CN101045719A - 一种高效分离纯化10－去乙酰基巴卡亭ⅲ(10－dabⅲ)的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种高效分离纯化10－去乙酰基巴卡亭III(10－DAB III)的方法公开了一种可获取高纯度10－去乙酰基巴卡亭III的方法，该方法利用四氢呋喃溶解半成品10－去乙酰基巴卡亭III，再放入动态轴向压缩液相制备色谱柱中，采用四氢呋喃、正己烷和甲醇混和溶剂作为洗脱流动相，通过一至两次的分离制备就可以得到的含量纯度达到99％的10－DAB III纯品。该方法高效、成本低、环保，产品回收率高等优点，具有进一步产业化生产的应用价值。

Description

一种高效分离纯化10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10－DABⅢ)的方法

                              技术领域

本发明属于从红豆杉中提取药用物质的技术，特别是对红豆杉中提取的半成品10-去乙酰基巴卡亭III(解写为：10-DAB III)再进行分离纯化成为高纯度精品的方法。

                              背景技术

10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)作为红豆杉树种中主要存在的一个结构单体，可以作为半合成抗肿瘤药物紫杉醇和多西紫杉醇的前体。紫杉醇和多西紫杉醇在临床上已经被用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治疗，其疗效好，毒副作用小，逐步成为抗肿瘤一线药物。随着癌症病人的逐年增多，对紫杉醇和多西紫杉醇的需求日益加剧，对其原料的需求更甚。以往获得紫杉醇都是采用天然红豆杉的木质中提取分离，而用木质提取需要砍伐红豆杉，由于红豆杉树资源的局限性和提取成本偏高等不利因素严重阻碍行业的发展。为了更好的满足市场，目前，半合成获取紫杉醇和多西紫杉醇已经成为大部分制药企业获得原料的首选模式，而半合成最重要的前体物就是10-DAB III，它广泛分布于多种类型的红豆杉枝叶中，枝叶本身就是可再生资源，所以如何高效快捷低成本的从红豆杉枝叶中提取分离出高纯度的10-DAB III中间体成为行业焦点。

目前，针对10-DAB III提取分离的文献和专利有很多，基本上都是采用提取、分离、结晶三个步骤，而真正影响产品得率和纯度的主要还是分离和结晶这两个步骤。常规都采用甲醇或酒精进行浸泡提取，然后萃取浓缩，将初步得到的10-DAB III粗品进行硅胶柱层析分离，最后重结晶得到一定纯度的合格品。通常，各个厂家提取得率都能达到95％左右，而影响纯品10-DAB III最终得率的主要还是分离和结晶步骤。随着市场的竞争和溶剂成本的增加，如何简化分离纯化工艺，快捷的得到高质量的10-DAB III，并尽可能少的利用有机溶剂成为控制成本的主要思路。

中国专利申请号02136678公开了从乙醇提取过的红豆杉枝叶残渣中提取10-DABIII的方法，并采用了正相制备色谱进行分离得到纯品10-DAB III，该分离纯化方法中虽然提到了的制备液相色谱分离过程，但所采用的溶剂体系和梯度洗脱手段在规模化生产中显得工艺复杂，分离效率无法在生产实际中真正提高，且有溶剂消耗大等缺点。因为10-DAB III被提取到一定纯度的情况下，在常规溶剂里的溶解能力降低，该专利中提到的用乙酸乙酯实际不能很好的溶解半成品10-DAB III，因为要产业化利用制备液相色谱进行分离必须要找到更适合的洗脱剂体系。

此外，中国专利公开号CN1473821A公开了一种提取10-DAB III的方法，该项专利里面采用常规的硅胶层析分离提取处理出的半成品10-DAB III，该方法耗费时间，溶剂消耗量大，因为常规硅胶的不可逆吸附，硅胶循环利用率低下，废物排放多，也很容易造成得率的损失。

