。高纯度的绿原酸产品上市量很少，远不能满足市场需求和出口需要，主要瓶颈就是制取工艺落后，缺乏大规模生产高纯度绿原酸的综合技术。

中国是金银花种植大国，然而以金银花为原料加工制成的市售产品除复方制剂外，多为浸膏或粗粉，其中绿原酸含量较低，仅为15％～30％左右(紫外分光光度计测定)，影响了产品的应用范围和附加值。美、日、德等国绿原酸多是从咖啡豆中提取，其产品纯度可达90％至99％以上。根据相关的美国专利US4872987、日本专利JP4145049和JP4145048所揭露的内容，国外制备纯品绿原酸均是在粗提的基础上，进一步采用现代先进分离手段，如制备色谱、离子交换柱分离等进行精提。

从金银花中提取绿原酸，常用方法有石硫醇法、异戊醇法、铅沉法、醇沉法等。对绿原酸进行提纯工艺研究的有关报道有：中国发明专利申请第99115374.X号提供了一种以杜仲叶为原料分离高纯绿原酸的工艺，由于杜仲叶与金银花中组分存在有较大差异，该工艺不适宜于从金银花中提取绿原酸。而中国发明专利第ZL99114969.6号则揭示了利用超临界萃取可从杜仲叶中提取含量大于90％的绿原酸，但是该方法仅限于实验室应用，无法规模化生产。中国发明专利申请第97109109.9号揭示了将金银花加酸性乙醇浸泡回流提取绿原酸，但是该方法的收率为5～8％，无法制得高纯度绿原酸产品。而中国发明专利第ZL02133448.X号公布了利用大孔树脂直接吸附分离金银花提取液，可得到纯度40％的绿原酸。中国发明专利第ZL01144170.4号提供的方法是：对金银花进行稀醇回流提取、絮凝除杂，随后采用大孔树脂法或酸性乙酸乙酯萃取法纯化精制绿原酸。该方法较普通酸醇法制得的绿原酸纯度有较大提高，但仍难以制取高纯度的绿原酸。

采用单一提纯方法制备的绿原酸中仍含有多种杂质，有多糖、蛋白质、无机盐以及绿原酸的异构体等，存在产品纯度低、处理成本过高的问题，难以实现工业生产。截至目前，利用粗品绿原酸进行活性萃取、柱层析技术综合处理精制，得到高纯度绿原酸产品的工业生产工艺在国内、外尚未见到报道。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是：提供一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法，其能提高产品的纯度、收率和生产规模，降低提取分离成本。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：提供一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，包括如下步骤：

A)醇沉步骤：将金银花粗提物用去离子水溶解，充分搅拌后，配制成金银花粗提物的水溶液，然后加入乙醇进行醇沉，醇沉后过滤；

B)逆流萃取步骤：将得到的过滤液加热蒸去乙醇，剩余溶液用酸将pH值调节至1～4范围内，然后用混合溶剂进行多级逆流萃取，混合溶剂包括第一组分及第二组分，其中第一组分为乙酸乙酯，第二组分为低碳的醇、烷烃、酮中任何一种或两种物质；

C)浓缩步骤：合并萃取液并浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩至釜底残留的固含物与乙酸乙酯之比为1g∶5～20mL，得到浓缩液S1；

D)配制水相步骤：将浓缩液S1加水静置1～8小时、在4～25℃条件下分出水相，浓缩液S1与加水量的体积比为1∶1～3.5；

E)柱析步骤：将上述水相流过装有吸附材料的层析柱，随后用不同浓度的洗脱液进行洗脱，分段收集解吸液，洗脱液为低碳的醇、酮、酸中的一种物质配制而成的水溶液，浓度为10～90％；

