CN104230858A

CN104230858A - 一种从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的方法

Info

Publication number: CN104230858A
Application number: CN201410388561.3A
Authority: CN
Inventors: 徐新军; 梁智坤; 陶俊妃
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-08-08
Also published as: CN104230858B

Abstract

本发明公开了一种从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的方法。所述方法首先将红豆杉枝叶或树皮先用甲醇浸泡，超声提取或回流提取，经减压浓缩得到浸膏；浸膏依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯浸膏；乙酸乙酯浸膏经过碱性氧化铝柱层析后得到富含紫杉醇的组分，再利用以甲醇-水为体系的部分沉淀法处理，得到紫杉醇粗品，最后以快速制备色谱为分离手段，以甲醇-水为洗脱体系，最终精制得到紫杉醇（纯度>98.5%）。本发明的方法操作简便、成本低、重复性好、效率高、所得产品纯度高，可用于紫杉醇的规模化生产。

Description

一种从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的方法

技术领域

本发明属于天然药物提取技术领域。更具体地，涉及一种从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的方法。

背景技术

南方红豆杉（Taxus chinensis var. Mairei），又称美丽红豆杉，为裸子植物门（Gymnospermae）、红豆杉科（Taxaceae）、红豆衫属（Taxus）植物。它作为红豆杉属植物中分布最广泛的一种，主要分布于长江流域、南岭山脉山区等地，是我国生产抗癌药物紫杉醇（Taxol）的主要树种。紫杉醇是红豆杉属植物特有的次生代谢产物，它是最具抗癌活性的天然化合物之一，也是目前国际市场上最热门的新型抗癌药物。紫杉醇的作用机理为促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，主要用于治疗肺癌、白血病、前列腺癌、子宫癌等肿瘤疾病及艾滋病。然而，紫杉醇在红豆杉属植物中的含量相当低（占树皮干重的0.01%~0.06%左右），而红豆杉植物中含有许多与紫杉醇结构相似的其它紫杉烷（Taxanes）。由于这些紫杉烷类化合物在化学结构和极性等方面都同紫杉醇极为相似，导致紫杉醇的分离比较困难，分离纯化工艺复杂。

目前紫杉醇的分离纯化方法主要有：（1）柱层析法，但操作比较复杂，效率不高，而且需要不同填料结合使用；（2）制备型高效液相色谱法，对设备和试剂要求高，成本较高，难以规模化生产；（3）高速逆流色谱法，需要进行大量实验选择合适的溶剂系统；（4）超临界流体萃取法，设备成本高，提取得到的化合物纯度较低。

因此，研究出一套简单可行的分离纯化方案对提高植物中紫杉醇的利用率具有非常重要的意义。

紫杉醇的结构式如下：

。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有紫杉醇分离纯化技术的缺陷和不足，提供一种操作简便、成本低、重复性好、效率高、所得紫杉醇纯度高（纯度>98.5%）的分离纯化方法。

本发明的目的是提供一种从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种包括碱性氧化铝柱层析、部分沉淀、快速制备色谱3个主要步骤的分离制备紫杉醇的方法：红豆杉枝叶或树皮粉碎后先用甲醇超声提取或回流提取，减压浓缩，经有机溶剂萃取得到浸膏，以浸膏为原料，经过碱性氧化铝柱分离后得到富含紫杉醇的组分，再通过以甲醇-水为体系的一步沉淀得到紫杉醇粗品，最后以快速制备色谱为分离手段，以甲醇-水为洗脱体系，得到紫杉醇纯品（纯度>98.5%），具体步骤为：

