CN101397284A - 从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明将公开一种从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，它包括：提取-脱脂-萃取-分别对有机相和水相进行粗分离-反相色谱精分离-结晶。本发明依次采用80－95％、60－75％和20－55％的乙醇对红豆杉原料进行梯度提取，将不同极性的紫杉烷类化合物充分的提取出来，使紫杉烷类化合物的总提取率从传统工艺的70％提高到了90％以上；实现了从一批红豆杉原料中同时提取出8种不同的紫杉烷类化合物单体，且各单体纯度都可达到98％以上；充分利用传统工艺中废弃的萃取步骤生成的水相物质，将红豆杉中紫杉烷类化合物的利用率提高了10－20倍，有效的解决了红豆杉原料资源匮乏的工业生产瓶颈问题。

Description

从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法

(一)技术领域：

本发明涉及从天然植物中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，具体涉及从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法。

(二)背景技术：

紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物。它在临床上广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、食道癌、头颈癌、抗化疗白血病等多种癌症的化疗，具有确切的疗效。作为唯一促进微管聚合的抗癌新药，紫杉醇产品Taxol和Taxotere已成为主要的抗癌药物之一。制备紫杉醇的方法包括：1)自紫杉或其它可再生的紫杉属植物中提取Taxol；2)自其它天然紫杉烷(10-去乙酰基巴卡亭III)化合物半合成Taxol或Taxotere；3)从头全合成。目前为止，仅仅提取和半合成方法实现了产业化，因紫杉醇结构复杂，已报道的全合成方法路线长、收率低、成本极高，很难达到产业化的要求。在上述方法中，常采用从紫杉属植物中提取的方法制备紫杉醇，其步骤一般为：浸出(或超声或微波提取)————脱脂——萃取得到粗提物——2-3次工业色谱分离——结晶——溴化——正相色谱分离——重结晶得产品；并在此基础上发展了许多改进工艺，包括固相萃取和专用反相柱的使用以及省去溴化过程等，如申请号为01110208.X，名称为<<一种联合制备高纯度紫杉醇、三尖杉宁碱、10—脱乙酰基巴卡亭III的方法>>的中国发明专利，公开了一种从紫杉植物的树叶、树皮或树枝的醇提取物中联合生产高纯紫杉醇、10—脱乙酰基巴卡亭III和三尖杉宁碱的方法，它是用乙酸丁酯溶解醇提取物后，用碳酸氢钠溶液反萃取去除杂质，将有机相减压蒸发除去溶剂，然后用乙腈溶解残渣，冷冻结晶得到10—脱乙酰基巴卡亭III；以结晶后的母液为原料，用以高分子填料为固定相的反相色谱法分离和纯化三尖杉宁碱和紫杉醇；在反相色谱法运作中，采用冷冻结晶法分离洗脱液中的有效成分，再结合以硅胶为固定相的正相色谱法深度纯化紫杉醇产品，其纯度可达99.6％以上。

(三)发明内容：

本发明将提供一种从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其中，所述其它紫杉烷类化合物为三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-紫杉醇、7-表-紫杉醇和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。

本发明从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，它包括：提取——脱脂——萃取——分别对有机相和水相进行粗分离——反相色谱精分离——结晶；

其中，所述提过程取为依次用体积浓度80-95％、60-75％和20-55％的乙醇对红豆杉原料进行提取；可采用红豆杉的树皮或枝叶为原料，将其在阴暗处自然晾干后粉碎至40-100目再进行提取；所述乙醇的用量一般为红豆杉原料重量的5-8倍v/w；提取的时间最好为5-8小时；合并三次提取所得的提取液，回收乙醇后，浓缩至红豆杉原料重量的5-10倍，得到提取液；

所述脱脂过程为向浓缩后的提取液中加入等体积的非极性溶剂脱酯三次，收集水层，浓缩后得到脱酯提取液；所述非极性溶剂可选自6号溶剂汽油、120号溶剂汽油、石油醚、正己烷中的任意一种；

所述萃取过程为将脱酯提取液用与其等体积的低碳链酯萃取三次，分别合并三次萃取所得的有机相和水相；其中，所述低碳链酯可选自乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯或乙酸异戊酯中的任意一种；

