CN1172186C - 套装人参皂甙标准对照品的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分析测试领域尤其是高效液相色谱法(HPLC)应用的套装高纯度人参皂甙标准对照品及其分离制备方法。该套装标准对照品中同时包括有产品纯度达98%以上的人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1六种单体。其制备方法包括：常压硅胶柱层析预纯化：等度高效制备色谱分离纯化；冷却析晶，得各单体产品，将单体分别装入瓶中，再将各单体组合为一套，而形成套装人参皂甙标准对照品。
Description
技术领域：本发明涉及一种分析测试领域尤其是高效液相色谱法(HPLC)应用的套装高纯度人参皂甙标准对照品的分离制备方法。
背景技术：目前，中草药现代化发展及保健食品的兴起，人参制品的产品质量控制已得到高度重视；人参皂甙的含量是其质量控制的关键指标；高效液相色谱法(HPLC)具有高的分离定量能力，并可对各皂甙单体进行定量测定，但此方法的开展需要有相应各皂甙单体的高纯度对照品，以利于方法的外标法定量测定。但目前提供的人参皂甙标准对照品的纯度低，仅为95％(HPLC)，且多数需要进口；尤其是对照品均为单体，经常难买齐全，且价格昂贵。其制备方法有的是单纯用液相色谱法，其分离量小，成本高，只能自己用于科研；二是用硅胶柱层析反复多次进行分离，手续麻烦，纯度达不到要求。
发明内容：本发明的目的是提供一种回收率高，产品纯度高的套装人参皂甙单体标准对照品的制备方法。
该套装标准对照品中同时包括有产品纯度达98％以上的人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1六种单体。
其制备方法包括以下步骤：
(一)常压硅胶柱层析预纯化：
(1)样品的准备：取由五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的根或茎叶，用80％乙醇提取并经浓缩、树脂吸附净化得到的总皂甙含量大于50％的人参提取物；
(2)制备玻璃层析柱：采用100～200目层析硅胶为固定相，于120℃活化4-15小时，冷后以湿法装柱；装柱用的溶剂为氯仿∶甲醇∶水＝(65～75)∶(35～25)∶10(下层溶液)；
(3)常压柱层析分离：将人参提取物用甲醇溶解后，与失活硅胶按提取物与硅胶重量比为(4～8)∶10范围内配制混合，蒸干溶剂后将固体部分研碎，装入制备好的玻璃层析柱柱头；
(4)氯仿∶甲醇∶水＝(65～75)∶(35～25)∶10进行洗脱，洗脱流动相流速为5～15mL/min，各皂甙洗脱顺序)为：Rb2、Rg1、Re、Rd、Rc、Rb1；
(5)分段收集洗脱液，各部分收集液蒸干后得中间产物，各单体皂甙含量在30～80％范围；其中未分离的各单体主要以两种皂甙混合形式存在，如：Rb2+Rg1、Rg1+Re、Re+Rd、Rd+Rc、Rc+Rb1；
(二)等度高效制备色谱分离纯化；
A、分离固定相为反相C18填料，流动相如下：Rb2与Rg1的分离采用20-35％乙腈，Rg1与Re的分离采用15～30％的乙腈，Re与Rd的分离采用20～35％的乙腈，而Rd与Rc、Rc与Rb1的分离采用25～40％的乙腈。
B、同步采用紫外检测器于203nm监视流出曲线而指导产品收集；
(三)收集液于水浴上浓缩后于冰箱(4℃)中冷却析晶，得各单体产品；
(四)将单体分别装入瓶中，再将各单体组合为一套，而形成套装人参皂甙标准对照品。
用本方法得到的最终单体产品用紫外、红外及梯度高效液相色谱鉴定其纯度并进行产品质量控制，本对照品纯度＞98％，各单体品种齐；可作为人参制品(含人参原材料、人参提取物、中草药及保健食品等)中人参皂甙高效液相色谱测定的定量、定性标准对照品。
附图说明：
图1为Rb2的等度制备色谱图。
图2为Rb1的等度制备色谱图。
图3为Rg1的等度制备色谱图。
图4为Rc的等度制备色谱图。
图5为Re、Rd的等度制备色谱图。
具体实施方式：
实施例：
一、硅胶柱层析
1、干法上样 将6克人参茎叶提取物(总皂甙＞70％)溶于10ml甲醇中，所得溶液分几次加入10克未活化的硅胶中，在水浴锅上混匀、烘干，贮存在干燥器中备用。