F)结晶干燥步骤：将分段收集到的上述解吸液浓缩、结晶、干燥后得到绿原酸含量50～92％的产品。

上述技术方案的进一步改进在于：醇沉步骤中，去离子水的加入量与金银花粗提物固体粉末的质量比为3～1∶1，溶解温度25～60℃。

上述技术方案的进一步改进在于：醇沉步骤中，乙醇加入量与去离子水溶液的体积比为2.5～6.5∶1，醇沉静置时间为1～8小时，醇沉温度为4～25℃。

上述技术方案的进一步改进在于：逆流萃取步骤中，蒸去乙醇是在40～80℃，10～400mmHg压力条件下进行，调节PH值所采用的酸为硫酸、盐酸、磷酸、草酸中的任何一种，多级逆流萃取的级数为5～20级。

上述技术方案的进一步改进在于：逆流萃取步骤中，混合溶剂的用量为过滤液体积的1～10倍，混合溶剂的第一组分与第二组分的混合比为10∶1～10，混合溶剂的第二组分为正己烷、异丙醇、丙酮中任何一种或两种物质，且混合溶剂的组成为乙酸乙酯∶正己烷∶异丙醇∶丙酮＝10∶0～5∶0～5∶0～5。

上述技术方案的进一步改进在于：浓缩步骤中，在50～80℃，10～400mmHg压力的条件下进行浓缩。

上述技术方案的进一步改进在于：层析柱中所装填的材料为NKA型、D130型大孔树脂或具有离子交换功能的D280型、D390型树脂中的一种，洗脱液为乙醇、甲醇、丙酮、草酸中的一种所配制而成的水溶液。

此外，本发明还提供一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其包括如下步骤：

A)醇沉步骤：将金银花粗提物用去离子水溶解，充分搅拌后，配制成金银花粗提物的水溶液，然后加入乙醇进行醇沉，醇沉后过滤；

B)逆流萃取步骤：将得到的过滤液加热蒸去乙醇，剩余溶液用酸将pH值调节至1～4范围内，然后用混合溶剂进行多级逆流萃取，混合溶剂包括第一组分及第二组分，其中第一组分为乙酸乙酯，第二组分为低碳的醇、烷烃、酮中任何一种或两种物质；

C)浓缩步骤：合并萃取液，在50～80℃，10～400mmHg的压力下进行浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩至乙酸乙酯被全部回收，得到中间产物S2；

D)干燥步骤，将中间产物S2经冷冻干燥后得到绿原酸含量30～70％的产品。

由于采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明利用醇沉除去大部分多糖类物质，随后采用混合溶剂进行多级逆流萃取，去除80％～90％的杂质，绿原酸收率不低于75％。萃取后的提取物中仅富含绿原酸等酚酸类物质，还可利用颗粒状具有选择性功能基团的吸附材料进行柱层析，而得到高纯绿原酸(经HPLC检测，含量可达30～90％)。与现有提取技术相比，该方法可兼顾产品收率和纯度，生产成本低，适宜于规模化生产。

【附图说明】

图1是本发明一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法的工艺流程示意图。

图2是本发明一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法的另一种工艺流程示意图。

【具体实施方式】

如图1所示，本发明提供一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法，其对绿原酸粗提物的纯化主要原理包括以下几个方面：

1、醇沉对高分子物质如蛋白质、多糖等的影响非常显著，醇沉极易使这些成分沉淀；

2、利用绿原酸在不同溶剂中溶解性的差异，选择有机溶剂作为萃取剂，利用活性萃取，去除大部分粘胶、无机盐等杂质。

3、选择适当的离子交换剂作为柱填料，选择适当的解吸液，通过吸附、解吸工艺条件的控制进行绿原酸异构体的分离纯化，制得高纯绿原酸。

本发明一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法的工艺流程包括以下几个步骤：

A)醇沉步骤：将金银花粗提物用去离子水溶解，水的加入量与固体粉末的质量比为3～1∶1，溶解温度25～60℃，充分搅拌后，加入乙醇进行醇沉，乙醇加入量与溶液体积比为2.5～6.5∶1，醇沉静置时间为1～8小时，醇沉温度为4～25℃，醇沉后过滤；