                              发明内容

本发明的目的是提供一种高效分离纯化半成品10-DAB III，从而得到高纯度的10-DAB III的方法。

该方法利用先进的直径超过100mm的制备液相色谱高效分离系统，在球形硅胶作为固定相的情况下，通过独特的用四氢呋喃溶解和四氢呋喃、正己烷和甲醇混合溶液作为洗脱溶剂体系，进行精确分离含量范围在20％-60％之间的半成品10-DAB III，得到的10-DAB III纯品含量超过99％。本发明首次发现四氢呋喃对10-DAB III独特的溶解性能，并应用到高效制备液相色谱分离中，因为四氢呋喃良好的溶解性能，改善了10-DAB III在制备液相色谱中得分离度和分离峰型，提高了产品得率和纯度，整体溶液需求量大大减少。整体分离过程真正实现了高效、低成本、环保，是产业化的最佳工艺路线。

本发明高效分离制备用的四氢呋喃和正己烷均为分析纯，经过一次重蒸并过滤。所用甲醇因为用量不大，分析纯即可。

所采用的液相分析色谱仪来自北京创新通恒科技有限公司P3000型，分析柱采用kromasil品牌的C18(4.6mm×250mm，5um)，柱温为37℃，流动相条件为乙腈+水(35+65)，流速为1ml/min；制备型液相色谱分离系统由北京创新通恒科技有限公司和成都普思生物科技有限公司联合提供，制备柱为动态轴向压缩装置。选用球形硅胶色谱填料来自日本Fuji公司，颗粒大小为25-40um，孔径大小为70A。所装填的分离柱有效分离长度为35-40公分，分离柱效理论塔板数超过1.5万。

在上述技术方案中采用的原料为从红豆杉枝叶中初步提取得到的半成品10-DAB III，含量范围通常在20％-60％之间，该原料可以自己提取得到，也可以由市场购买。半成品10-DAB III原料主要杂质都是和10-DAB III类似的大极性物质，该含量范围的原料通过本发明方法一次性分离纯化，即可高效快捷的得到纯度超过99％的10-DAB III纯品。

在上述技术方案所提到的高效分离过程主要包括以下几个步骤得以实现：

一、样品溶解：将含量范围在20％-60％之间的半成品10-DAB III原料，用重蒸过的四氢呋喃溶解，1克半成品10-DAB III原料用5-8毫升四氢呋喃溶解。溶解过程采用50℃-60℃的水浴加温搅拌，可以利用超声波加速溶解过程。溶解完成后，选用0.45um孔径的有机相过滤膜进行过滤，过滤好的样品液转移到烧杯里，并搁置在40℃-50℃的水浴里进行保温，获得原料与四氢呋喃溶液作为分离纯化步骤的进样备用。

二、分离纯化：采用四氢呋喃、正己烷和甲醇混合溶液，作为原料四氢呋喃溶液洗脱分离10-DAB III的流动相。流动相的洗脱分离能力与四氢呋喃和正己烷的比例有关。经实验分离洗脱剂中，甲醇、四氢呋喃、正己烷的体积比是，

甲醇           1-----3％

四氢呋喃       20-35％

正己烷         64---78％

通常需要保证10-DAB III在40-60分钟由制备色谱柱里面被洗脱出来。同时，根据室温的不同变化，产品被洗脱出来的时间也有变化，为了保证分离效果，流动相的洗脱极性都需要有所调整，在生产过程中，本发明采用了多种比例的的混合溶液，四氢呋喃占整个溶剂体系的比例为20％-35％不等，甲醇的比例始终控制在总体积的1％-3％左右，而甲醇的存在不影响产品洗脱出峰时间，仅仅是改善分离效果。

分离纯化的具体操作：

1、样品溶解：先用四氢呋喃溶解粗原料10-DAB III，每克重量半成品10-去乙酰基巴卡亭III用5-8毫升四氢呋喃溶液。获得原料与四氢呋喃溶液作为分离纯化步骤的“进样”备用。

