CN114539132B - 一种水热酸控醇提桑叶中dnj方法 - Google Patents

一种水热酸控醇提桑叶中dnj方法 Download PDF

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Abstract

一种水热酸控醇提桑叶中DNJ（1‑脱氧野尻霉素）方法，属于天然产物中活性成分提取技术领域。本发明以桑叶为原料，经原料预处理、水热酸催化同步处理桑叶、DNJ（1‑脱氧野尻霉素）产品制备，三步提取获得DNJ。为桑叶药用资源开发提供理论依据。本发明可广泛应用于桑叶中DNJ提取，还可用于生物质中高价值天然产物的提取，对提升桑叶利用价值具有重要现实意义。

Description

一种水热酸控醇提桑叶中DNJ方法
技术领域
本发明属于桑叶中DNJ提制技术领域，具体涉及水热反应下，柠檬酸调控醇浸提桑叶中DNJ方法。
背景技术
桑叶中富含桑叶多糖、生物碱、黄酮等多种天然活性物质，其中DNJ，即1-脱氧野尻霉素，属于生物碱，易溶解于水、乙醇、甲醇，具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抑制变异链球菌等药学活性，是降血糖、抑制肿瘤转移、抗HIV病毒等药物合成的重要原料。目前，DNJ提取方法主要有水提取法、乙醇提取法、超声提取法、酶提取法，存在得率不高、有机溶剂破坏环境、能耗大、提取时间长等问题。因此，寻找一种清洁、高效、操作方便的提取DNJ方法，对提高桑资源利用、满足民生健康需要具有经济价值和重要现实意义。
现有的DNJ提制方法如2020年12月11公开的公开号CN112062711A的“一种蛋白桑生产提取的DNJ的制备方法”，公开的方法是：先将桑叶粉末在常温下采用稀盐酸浸泡1-2h得浸泡液，然后将浸泡液输入反应池沉淀1-2h，反应池中设置超声波发生器，浸泡液沉淀的同时通过超声波进行扰动；用pH值为1的75％乙醇溶液做为提取液对上清液进行提取，采用膜分离技术从粗提液中富集DNJ，再经树脂纯化获得DNJ，该方法所得粗提液DNJ得率0.094％，纯度为25.6％。该专利的方法存在以下不足：（1）采用稀盐酸处理桑叶，生产过程使用盐酸（pH值=1），易对生产设备造成腐蚀作用，增加设备维护成本以及对盐酸的环境治理成本。（2）桑叶的处理先后经盐酸浸泡1-2h、超声波发生器处理1-2h，采用超声波发生器还需要特色设备，且技术要求高、能耗高，增加生产设备购置费和生产能耗费，从而增加生产成本。（3）采用75%乙醇溶液作为提取液，有机溶剂使用纯度比生产实际的高，使用膜过滤，生产需要的耗材多，增加生产成本与环境治理成本。
发明内容
本发明的目的是，针对现有桑叶中DNJ提取方法的不足，提供一种水热酸控醇提DNJ的方法，实现步骤少、操作简单、DNJ溶浸充分且得率高、有机溶剂使用量少、桑叶利用高、环境污染小等特点。
本发明的机理是：水热反应以水为反应介质，在反应釜密闭体系中，加热形成亚临界区，有利于水解离生成H+和OH-，水热反应辅以微量柠檬酸替代传统酸，加速氧化-还原势发生变化，促使半纤维素和纤维素中糖苷键在酸性或碱性条件下断裂；亚临界态下反应介质水既是溶剂又是矿化剂，还是压力传递介质，有利于难溶或不溶物质的溶解及传质，水热反应耦合强化酸催化氧化及热化学转化，加强生物质裂解或水解作用，减少细胞壁与细胞质间的传质屏障，提高DNJ等活性成分溶出能效。
实现发明目的的技术方案是：一种水热酸控醇提桑叶中DNJ的方法，以桑叶粉为原料，经原料预处理、水热酸催化同步处理桑叶、DNJ产品制备的简单工艺而得到DNJ产品。所述方法的具体步骤如下：
（1）原料预处理
以桑叶（包括桑鲜叶、废次桑叶、桑叶加工过程中的下脚料）为原料。先将原料用水清洗干净后，再放置于85～110℃的烘箱中烘30～90min，然后经粉碎机粉碎、过60～100目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料，即为预处理后的原料。
（2）水热酸催化同步处理桑叶
第（1）步骤完成后，先称取第（1）步骤所得到预处理原料2g置于水热反应釜中，再按照原料的质量（g）：酸溶液的体积（ml）之比为1:10～20的比例加入柠檬酸和乙醇水溶液，搅拌均匀后密封反应釜，接着将水热反应釜放入温度为70～190℃鼓风干燥箱内反应60～140min，然后将反应釜从烘箱中取出，冷却至室温，将反应液抽滤后定容至50ml倒入离心管中，在离心转速为2000～3000r/min条件下，进行离心10～20min，收集离心清液，即DNJ提取液，DNJ得率为0.14～2.07mg/g。所述柠檬酸质量分数为0.5～1%，乙醇溶液为体积分数为50～70%的乙醇水溶液。
（3）DNJ产品制备