B)逆流萃取步骤：上述过滤液在40～80℃，10～400mmHg的压力下蒸去乙醇，剩余溶液用硫酸、盐酸、磷酸、草酸中的任何一种将pH值调节至1～4范围，然后用含乙酸乙酯的混合溶剂进行多级逆流萃取，混合溶剂包括第一组分及第二组分，其中，第一组分为乙酸乙酯，第二组分为低碳的醇、烷烃、酮中任何一种或两种物质，第一组分与第二组分的混合比为10∶1～10，混合溶剂的用量为过滤液体积的1～10倍，多级逆流萃取的级数为5～20级。

C)浓缩步骤：合并萃取液，在50～80℃，10～400mmHg的压力下进行浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩到釜底残留的固含物与乙酸乙酯之比为1g∶5～20mL，得到浓缩液S1。

D)配制水相步骤：将浓缩液S1加水静置1～8小时、4～25℃条件下分出水相，浓缩液S1与加水量的体积比为1∶1～3.5。

E)柱析步骤：将上述水相流过装有吸附材料的层析柱，随后用不同浓度的洗脱液进行洗脱，分段收集流出液。洗脱液为低碳的醇、酮、酸中的一种物质配制而成的水溶液，浓度为10～90％。

F)结晶干燥步骤：分段收集上述解吸液，浓缩，结晶，干燥后得到绿原酸含量50～92％的产品。

上述步骤中，混合溶剂中的第二组分为正己烷、异丙醇、丙酮中任何一种或两种物质，混合溶剂组成为乙酸乙酯∶正己烷∶异丙醇∶丙酮＝10∶0～5∶0～5∶0～5。

层析柱中所装填的材料为NKA型、D130型大孔树脂或具有离子交换功能的D280型、D390型树脂中的一种，洗脱液为乙醇、甲醇、丙酮、草酸中的一种所配制而成的水溶液。

此外，在上述的浓缩步骤中，若将乙酸乙酯全部回收，可得到中间产品S2；将中间产品S2直接进行干燥步骤，经冷冻干燥后即得到绿原酸含量30％～70％的产品。从而不需再进行前述工艺流程中后续的D)、E)、F)步骤，而是采用了如图2所示的工艺流程。

下面通过三个实施例来分别说明本发明一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法的具体实施过程：

实施例一

参见附图，取金银花粗粉100g，加100mL去离子水常温溶解，加入400mL乙醇醇沉，25℃静置4小时后离心过滤，过滤液加浓盐酸调pH值为2.5，用乙酸乙酯与异丙醇的混合溶液(体积比为10∶3)进行8级逆流萃取，萃取相浓缩至80mL，加100mL水转溶至水相，将其通过装有NKA吸附树脂的层析柱，用100mL浓度为10％甲醇洗脱后，再用45％甲醇洗脱，收集650mL解析液，浓缩，结晶，干燥，得到产品5.2g，经HPLC测定，收率为82％，纯度为90.0％。

实施例二

取金银花粗粉50g，加150mL去离子水常温溶解，加入180mL乙醇醇沉，4℃静置12小时后离心过滤，过滤液加6M硫酸调pH值为2.0，用乙酸乙酯与正己烷、丙酮的混合溶液(体积比为10∶1.5∶2)进行12级逆流萃取，萃取相蒸干溶剂，经水转溶至水相，浓缩冷冻干燥，得到产品5.5g，经HPLC测定，收率为86％，纯度为45.0％。

实施例三

取金银花粗粉500g，加入60℃，800mL去离子水溶解，凉至室温后加入1200mL乙醇醇沉，在4℃静置10小时后离心过滤，过滤液滴加草酸调pH值为1.0，用乙酸乙酯与正己烷的混合溶液(体积比为10∶5)进行18级逆流萃取，萃取相浓缩至800mL，加450mL去离子水转溶至水相，将其通过装有D280型吸附树脂的层析柱，用300mL去离子水洗脱后，再用60％乙醇洗脱，收集400mL解析液，浓缩，结晶，干燥，得到产品23.8g，经HPLC测定，收率为94％，纯度为90.6％。

Claims (10)