所述对有机相进行粗分离是将萃取所得的有机相减压浓缩，得到浸膏A；将浸膏A先上氧化铝层析柱，氧化铝层析柱所填充的氧化铝可为浸膏A的20-50倍(w/w)；可用低碳链酯和溶剂汽油的混合液作为洗脱剂进行洗脱，其中，低碳链酯和溶剂汽油的体积比最好为1：9-9：1，所得洗脱液减压浓缩得到浸膏B；将浸膏B用丙酮溶解，得到拌有浸膏B的丙酮溶液，其中，丙酮的用量以能溶解浸膏B为适量；将拌有浸膏B的丙酮溶液与去活性硅胶均匀混合(丙酮的体积：去活性硅胶重量＝2：1)，再将其加载到上样量的30-100倍(w/w)的正相硅胶柱上，用低碳链酯和溶剂汽油的混合液作为洗脱剂进行洗脱，其中，低碳链酯和溶剂汽油的体积比最好为1：9-9：1；分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物A；上述过程中，所述低碳链酯与萃取过程中的选取范围相同；溶剂汽油可为6号溶剂汽油，或90号溶剂油，或120号溶剂汽油等，对于洗脱的方式最好采用梯度洗脱；

所述对水相的粗分离是将萃取所得的水相减压浓缩，得到浸膏C；将浸膏C用相当于其50倍重量的、体积浓度为1-5％的乙醇稀释后上弱极性或非极性大孔吸附树脂，所述弱极性或非极性大孔吸附树脂可选自ADS-5、ADS-8、X-5、AB-8、NKA、NKA-9、NKA-II、D101大孔树脂中的任意一种；上好柱后可用体积浓度为10-95％的乙醇洗脱，所得洗脱液减压浓缩得到中间体D；再将中间体D用丙酮溶解，其中，丙酮的用量以能溶解中间体D为适量；将拌有中间体的丙酮溶液与去活性硅胶均匀混合(丙酮的体积：去活性硅胶重量＝2∶1)，再将其加载到上样量的30-100倍(w/w)的正相硅胶柱上，可用低碳链酯和溶剂汽油的混合液作为洗脱剂进行洗脱，其中，低碳链酯和溶剂汽油的体积比最好为1：9-9：1；分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物B；上述过程中，所述低碳链酯与萃取过程中的选取范围相同；溶剂汽油可为6号溶剂汽油，或90号溶剂油，或120号溶剂汽油，对于洗脱的方式最好采用梯度洗脱；

所述反相色谱精分离过程是先将浓缩物A和浓缩物B合并，得到混合物，将其真空干燥后，再用乙醇-水溶液溶解，其用量以能溶解混合物为适量，两者之间的比例最好为1：1(w/v)，其中，乙醇与水的体积比一般为2-3：1；再将溶解后的混合物上反相硅胶柱层析，所述反相硅胶柱可为C18等；用乙腈-水溶液为洗脱剂进行洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥，分别得到紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-紫杉醇、7-表-紫杉醇和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的粉末物；其中，乙腈与水的体积比最好为1：9-8：2，所述洗脱方式最好采用梯度洗脱，所述反相硅胶柱填充的硅胶可为上样量的20-50倍；

所述结晶过程是将精分离得到的紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的粉末物，分别用丙酮-正己烷溶液结晶，过滤、真空干燥后，即可分别得到紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-紫杉醇、7-表-紫杉醇和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的单体；上述过程中，所述丙酮-正己烷溶液的用量为各粉末物重量的1-5倍(v/v)，其中，丙酮与正己烷的体积比一般为1-2：1。

本发明的优点：

1、在提取过程中采用了用乙醇对红豆杉进行梯度提取，将不同极性的紫杉烷类化合物充分的提取出来，使紫杉烷类化合物的总提取率从传统工艺的70％提高到了90％以上；

2、采用低毒性的低碳链酯作为溶媒，使脂溶性紫杉烷类化合物与水溶性成分较好的分开，有利于后序的纯化处理，更适于工业化大生产；

3、实现了从一批红豆杉原料中同时提取出8种不同的紫杉烷类化合物单体，且各单体纯度都可达到98％以上(其中紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、7-表-紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭III的纯度均可达到99％以上)。

4、充分利用传统工艺中废弃的萃取步骤生成的水相物质，将红豆杉中紫杉烷类化合物的利用率提高了10-20倍，有效的解决了红豆杉原料资源匮乏的工业生产瓶颈问题。

(四)具体实施方式：

实施例1

1)取10千克阴暗处自然晾干的曼地亚红豆杉枝叶，粉碎至40目，先用50升体积浓度为95％的乙醇在常温下提取5个小时，用200目的滤布过滤，收集提取液；再加入80升体积浓度为60％的乙醇提取10个小时，用200目的滤布过滤，收集提取液；再加入50升体积浓度为55％的乙醇提取8个小时，用200目的滤布过滤，收集提取液；合并提取液，回收乙醇，将提取液浓缩成50升提取液；