第（2）步骤完成后，先将第（2）步骤所得到的DNJ提取液进行浓缩，再将浓缩液加入半制备型液相色谱仪，在保留时间为7.051～15.893min时段收集馏分，即DNJ馏分；然后DNJ馏分经冰箱冷冻、冷冻干燥仪冷冻干燥得固体，即DNJ单体，纯度为14.92～74.97%。所述半制备型液相色谱条件为：色谱柱（C18-8）；流动相：甲醇：水(20:80～40:60)；进样量：5～10mL；流速:10～20mL/min。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果﹕
（1） 本发明采用水热酸控浸提桑叶DNJ，利用水热反应协同柠檬酸，耦合强化生物质裂解及水解作用，促使桑叶半纤维素和纤维素中糖苷键在酸性或碱性条件下断裂，减少DNJ等活性成分传质助力，有利于DNJ溶浸充分且稳定，DNJ得率高达0.14～2.07mg/g、纯度达14.92～74.97%，有效提升桑叶利用率。
（2） 本发明采用水热反应与柠檬酸催化协同降解植物组织，操作简单，有机溶剂使用量少、DNJ得率高、环境污染小等特点，减少传统酸使用对设备及环境污染的影响，提高DNJ生产安全性能，又降低生产成本。
（3）本发明以桑叶为原料，易得，提取方法操作步骤简单、绿色环保，还可提取白芦藜醇等其他活性成分，对实现桑叶资源化利用、高值转化具有重要现实意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明 ：
实施例1：
一种水热酸控醇提桑叶中DNJ方法具体步骤如下：
（1）原料预处理
以桑叶（包括桑鲜叶、废次桑叶、桑叶加工过程中的下脚料）为原料。先将原料用水清洗干净后，再放置于100℃的烘箱中烘60min，然后经粉碎机粉碎、过60目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料，即为预处理后的原料。
（2）水热酸催化处理桑叶
第（1）步骤完成后，先称取第（1）步骤所得到预处理原料2g置于水热反应釜中，再按照原料的质量（g）：酸溶液的体积（ml）之比为1:20的比例加入柠檬酸和乙醇水溶液，搅拌均匀后密封反应釜，接着将水热反应釜放入温度为100℃鼓风干燥箱内反应60min，然后将反应釜从烘箱中取出，冷却至室温，将反应液抽滤后定容至50ml倒入离心管中，在离心转速为3000r/min条件下，进行离心20min，收集离心清液，即DNJ提取液，DNJ得率为2.07mg/g。所述柠檬酸质量分数为1%，乙醇溶液为体积分数为50%的乙醇水溶液。
（3）DNJ产品制备
第（2）步骤完成后，先将第（2）步骤所得到的的DNJ提取液进行浓缩，再将浓缩液加入半制备型液相色谱仪，在保留时间为7.051min时段收集馏分，即DNJ馏分；然后DNJ馏分经冰箱冷冻、冷冻干燥仪冷冻干燥得固体，即DNJ单体，纯度为74.97%。所述半制备型液相色谱条件为：色谱柱（C18-8）；流动相：甲醇：水(40:60)；进样量：10mL；流速:20mL/min。
实施例2：
一种水热酸控醇提桑叶中DNJ方法，同实施例1，其中：
第（1）步中，烘箱温度为110℃，烘箱时间为30min，桑叶目数为80目。
第（2）步中，原料的质量（g）：酸溶液的体积（ml）之比为1:10，反应温度为80℃，反应时间为100 min， 离心转速为2000r/min，DNJ得率为0.54mg/g，柠檬酸质量分数为0.75%，乙醇溶液体积分数为60%。
第（3）步中，保留时间为10.235min，DNJ单体纯度达41.0%，流动相：甲醇：水(30:70)，进样量：8mL，流速:15mL/min。
实施例3
一种水热酸控醇提桑叶中DNJ方法，同实施例1，其中：
第（1）步中，烘箱温度为85℃，烘箱时间为90min，桑叶目数为100目。
第（2）步中， 原料的质量（g）：酸溶液的体积（ml）之比为1:15，反应温度为70℃，反应时间为50 min， 离心时间为10min，DNJ得率为0.89mg/g，柠檬酸质量分数为0.5%，乙醇溶液体积分数为70%。
第（3）步中，保留时间为15.893min，DNJ单体纯度达14.92%，流动相：甲醇：水(20:80)，进样量：5mL，流速:10mL/min。
实验结果
1.水热体系下不同水热温度对DNJ制备得率的比较
2.水热体系下不同柠檬酸浓度对DNJ制备得率的比较
3.水热体系下不同水热时间对DNJ制备得率的比较
4.水热体系下不同原料质量与酸溶液体积比对DNJ制备得率的影响
从上述实验知：本发明采用水热酸控醇提桑叶中DNJ，当烘箱温度为100℃，烘箱时间为60min，桑叶目数为60目，原料质量（g）：酸溶液体积（ml）之比为1:20，反应温度为100℃，反应时间为60 min， 离心转速为3000r/min，离心时间为20min，柠檬酸质量分数为1%，乙醇溶液体积分数为50%，DNJ得率为2.07mg/g，其纯度为74.97%,得率是传统化学提取方法的4倍；且用柠檬酸替代稀盐酸，制备条件温和，操作简单，DNJ产品得率高，该方法不仅避免酸碱对生产设备的腐蚀，而且减少生产过程中酸碱及有害有机物对环境造成的二次污染，同时避免了使用反应沉淀池和超声波。