1、一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，包括如下步骤：

A)醇沉步骤：将金银花粗提物用去离子水溶解，充分搅拌后，配制成金银花粗提物的水溶液，然后加入乙醇进行醇沉，醇沉后过滤；

B)逆流萃取步骤：将得到的过滤液加热蒸去乙醇，剩余溶液用酸将pH值调节至1～4范围内，然后用混合溶剂进行多级逆流萃取，混合溶剂包括第一组分及第二组分，其中第一组分为乙酸乙酯，第二组分为低碳的醇、烷烃、酮中任何一种或两种物质；

C)浓缩步骤：合并萃取液并浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩至釜底残留的固含物与乙酸乙酯之比为1g∶5～20mL，得到浓缩液S1；

D)配制水相步骤：将浓缩液S1加水静置1～8小时、在4～25℃条件下分出水相，浓缩液S1与加水量的体积比为1∶1～3.5；

E)柱析步骤：将上述水相流过装有吸附材料的层析柱，随后用不同浓度的洗脱液进行洗脱，分段收集解吸液，洗脱液为低碳的醇、酮、酸中的一种物质配制而成的水溶液，浓度为10～90％；

F)结晶干燥步骤：将分段收集到的上述解吸液浓缩、结晶、干燥后得到绿原酸含量50～92％的产品。

2、如权利要求1所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：醇沉步骤中，去离子水的加入量与金银花粗提物固体粉末的质量比为3～1∶1，溶解温度25～60℃。

3、如权利要求1或2所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：醇沉步骤中，乙醇加入量与去离子水溶液的体积比为2.5～6.5∶1，醇沉静置时间为1～8小时，醇沉温度为4～25℃。

4、如权利要求1所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：逆流萃取步骤中，蒸去乙醇是在40～80℃，10～400mmHg压力条件下进行，调节PH值所采用的酸为硫酸、盐酸、磷酸、草酸中的任何一种，多级逆流萃取的级数为5～20级。

5、如权利要求1或4所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：逆流萃取步骤中，混合溶剂的用量为过滤液体积的1～10倍，混合溶剂的第一组分与第二组分的混合比为10∶1～10，混合溶剂的第二组分为正己烷、异丙醇、丙酮中任何一种或两种物质，且混合溶剂的组成为乙酸乙酯∶正己烷∶异丙醇∶丙酮＝10∶0～5∶0～5∶0～5。

6、如权利要求1所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：浓缩步骤中，在50～80℃，10～400mmHg压力的条件下进行浓缩。

7、如权利要求1所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：层析柱中所装填的材料为NKA型、D130型大孔树脂或具有离子交换功能的D280型、D390型树脂中的一种，洗脱液为乙醇、甲醇、丙酮、草酸中的一种所配制而成的水溶液。

8、一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其包括如下步骤：

A)醇沉步骤：将金银花粗提物用去离子水溶解，充分搅拌后，配制成金银花粗提物的水溶液，然后加入乙醇进行醇沉，醇沉后过滤；

B)逆流萃取步骤：将得到的过滤液加热蒸去乙醇，剩余溶液用酸将pH值调节至1～4范围内，然后用混合溶剂进行多级逆流萃取，混合溶剂包括第一组分及第二组分，其中第一组分为乙酸乙酯，第二组分为低碳的醇、烷烃、酮中任何一种或两种物质；

C)浓缩步骤：合并萃取液，在50～80℃，10～400mmHg的压力下进行浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩至乙酸乙酯被全部回收，得到中间产物S2；

D)干燥步骤：将中间产物S2经冷冻干燥后得到绿原酸含量30～70％的产品。

9、如权利要求8所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：醇沉步骤中，去离子水的加入量与金银花粗提物固体粉末的质量比为3～1∶1，溶解温度25～60℃。

10、如权利要求8所述的一种由金银花粗提物制备高纯绿原酸的方法，其特征在于：逆流萃取步骤中，蒸去乙醇是在40～80℃，10～400mmHg压力条件下进行，调节PH值所采用的酸为硫酸、盐酸、磷酸、草酸中的任何一种，多级逆流萃取的级数为5～20级。