2、泵入分离柱：将溶解后的原料四氢呋喃溶液，用高压输液泵泵入高效制备分离柱，进样(原料与四氢呋喃溶液)的量根据色谱柱所填装的介质(如球形硅胶)总量为参照。通常，100克该类型的球形硅胶填料可以泵入含量25％粗原料10-DAB III2-10克，并且还应根据粗原料的20％-35％含量不同而有所调整进样粗原料10-DAB III重量，最终目的都是保证最大效率的分离出合格的10-DAB III纯品。

进样(原料与四氢呋喃溶液)量的多少以进样中实有10-DAB III的重量与球形硅胶的重量之比，根据实验粗原料10-DAB III中实有0.50-2.50克10-DAB III，则配用100克球形硅胶填料，即重量比0.50-2.50％。也就是色谱柱所填装的介质(如球形硅胶)总量为100克，溶解在四氢呋喃中的粗原料10-DAB III中实有0.50-2.50克10-DAB III。

3、分离纯化：采用四氢呋喃、正己烷和甲醇混合溶液作为流动相，分离过程中，用紫外检测器以254nm的波长进行在先跟踪监测，用收集瓶接收不同时间出来的10-DAB III馏份，取样后用液相色谱分析，将合格的馏份合并在一起，用旋转蒸发器在50-60℃的温度下抽真空回收溶剂、获得纯度为99％的10-DAB III产品。回收后的溶剂可以再次调配循环使用，得到的纯度为99％的10-DAB III产品通过真空干燥器进一步烘干即可成最终产品。对于不合格的馏份产品，可以重新富集蒸干，再次制备分离。如此操作过程，保证了产品的有效得率和回收率，循环使用溶剂，节约了成本。

本发明所指的粗原料10-DAB III、10-DAB III原料、半成品10-DAB III、10-去乙酰基巴卡亭III、半成品10-去乙酰基巴卡亭III、10-DAB III为同一概念。

本说明书指的四氢呋喃、正己烷和甲醇三种材料为分折纯，但本发明不限止仅用分折纯。

本发明优越性在于：经多次实验测定，用本四氢呋喃先溶解粗原料10-DAB III，和用四氢呋喃、正己烷和甲醇的混和溶剂作为分离洗脱剂的提纯方法可获得99％纯度的10-DAB III。而现有用甲醇或酒精溶解、乙酸乙酯洗脱剂的提纯方法只能获得最高94-96％纯度的10-DAB III。

本发明的优点：该方法利用四氢呋喃溶解半成品10-去乙酰基巴卡亭III，再放入动态轴向压缩液相制备色谱柱，采用四氢呋喃、正己烷和甲醇混和溶剂作为洗脱流动相，通过一至两次的分离制备就可以得到的含量达到99％的10-DAB III纯品。该方法高效、成本低、环保，产品回收率高等优点，具有进一步产业化生产的应用价值。

在洗脱过程中，利用高效的制备液相色谱分离系统分离10-DAB III，并利用100mm的大规模制备液相柱实现了规模化生产分离，整过分离工艺过程稳定，重现性好，环保、高效，分离总得率高，为使用更大型的制备液相色谱分离10-DAB III收集到充分的数据。

                            附图说明

图一，含量为23％的半成品10-DAB III高效分离制备液相色谱图；

图二，含量为53％的半成品10-DAB III高效分离制备液相色谱图；

图三，分离纯化得到含量为99％的10-DAB III纯品液相分析图谱。

                               具体实施例

实施例1、半成品10-去乙酰基巴卡亭III原料是低含量，样品溶解和分离纯化都有四氢呋喃的方法

称取含量为23％的10-DAB III原料粉末100克，用100mm的动态轴向压缩液相制备色谱柱，填料为20-45um的球形硅胶，孔径为70A，总共填装了1650克填料(10-DABIII：填料的重量比1.40％左右)，分离色谱柱长40cm，流动相为22∶77∶1＝四氢呋喃∶正己烷∶甲醇(体积比)。