S1.原料处理

S1.1.红豆杉枝叶或树皮粉碎后过24目筛；

S1.2.步骤S1.1.所得粉末以1：5～20 (g/mL)的料液比，用甲醇作为提取溶剂，超声提取或回流提取，过滤；

S1.3.步骤S1.2.重复1～3次，合并滤液；滤液60℃以下减压浓缩，得到浸膏，浸膏超声分散在水中，用石油醚进行萃取；

S1.4.静止分层后获得水层，水层以乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；

S2.碱性氧化铝柱层析

S2.1.层析用碱性氧化铝190℃干燥6 h后，置干燥器中放至室温，用二氯甲烷溶液浸泡，超声脱气5 min，装柱，平衡；

S2.2.乙酸乙酯浸膏用二氯甲烷溶解至浓度为100～250 mg·mL^-1，离心取上清液，得到样品溶液；

S2.3.清洗柱后上样，以甲醇体积浓度为2%～5%的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂除去未被吸附的杂质，流速为3～5mL·min^-1，洗脱50 min；

S2.4.再以甲醇体积浓度为5%～10%的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱紫杉醇，流速为3～5 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1；

S3.部分沉淀法处理：将组分1以5～10：1( mg/mL)的料液比，用45%～55%的甲醇-水溶液超声溶解后，过滤，再-20℃～10℃放置沉淀24～72 h后过滤，得到紫杉醇粗品；

S4.快速制备液相色谱分离

S4.1.色谱柱预处理：选择制备型中低压液相色谱柱，以体积浓度为50%～75%的甲醇-水溶液为洗脱体系溶液平衡色谱柱；

S4.2.进样：步骤S3获得的紫杉醇粗品加入体积浓度70%～90%的甲醇-水溶解，得浓度为100～250 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清，得到样品溶液，进样体积为1～5 mL；

S4.3.洗脱：以体积浓度为50%～75%的甲醇-水溶液为洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在8～15 mL·min^-1，收集洗脱液；

S4.4.紫杉醇的获取：收集的洗脱液经减压浓缩和真空干燥，得到紫杉醇固体。

其中优选地, 步骤S1.1.所述过筛是过24目筛；

步骤S1.2.所述料液比为1：10(g/mL)；所述超声提取0.5～2 h。

优选地，步骤S1.3.所述石油醚与水层体积比为1：0.5～1；石油醚萃取1～3次。

优选地，步骤S1.3.所述石油醚与水层体积比为1：1；石油醚萃取3次。

优选地，步骤S1.4.所述乙酸乙酯与水层体积比为1：0.5～1；乙酸乙酯萃取1～3次。

优选地，步骤S1.4.所述乙酸乙酯与水层体积比为1：1；乙酸乙酯萃取3次。

本发明利用响应曲面法优化工艺，以紫杉醇得量为指标，采用单因素和响应曲面法对甲醇-水比例、料液比和沉淀时间进行考察，优化最佳提取工艺，优化得到最佳沉淀条件。即优选地，步骤S2.1.所述二氯甲烷溶液的用量为5～10倍柱体积；

步骤S2.3.所述以甲醇体积浓度为2%的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂除去未被吸附的杂质，流速为5mL·min^-1，洗脱50 min；

步骤S2.4.所述以甲醇体积浓度为5%的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱紫杉醇，流速为5 mL·min^-1，洗脱30 min。所采用色谱柱为常规手工色谱柱，常压下操作。

优选地，步骤S3所述部分沉淀法处理是将组分1以8.9：1( mg/mL)的料液比，用48.1%的甲醇-水溶液超声溶解后，过滤，再-20℃放置沉淀48.7 h后过滤。

优选地，步骤S4.1.所述制备型中低压液相色谱柱为C₁₈键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm；所采用的制备型中低压色谱柱可以为商品化或手工填充的中低压色谱柱；

所述甲醇-水溶液的用量为5～10倍柱体积。

优选地，步骤S4.3.的洗脱过程采用在线双波长紫外检测，自动收集洗脱液，紫外检测波长为227 nm和254 nm；

S4.4.所述真空干燥的温度为30℃～60℃，优选温度为30℃～35℃。

本发明可以采用以下最优选方案进行紫杉醇的分离：

（1）红豆杉枝叶或树皮处理：红豆杉枝叶或树皮粉碎后过24目筛，以1：10（g/mL）的料液比，用甲醇作为提取溶剂，超声提取1 h，过滤，得到滤液，上述步骤重复2次，合并滤液，滤液60℃以下减压浓缩得到浸膏；取适量浸膏超声分散在水中，用石油醚萃取3次（1:1，v/v）；静置分层后获得水层，水层以乙酸乙酯萃取3次（1:1，v/v），乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；