2)向浓缩后的提取液中加入50升的石油醚脱酯三次，收集水层，浓缩后得到脱酯提取液；

3)将脱酯提取液用50升的乙酸乙酯萃取三次，分别合并三次萃取所得的有机相和水相；

4)将萃取所得的有机相减压浓缩，得到浸膏A；将浸膏A先加载到相当于其重量30倍氧化铝层析柱上，用乙酸乙酯和6号溶剂汽油的混合液(1：9-9：1，v/v)作为洗脱剂梯度洗脱(以硅胶G薄层进行检测，氯仿-丙酮展开)，所得洗脱液减压浓缩得到28克浸膏B；将浸膏B用30毫升的丙酮溶解，得到拌有浸膏B的丙酮溶液，将其与去活性硅胶(2：1，v/w)均匀混合，再将其加载到为浸膏B重量30倍的正相硅胶上，用乙酸乙酯和6号溶剂汽油的混合液(1：9-9：1，v/v)作为洗脱剂梯度洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物A；

5)将萃取所得的水相减压浓缩，得到浸膏C；将浸膏C用相当于其重量50倍的、体积浓度为1％的乙醇稀释后上ADS-5树脂进行吸附，用体积浓度为10-95％的乙醇梯度洗脱，所得洗脱液减压浓缩得到61克中间体D；再将中间体D用50毫升丙酮溶解，将拌有中间体D的丙酮溶液与去活性硅胶(2：1v/w)均匀混合，再将其加载到为中间体D重量的30倍正相硅胶上，用乙酸乙酯和6号溶剂汽油的混合液(1：9-9：1，v/v)作为洗脱剂梯度洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物B；

6)浓缩物A和浓缩物B合并，真空干燥后，用乙醇-水溶液(2：1，v/v)溶解，其用量以能溶解混合物为适量，再将溶解后的混合物加载到为浓缩物A和浓缩物B的混合物重量的20倍C18反相硅胶柱上，用乙腈-水溶液(1：9-8：2，v/v)为洗脱剂梯度洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥，分别得到含量均超过80％的紫杉醇粉末物、三尖杉宁碱粉末物、10-去乙酰基紫杉醇粉末物、巴卡亭III粉末物、10-去乙酰基巴卡亭III粉末物、7-木糖基-紫杉醇粉末物、7-表-紫杉醇粉末物和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇粉末物；

7)分别在步骤6)中得到的各粉末物中加入丙酮-正己烷溶液(2：1，v/v)结晶(所述粉末物重量：丙酮-正己烷溶液体积＝1：5)，过滤，真空干燥，分别得到0.7克紫杉醇单体、0.2克三尖杉宁碱单体、1.8克10-去乙酰基紫杉醇单体、1.3克巴卡亭III单体、1.5克10-去乙酰基巴卡亭III单体、2.6克7-木糖基-紫杉醇单体、1.0克7-表-紫杉醇单体和10.0克7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇单体。

经检测，7-木糖基-紫杉醇和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的纯度达到98％以上，紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、7-表-紫杉醇和10-去乙酰基巴卡亭III的纯度达到99％以上。

实施例2

1)取50千克阴暗处自然晾干的南方红豆杉枝叶，粉碎至100目，先用400升体积浓度为80％的乙醇在常温下提取8个小时，用200目的滤布过滤，收集提取液；再加入250升体积浓度为75％的乙醇提取10个小时，用200目的滤布过滤，收集提取液；再加入300升体积浓度为20％的乙醇提取10个小时，用200目的滤布过滤，收集提取液；合并提取液，回收乙醇，将提取液浓缩成350升提取液；

2)向浓缩后的提取液中加入350升的正己烷脱酯三次，收集水层，浓缩后得到脱酯提取液；

3)将脱酯提取液用350升的乙酸丁酯萃取三次，分别合并三次萃取所得的有机相和水相；

4)将萃取所得的有机相减压浓缩，得浸膏A；将浸膏A先加载到其重量40倍(w/w)的氧化铝层析柱上，用乙酸丁酯和120号溶剂汽油的混合液(1：9-9：1，v/v)作为洗脱剂梯度洗脱(以硅胶G薄层进行检测，氯仿-丙酮展开)，所得洗脱液减压浓缩得167克浸膏B；将浸膏B用150毫升丙酮溶解，得到拌有浸膏B的丙酮溶液，将其与去活性硅胶(2：1，v/w)均匀混合，再将其加载到为浸膏B重量100倍的正相硅胶上，用乙酸丁酯和120号溶剂汽油的混合液(1：9-9：1，v/v)作为洗脱剂梯度洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物A；