Claims (1)

1.一种水热酸控醇提桑叶中DNJ方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料预处理
以鲜桑叶为原料，先将原料用水清洗干净后，再放置于100℃的烘箱中烘60min，然后经粉碎机粉碎、过60目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料，即为预处理后的原料；
(2)水热酸催化同步处理桑叶
第(1)步骤完成后，先称取第(1)步骤所得到预处理原料2g置于水热反应釜中，再按照原料的质量g：酸溶液的体积ml之比为1:20的比例加入柠檬酸和乙醇水溶液，搅拌均匀后密封反应釜，接着将水热反应釜放入温度为100℃鼓风干燥箱内反应60min，然后将反应釜从烘箱中取出，冷却至室温，将反应液抽滤后定容至50ml倒入离心管中，在离心转速为3000r/min条件下，进行离心20min，收集离心清液，即DNJ提取液，即1-脱氧野尻霉素提取液，DNJ得率为2.07mg/g，所述柠檬酸质量分数为1％，乙醇溶液为体积分数为50％的乙醇水溶液；
(3)DNJ产品制备
第(2)步骤完成后，先将第(2)步骤所得到的的DNJ提取液进行浓缩，再将浓缩液加入半制备型液相色谱仪，在保留时间为7.051min时段收集馏分，即DNJ馏分，然后DNJ馏分经冰箱冷冻、冷冻干燥仪冷冻干燥得固体，即DNJ单体，纯度为74.97％，所述半制备型液相色谱条件为：色谱柱C18-8；流动相：甲醇：水=40:60；进样量：10mL；流速：20mL/min。
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