（2）碱性氧化铝柱层析：步骤（1）获得的乙酸乙酯浸膏加二氯甲烷溶解，得浓度为250 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液；层析用碱性氧化铝190℃干燥6 h后，干燥器中放置室温，用二氯甲烷浸泡，超声脱气5 min，装柱，平衡。清洗柱后上样，以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为2%，流速为5 mL·min^-1，洗脱50 min以除去未被吸附的杂质，再以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为5%；流速为5 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1。

（3）部分沉淀处理：步骤（2）获得的组分1以8.9：1（mg/mL）的料液比，用48%的甲醇-水溶液，超声溶解后在-20℃冰箱放置48 h，过滤，得到紫杉醇粗品；

（4）色谱柱预处理：快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，以5～10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为50%～75%；

（5）进样：步骤（3）获得的组分紫杉醇粗品加90%的甲醇-水溶解，得浓度为100～250 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液，进样体积为1～5 mL；

（6）洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在8～15 mL·min^-1，收集洗脱液；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为50%～75%；使用在线双波长紫外检测。

（7）紫杉醇的获取：收集的洗脱液经减压浓缩和真空干燥得到紫杉醇固体。

所述制备型中低压色谱柱可以选用商品化或自己填充的制备柱，填料为C₁₈键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm；紫外检测波长为227 nm和254 nm；收集的洗脱液减压浓缩和真空干燥的温度为30℃～35℃。

本发明通过大量的研究和探索，得出了上述紫杉醇分离纯化的方法，其中，碱性氧化铝柱层析可以使红豆杉提取物中的糖苷化紫杉醇分解为紫杉醇，从而进一步提高紫杉醇的产量。部分沉淀法（Fractional Precipitation）是在沉淀原理的基础上，利用温度的变化，以及样品中各化合物在所选取溶剂中溶解度的差异，从而达到了快速、简单富集目标化合物的目的。快速制备色谱（Flash Chromatography）是在传统柱色谱的基础上发展起来的快速分离系统，采用自动输液系统和更小粒径的填料，通过连接检测器进行实时监测，并可自动收集馏分。该色谱仪可使用分析纯试剂做流动相，降低了成本，可承受较高流速，通过调节流动相的比例实现对物质的快速、有效分离。

本发明进一步优化了提取工艺，使得整个提取方法达到了有效的配合协调，提取紫杉醇的效率和纯度都得到了很大的提升，获得了显著的进步。

为了验证本法分离纯化紫杉醇的效果，本发明还采用HPLC对紫杉醇进行纯度分析，以外标法计算紫杉醇的纯度，并通过UV、MS、¹H NMR和¹³C NMR进行结构鉴定。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种操作简便、成本低、重复性好、效率高、所得紫杉醇纯度高（纯度>98.5%）、适用于规模化生产的分离纯化方法。本发明以快速制备色谱为分离手段，结合碱性氧化铝层析柱和部分沉淀法优化样品提取、净化方法，使紫杉醇得到快速、高效分离，可以获得纯度大于98.5%的紫杉醇，可作为从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的工业化生产方法。

而且，本发明采用紫外检测器实时双波长检测，有助于判断紫杉醇峰纯度，观察紫杉醇与杂质的分离情况，并可设置参数实现仪器自动收集洗脱液。

同时，本发明所述方法操作简单方便，碱性氧化铝柱层析可以在常压下操作，速度快，并且可以使红豆杉提取物中的糖苷化紫杉醇分解为紫杉醇，在除去杂质的同时提高紫杉醇的产量。而部分沉淀法所用溶剂种类少（仅为甲醇和水），对比传统沉淀法，在一种溶剂中添加另一种溶剂使化合物沉淀析出的方法，部分沉淀过程中不改变溶剂比例，可以达到循环利用母液的效果，减小分离纯化过程中紫杉醇的损失，提高回收率。