称好含量为23％的10-DAB III原料粉末100克样品，用四氢呋喃在50℃下用超声波促溶解，过滤，每次向压缩液相制备色谱柱进样50克。采用四氢呋喃、正己烷和甲醇上配合比的混合溶液作为流动相，分离时间为60分钟，分离过程用254nm的紫外检测器监测，流动相洗脱流速为300ml/min，用几个容积为一升的收集瓶收集10-DABIII的不同时间段的馏份峰。分离完毕后，用分析液相色谱检测个部分馏分，富集合格馏分50℃用旋转蒸发器回收产品，烘干，得到17克产品。不合格的馏份再次蒸干溶样制备分离，如法收集，蒸干，合并合格产品，称重为4克，计算总得率为91％。测定17克产品10-DAB III的纯度为99％。

图1为含量为23％的10-DAB III原料高效分离制备液相色谱图，图三，分离纯化得到含量为99％的10-DAB III纯品液相分析图谱。

实施例2、半成品10-去乙酰基巴卡亭III原料是高含量，样品溶解和分离纯化都有四氢呋喃的方法

称取原料的10-DAB III粉末60克(含量为53％)，用100mm的动态轴向压缩液相制备色谱柱，填料为20-45um的球形硅胶，孔径为70A，总共填装了1650克填料(10-DAB III：填料的重量比1.92％左右)，分离色谱柱长35cm，流动相为26∶73∶1＝四氢呋喃∶正己烷∶甲醇(体积比)。

称好含量为53％的10-DAB III原料粉末60克样品，用四氢呋喃在55℃下用超声波促溶解，过滤，每次进样30克。采用四氢呋喃、正己烷和甲醇上配合比的混合溶液作为流动相，分离时间为55分钟，分离过程用254nm的紫外检测器监测，流动相洗脱流速为300ml/min，用几个容积为一升的收集瓶收集10-DAB III的不同时间段的馏份峰。分离完毕后，用分析液相色谱检测个部分馏分，富集合格馏分50℃用旋转蒸发器回收产品，烘干，得到25克产品。不合格的馏份再次蒸干溶样制备分离，如法收集，蒸干，合并合格产品，称重为4.5克，计算总得率为93％。测定25克产品10-DAB III的纯度为99％。

图二，含量为53％的半成品10-DAB III高效分离制备液相色谱图；图三，分离纯化得到含量为99％的10-DAB III纯品液相分析图谱。

实施例3

本实施例同于实施例2的各步骤，仅四氢呋喃∶正己烷∶甲醇(体积比)＝30∶68∶2。

实施例4

本实施例同于实施例2的各步骤，仅四氢呋喃∶正己烷∶甲醇(体积比)＝35∶64∶1。

实施例5

本实施例同于实施例2的各步骤，仅四氢呋喃∶正己烷∶甲醇(体积比)＝20∶77∶3。

Claims (4)

1、一种高效分离纯化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，包括样品溶解和后分离纯化步骤，其特征在于：样品溶解步骤是用四氢呋喃溶解半成品10-去乙酰基巴卡亭III；分离纯化步骤是用四氢呋喃、正己烷和甲醇的混和溶剂作为分离洗脱剂，用液相分离方法，对样品溶解步骤获得的过滤物洗脱分离，得到高纯度半成品10-去乙酰基巴卡亭III。

2、如权利要求书1所述的一种高效分离纯化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，其特征在于：半成品10-去乙酰基巴卡亭III：四氢呋喃的配比关系是，每克重量半成品10-去乙酰基巴卡亭III用5-8毫升四氢呋喃溶液。

3、如权利要求书1所述的一种高效分离纯化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，其特征在于：分离洗脱剂中，甲醇、四氢呋喃、正己烷的体积比是，

甲醇          1-----3％

四氢呋喃      20-35％

正己烷        64---78％。

4、如权利要求书1所述的一种高效分离纯化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，其特征在于：分离纯化步骤用的吸附剂为20-45um球形硅胶，孔径为70A。

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