2、湿法装柱 将于120℃活化12h的硅胶，冷却，装入充满流动相的玻璃空柱(5cm×70cm)，柱长约50cm，静置过夜。
3、流动相准备 VCHCl3∶VMeOH∶VH20＝65∶35∶10，配好摇匀，静置澄清，取下层。
4、将样品装于硅胶柱中，用流动相开始淋洗，前600ml不收集，以后每100ml收集一杯，第4-7杯合并蒸干，得人参皂甙Rb2粗品；第9-14杯合并蒸干，得人参皂甙Rg1粗品；第17-26杯合并蒸干，得人参皂甙Re、Rd的粗品；第27-34杯合并蒸干，得人参皂甙Rc的粗品；第41-47杯合并蒸干，得人参皂甙Rb1的粗品。
二、HPLC进行半制备分离
1、Rb2的制备
色谱柱：Prep Nova_pakR HR C18 6um 7.8×300mmHPLC column
流动相30％CH3CN
流速4ml/min
检测波长203nm进样量1ml样液浓度约10mg/ml，色谱图如图1。
2、Rb1的制备
色谱柱：Prep Nova_pakR HR C18 6um 7.8×300mmHPLC column
流动相30％CH3CN
流速4ml/min
检测波长203nm进样量1ml样液浓度约10mg/ml，色谱图如图2。
3、Rg1的制备
色谱柱：Prep Nova_pakR HR C18 6um 7.8×300mmHPLC column
流动相20％CH3CN
流速4ml/min
检测波长203nm进样量1ml样液浓度约10mg/ml，色谱图如图3。
4、Rc的制备
色谱柱：Prep Nova_pakR HR C18 6um 7.8×300mmHPLC column
流动相28％CH3CN
流速4ml/min
检测波长203nm进样量1ml样液浓度约10mg/ml，色谱图如图4。
5、Re、Rd的制备
色谱柱：Prep Nova_pakR HR C18 6um 7.8×300mmHPLC column
流动相0-25min 25％CH3CN 25-55min 30％CH3CN
流速4ml/min
检测波长203nm进样量1ml样液浓度约10mg/ml，色谱图如图5。
三、收集液于水浴上浓缩后于冰箱(4℃)中冷却析晶，得各单体产品；
四、将单体分别装入瓶中，再将各单体组合为一套，而形成套装人参皂甙标准对照品。
Claims (1)
1.一种套装人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1标准对照品的分离制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(一)常压硅胶柱层析预纯化：
(1)样品的准备：取由人参的根或茎叶，用80％乙醇提取并经浓缩、树脂吸附净化得到的总皂甙含量大于50％的人参提取物；
(2)制备玻璃层析柱：采用100～200目层析硅胶为固定相，于120℃活化4-15小时，冷后以湿法装柱；装柱用的溶剂为氯仿∶甲醇∶水＝65～75∶35～25∶10；
(3)常压柱层析分离：将人参提取物用甲醇溶解后，与失活硅胶按提取物与硅胶重量比为4～8∶10范围内配制混合，蒸干溶剂后将固体部分研碎，装入制备好的玻璃层析柱柱头；
(4)用氯仿∶甲醇∶水＝65～75∶35～25∶10进行洗脱，洗脱流动相流速为5～15mL/min，各皂甙洗脱顺序为：Rb2、Rg1、Re、Rd、Rc、Rb1；
(5)分段收集洗脱液，各部分收集液蒸干后得中间产物，其中未分离的各单体主要以两种皂甙混合形式存在，即：Rb2+Rg1、Rg1+Re、Re+Rd、Rd+Rc、Rc+Rb1；
(二)等度高效制备色谱分离纯化：
(1)分离固定相为反相C18填料，流动相如下：Rb2与Rg1的分离采用20～35％乙腈，Rg1与Re的分离采用15～30％的乙腈，Re与Rd的分离采用20～35％的乙腈，而Rd与Rc、Rc与Rb1的分离采用25～40％的乙腈，洗脱流动相流速为4mL/min；
(2)同步采用紫外检测器于203nm监视流出曲线而指导产品收集；
(三)制备收集液于水浴上浓缩后于4℃冰箱中冷却析晶，得各单体产品；
(四)将单体分别装入瓶中，再将各单体组合为一套，形成套装人参皂甙标准对照品。
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