另外，本发明所述中低压快速制备色谱法可以在120 min内完成分离，相对于传统柱层析技术，大大缩短分离纯化的时间，减少因为周期太长而可能引起的紫杉醇的降解。

附图说明

图1为紫杉醇的快速制备色谱图。

图2为紫杉醇的纯度测定HPLC图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、红豆杉枝叶处理

（1）取红豆杉枝叶粉碎后过24目筛，取500 g粉末按1：10（g/mL）的比例加入甲醇，浸泡5 h，超声提取1 h，过滤，得到滤液，残渣按1：10（g/mL）的比例加入甲醇重复提取1 h，重复1次，合并滤液。

（2）滤液60℃以下减压浓缩得到浸膏（48.75 g）。所得浸膏超声分散在水中，用石油醚萃取3次（1:1，v/v）；静置分层后获得水层，水层以乙酸乙酯萃取3次（1:1，v/v），乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏（3.36 g）。

2、碱性氧化铝柱层析

（1）取步骤1所得乙酸乙酯浸膏，加适量二氯甲烷溶解，得浓度为250 mg·mL^-1的样品溶液，离心10 min（15000 rpm），取上清液，得到样品溶液；

（2）取层析用碱性氧化铝约100 g于190℃干燥6 h后，干燥器中放置至室温，用二氯甲烷浸泡，超声脱气5 min，装柱，平衡。

（3）清洗柱后上样，以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为2%，流速为5 mL·min^-1，洗脱50 min以除去未被吸附的杂质；

（4）再以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为5%；流速为5 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1（215 mg）。

3、部分沉淀处理

取步骤2获得的组分1约2 g，以8.9：1（mg/mL）的料液比，加入48%的甲醇-水溶液，超声溶解后在-20℃冰箱放置48.7 h，过滤，得到紫杉醇粗品602 mg。

4、快速制备液相色谱分离

（1）色谱柱预处理

快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，填料平均粒径为32 mm的C₁₈键合相填料，规格为（500 mm× 30 mm，200 g），以5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。体积浓度为75%的甲醇-水溶液

（2）进样：步骤3获得的组分紫杉醇粗品加90%的甲醇-水溶解，得浓度为100 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液，进样体积为5 mL。

（3）洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在15 mL·min^-1，仪器自动收集洗脱液，10 mL/管；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为60%；使用在线双波长紫外检测，检测波长为227，254 nm。

（4）紫杉醇的获取：收集的洗脱液经减压浓缩和真空干燥，2g过氧化铝柱的浸膏，经过部分沉淀及中压柱层析，最后得到紫杉醇固体510 mg。所述真空干燥的温度为30℃～35℃。

5、结果分析：

产物经测定，其结构数据为：ESI-MS: m/z: 892.5[M+Na]+，UV(acetonitrile) λmax nm：228。1H NMR和13C NMR数据如表1所示。快速制备色谱图如附图1所示。HPLC 外标法测定其纯度为98.57%，如附图2所示。

表1 紫杉醇的NMR数据（Chloroform-d6，400 MHz，δ）

实施例2

1、红豆杉树皮处理

（1）取红豆杉树皮粉碎后过24目筛，取500 g粉末按1：10（g/mL）的比例加入甲醇，浸泡5 h，回流提取1 h，过滤，得到滤液，残渣按1：10（g/mL）的比例加入甲醇重复提取1 h，重复1次，合并滤液。

（2）滤液60℃以下减压浓缩得到浸膏（40.62 g）。所得浸膏超声分散在水中，用石油醚萃取3次（1:1，v/v）；静置分层后获得水层，水层以乙酸乙酯萃取3次（1:1，v/v），乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏（4.26 g）。

2、碱性氧化铝柱层析

（1）取步骤1所得乙酸乙酯浸膏，加二氯甲烷适量溶解，得浓度为250 mg·mL^-1的样品溶液，离心10 min（15000 rpm），取上清液作为样品溶液。

（2）取层析用碱性氧化铝约100 g于190℃干燥6 h后，置干燥器中放置室温，用二氯甲烷浸泡，超声脱气5 min，装柱，平衡。

（3）清洗柱后上样，以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为2%，流速为5 mL·min^-1，洗脱50 min以除去未被吸附的小极性杂质。