5)将萃取所得的水相减压浓缩，得浸膏C；将浸膏C用相当于其50倍重量的、体积浓度为5％的乙醇稀释后上NKA树脂进行吸附，用体积浓度为10-95％的乙醇梯度洗脱，所得洗脱液减压浓缩得352克中间体D；再将中间体D用350毫升丙酮溶解，将拌有中间体D的丙酮溶液与去活性硅胶(2：1，v/w)均匀混合，再将其加载到为中间体D重量100倍的正相硅胶上，用乙酸丁酯和120号溶剂汽油的混合液(1：9-9：1，v/v)作为洗脱剂梯度洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物B；

6)将浓缩物A和浓缩物B合并，得到混合物，真空干燥后，用乙醇-水溶液(3：1，v/v)溶解，其体积与混合物的重量比为1：1，再将溶解后的混合物加载到为浓缩物A和浓缩物B的混合物重量的50倍C18反相硅胶柱上，用乙腈-水溶液(1：9-8：2，v/v)为洗脱剂梯度洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥，分别得到含量均超过80％的紫杉醇粉末物、三尖杉宁碱粉末物、10-去乙酰基紫杉醇粉末物、巴卡亭III粉末物、10-去乙酰基巴卡亭III粉末物、7-木糖基-紫杉醇粉末物、7-表-紫杉醇粉末物和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇粉末物；

7)分别在步骤6)中得到的各粉末物中加入丙酮-正己烷溶液(1：1，v/v)结晶(所述粉末物重量：丙酮-正己烷溶液体积＝1：5)，过滤，真空干燥，分别得到3.8克紫杉醇单体、1.2克三尖杉宁碱单体、9.8克10-去乙酰基紫杉醇单体、6.8克巴卡亭III单体、7.1克10-去乙酰基巴卡亭III单体、16.0克7-木糖基-紫杉醇单体、6.3克7-表-紫杉醇单体和50.5克7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇单体。

经检测，7-木糖基-紫杉醇和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的纯度达到98％以上，紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、7-表-紫杉醇和10-去乙酰基巴卡亭III的纯度达到99％以上。

Claims (10)

1、从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于它包括：提取——脱酯——萃取——分别对有机相和水相进行粗分离——反相色谱精分离——结晶；

其中，所述提过程取为依次用体积浓度80-95％、60-75％和20-55％的乙醇对红豆杉原料进行提取，合并三次提取液，回收乙醇得到浓缩后的提取液。

2、根据权利要求1所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述提取过程中乙醇的用量为红豆杉原料重量的5-8倍v/w；提取的时间为5-8小时。

3、根据权利要求1或2所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述其它紫杉烷类化合物为三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-紫杉醇、7-表-紫杉醇和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。

4、根据权利要求1或2所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述脱酯过程为将浓缩后的提取液用非极性溶剂脱酯三次，得到脱酯提取液。

5、根据权利要求1或2所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述萃取过程为将脱酯提取液用低碳链酯萃取三次，收集有机相和水相。

6、根据权利要求1或2所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述对有机相进行粗分离是将萃取所得的有机相减压浓缩，得到浸膏A；将浸膏A先上氧化铝层析柱，用洗脱剂洗脱，所得洗脱液减压浓缩得到浸膏B；再将浸膏B上正相硅胶柱，用洗脱剂洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物A。

7、根据权利要求1或2所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述对水相进行粗分离是将萃取所得的水相减压浓缩，得到浸膏C；将浸膏C先上弱性或非极性大孔吸附树脂，用洗脱剂洗脱，所得洗脱液减压浓缩得到中间体D，再将中间体D上正相硅胶柱，用洗脱剂洗脱，分段收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到富集紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的浓缩物B。

8、根据权利要求6所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述氧化铝层析和正相硅胶柱层析过程中，所用的洗脱剂为低碳链酯和溶剂汽油的混合液，其中，低碳链酯和溶剂汽油的体积比均为1：9-9：1。

9、根据权利要求1或2所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述反相色谱精分离是将浓缩物A和浓缩物B合并，得到混合物，再将其上反相硅胶柱层析，用洗脱剂洗脱，分别收集紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的洗脱液，进行减压浓缩、干燥后得到紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的粉末物。

10、根据权利要求9所述的从红豆杉中提取分离紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的方法，其特征在于：所述反相硅胶柱层析过程中，洗脱剂为乙腈-水溶液，其中，乙腈与水的体积比为1：9-8：2。