（4）再以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为5%；流速为5 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1（348 mg）。

3、部分沉淀处理

取步骤2获得的组分1约2 g以8.9：1（mg/mL）的料液比，加入48.1%的甲醇-水溶液，超声溶解后在-20℃冰箱放置48.7 h，过滤，得到紫杉醇粗品656 mg。

4、快速制备液相色谱分离

（1）色谱柱预处理

快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，填料平均粒径为32 mm的C₁₈键合相填料，规格为（500 mm× 30 mm，200 g），以5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。体积浓度为50%的甲醇-水溶液

（2）进样

步骤3获得的组分紫杉醇粗品加90%的甲醇-水溶解，得浓度为250 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液，进样体积为5 mL。

（3）洗脱

采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在15 mL·min^-1，仪器自动收集洗脱液，10 mL/管；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为60%；使用在线双波长紫外检测，检测波长为227，254 nm。

（4）紫杉醇的获取

收集的洗脱液经减压浓缩和真空干燥，2g过氧化铝柱的浸膏，经过部分沉淀及中压柱层析，最后得到紫杉醇固体0.544 g。所述真空干燥的温度为30℃～35℃。

HPLC测定其纯度为98.52%。

实施例3

1、红豆杉枝叶处理

（1）取红豆杉枝叶粉碎后过24目筛，取500 g粉末按1：5（g/mL）的比例加入甲醇，浸泡5 h，回流提取1 h，过滤，得到滤液，残渣按1：5（g/mL）的比例加入甲醇重复提取1 h，重复2次，合并滤液。

（2）滤液60℃以下减压浓缩得到浸膏（45.85 g）。所得浸膏超声分散在水中，用石油醚萃取2次（1:0.5，v/v）；静置分层后获得水层，水层以乙酸乙酯萃取2次（1:0.5，v/v），乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏（3.18 g）。

2、碱性氧化铝柱层析

（1）取步骤1所得乙酸乙酯浸膏，加适量二氯甲烷溶解，得浓度为200 mg·mL^-1的样品溶液，离心10 min（15000 rpm），取上清液作为样品溶液。

（4）再以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为10%；流速为5 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1（226 mg）。

3、部分沉淀处理

取步骤2获得的组分1约2 g以5：1（mg/mL）的料液比，加入45%的甲醇-水溶液，超声溶解后在-20℃冰箱放置24 h，过滤，得到紫杉醇粗品616mg。

4、快速制备液相色谱分离

（1）色谱柱预处理

快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，填料平均粒径为32 mm的C₁₈键合相填料，规格为（500 mm× 30 mm，200 g），以5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。所述洗脱体系为体积浓度为75%的甲醇-水溶液。

（2）进样

步骤3获得的组分紫杉醇粗品加70%的甲醇-水溶解，得浓度为200 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液，进样体积为3mL。

（3）洗脱

采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在8 mL·min^-1，仪器自动收集洗脱液，10 mL/管；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为50%；使用在线双波长紫外检测，检测波长为227，254 nm。

（4）紫杉醇的获取

收集的洗脱液经减压浓缩和真空干燥，2 g过氧化铝柱的浸膏，经过部分沉淀及中压柱层析，最后得到紫杉醇固体496 mg，所述真空干燥的温度为30℃～60℃。

HPLC测定其纯度为98.63%。

实施例4

1、红豆杉树皮处理

（1）取红豆杉树皮粉碎后过24目筛，取500 g粉末按1：15（g/mL）的比例加入甲醇，浸泡5 h，超声提取2 h，过滤，得到滤液，残渣按1：15（g/mL）的比例加入甲醇重复提取1 h，重复1次，合并滤液。

（2）滤液60℃以下减压浓缩得到浸膏（42.85 g）。所得浸膏超声分散在水中，用石油醚萃取3次（1:1，v/v）；静置分层后获得水层，水层以乙酸乙酯萃取3次（1:1，v/v），乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏（4.86 g）。

2、碱性氧化铝柱层析

（1）取步骤1所得乙酸乙酯浸膏约5 g加二氯甲烷溶解，得浓度为100 mg·mL^-1的样品溶液，离心10 min（15000 rpm），取上清液作为样品溶液。

（3）清洗柱后上样，以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为3%，流速为3 mL·min^-1，洗脱50 min以除去未被吸附的小极性杂质。

（4）再以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，其中甲醇在二氯甲烷-甲醇溶液中的体积浓度为7%；流速为3 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1（336 mg）。

3、部分沉淀处理

取步骤2获得的组分1约2 g以10：1（mg/mL）的料液比，加入55%的甲醇-水溶液，超声溶解后在-20℃冰箱放置72 h，过滤，得到紫杉醇粗品623 mg。

4、快速制备液相色谱分离

（1）色谱柱预处理

快速制备液相色谱选择制备型中低压液相色谱柱，填料平均粒径为32 mm的C₁₈键合相填料，规格为（500 mm× 30 mm，200 g），以5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。体积浓度为70%的甲醇-水溶液。

（2）进样

步骤3获得的组分紫杉醇粗品加80%的甲醇-水溶解，得浓度为100 mg·mL^-1的样品溶液，离心，取上清液，得到样品溶液，进样体积为4mL。

（3）洗脱

采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10 mL·min^-1，仪器自动收集洗脱液，10 mL/管；洗脱体系为甲醇-水溶液，其中甲醇在甲醇-水溶液中的体积浓度为75%；使用在线双波长紫外检测，检测波长为227，254 nm。

（4）紫杉醇的获取

收集的洗脱液经减压浓缩和真空干燥，2 g过氧化铝柱的浸膏，经过部分沉淀及中压柱层析，最后得到紫杉醇固体566 mg。所述真空干燥的温度为30℃～60℃。

HPLC测定其纯度为98.73%。

Claims

1.一种从红豆杉枝叶或树皮中分离纯化紫杉醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.原料处理：将粉碎的红豆杉材料过筛，用甲醇浸泡，超声或回流提取后，经减压浓缩得到浸膏；浸膏依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯浸膏；

S2.碱性氧化铝柱层析：乙酸乙酯浸膏用二氯甲烷溶解后，利用碱性氧化铝柱层析；以二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂，洗脱液经减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1；

S3.部分沉淀法处理：将组分1以5～10：1 mg/mL的料液比，用45%～55%的甲醇-水溶液超声溶解，过滤，再-20℃～10℃放置沉淀24～72 h后过滤，得到紫杉醇粗品；

S4.快速制备液相色谱分离：

S4.1.色谱柱预处理：以体积浓度为50%～75%的甲醇-水溶液为洗脱体系溶液平衡制备型中低压液相色谱柱；

S4.4.洗脱液经减压浓缩和真空干燥，得到紫杉醇固体。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述过筛是过24目筛；步骤S1所述料液比为1：10～20 g/mL；所述超声的时间为0.5～2 h。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2的具体操作如下：

S2.3.清洗柱后上样，以甲醇体积浓度为2%～5%的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂除去未被吸附的杂质，流速为3～5mL·min^-1，洗脱50 min；

S2.4.再以甲醇体积浓度为5%～10%的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱色谱柱，流速为3～5 mL·min^-1，洗脱30 min，收集洗脱液，60℃以下减压浓缩得到富含紫杉醇的组分1。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述部分沉淀法处理是将组分1以8.9：1 mg/mL的料液比，用48.1%的甲醇-水溶液超声溶解后，过滤，再-20℃放置沉淀48.7 h后过滤。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4.1.所述制备型中低压液相色谱柱为C₁₈键合相填料；色谱柱填料平均粒径为30～60μm；所述甲醇-水溶液的用量为柱体积的5～10倍。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4.3.的洗脱过程采用在线双波长紫外检测，自动收集洗脱液，紫外检测波长为227 nm和254 nm；步骤S4.4.所述真空干燥的温度为30℃～60℃，优选温度为30℃～35℃。