CN103755623A - 一种响应面法优化的酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法 - Google Patents

一种响应面法优化的酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种响应面法优化的酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）的方法，本发明方法用酸性乙醇溶液作为提取溶媒提取桑叶1-DNJ，利用响应面法对提取条件进行优化，得到最佳提取条件为液料比为25，即25mL提取溶媒/g桑叶粗粉，在80℃条件下浸提2.7h，重提1次，滤液经纯化、浓缩后得1-DNJ提取液；本发明方法可获得约0.2%的桑叶1-DNJ提取率，显著高于传统的乙醇提取率0.00139%，及稀酸提取效率0.00147%，说明稀酸和乙醇在浸提桑叶1-DNJ中发生了协同作用，产生了不可预见的效果，为桑叶1-DNJ产品的在医药和保健品方面的开发利用提供理论支持和技术指导。

Description

一种响应面法优化的酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种提取1-脱氧野尻霉素的方法，具体涉及一种响应面法优化的稀酸乙醇提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，属于植物提取技术领域。 
背景技术
桑叶1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)是从桑树(Morus alba L.)中发现的一种天然哌啶类小分子水溶性生物碱，分子量为163.7。作为强效的糖代谢酶抑制剂(比如α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等)，DNJ可显著延缓多糖的降解过程，可降低餐后血糖的峰值，稳定空腹血糖。此外，DNJ还有胰岛素增敏的作用，改善胰岛素抵抗。 
桑叶1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)属于哌啶类小分子水溶性生物碱，因此现有文献多以去离子水提取法、溶剂提取法和酸提取法，而且提取效率低、成本高。溶剂提取主要采用乙酸乙酯、乙醇和石油醚等溶剂分部提取；而酸提取法主要采用稀盐酸和稀硫酸提取桑叶中的1-脱氧野尻霉素。文件CN102675188A中公开乙醇提取率(1-脱氧野尻霉素的提取量×100％／所用桑组织的质量)为0.00139％，蒸馏水提取法提取率0.00121％，稀酸提取效率为0.00147％。因此，桑树中1-脱氧野尻霉素提取效率较低成为1-脱氧野尻霉素制备的瓶颈问题。在有关桑叶1-DNJ提取方法的文献中不也有以传统的煎煮法、回流提取法及超生波辅助提取法等。然而，煎煮法会使1-DNJ结构被破坏，降低其生物利用度；回流法及超声波辅助提取法则有工艺复杂，不利于大规模工业生产等缺点。目前的这些提取方法很难满足人们对1-DNJ的需求。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种响应面法优化的稀酸乙醇提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法。 
本发明所采取的技术方案是： 
一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，包括以下步骤： 
1)取体积浓度为40～70％的乙醇溶液并调节pH值为2～7作为提取溶媒，加入桑叶粗粉，混匀，使液料比为10～30，即10～30mT提取溶媒/g桑叶粗粉，在70～90℃条件下浸提1.5～3h，抽滤，分别得1-DNJ初步提取液和桑叶滤渣； 
2)将桑叶滤渣按步骤1)重复浸提1～4次，将每次所得1-DNJ初步提取液混合； 
3)将混合的1-DNJ初步提取液进行减压浓缩，离心，收集上清液，抽滤，收集滤液； 
4)再将滤液用超纯水稀释至体积为提取溶媒的0.03～0.1倍，再经纯化，减压浓缩，即得桑叶1-DNJ提取液。 
进一步的，一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，通过响应面法优化后，包括以下步骤： 
1)取体积浓度为66.5％的乙醇溶液并调节pH值为6.7作为提取溶媒，加入桑叶粗粉，混匀，使液料比为25，即25mL提取溶媒/g桑叶粗粉，在80(条件下浸提2.7h，抽滤，分别得1-DNJ初步提取液和桑叶滤渣； 
2)将桑叶滤渣按步骤1)重复浸提1次，将2次所得1-DNJ初步提取液混合； 
3)将混合的1-DNJ初步提取液进行减压浓缩，离心，收集上清液，抽滤，收集滤液； 
4)再将滤液用超纯水稀释至体积为提取溶媒的0.04倍，再经纯化，减压浓缩，即得桑叶1-DNJ提取液。 
进一步的，上述所有调节pH用到的调节剂选自盐酸、硫酸和醋酸。 
进一步的，上述所有离心为：4500～5500rpm离心13～18min。 
进一步的，上述所有纯化的具体过程为：将溶液用732H型阳离子交换树脂纯化富集，除去中性及酸性成分，去离子水清洗离子交换柱，洗至流出液至无色后，用体积比为7：3的氨水和乙醇混合液开始洗脱，收集洗脱液。 
进一步的，上述在所述的响应面法优化过程中，设置乙醇浓度、pH值、浸提时间3个变量，并利用DesignExpert7.1.6软件根据Box-Behnken设计原则进行优化。 
本发明的有益效果是： 
本文充分考虑了以上因素，优化了桑叶1-DNJ提取工艺参数，非常具有实用价值，也为桑叶降糖成分1-DNJ在医药、保健品等领域的研究开发打下了夯实的基础，提供了可靠的依据，更为糖尿病的治疗研究提供了新思路、新方法。 
本文结合1-DNJ结构及现有提取方法，首次采用稀酸乙醇溶液浸提桑叶中1-DNJ，为开发桑叶1-DNJ降血糖提供新的提取途径，在单因素试验基础上，以1-DNJ提取率为指标，采用响应面分析法(Response Surface Methodology)优化提取工艺，确定最佳提取条件，获得约0.2％的桑叶1-DNJ提取率，显著高于传统的乙醇提取率0.00139％，及稀酸提取效率0.00147％，说明稀酸和乙醇在浸提桑叶1-DNJ中发生了协同作用，产生了不可预见的效果，为桑叶1-DNJ产品的在医药和保健品方面的开发利用提供理论支持和技术指导。 
附图说明
图1为1-DNJ的标准曲线； 
图2为1-DNJ标准品HPLC-ELSD检测色谱图； 
图3为桑叶中1-DNJ HPLC-ELSD检测色谱图； 
图4为浸提时间对1-DNJ提取率的影响； 
图5为乙醇浓度对1-DNJ提取率的影响； 
图6为pH值对1-DNJ提取率的影响； 
图7为液料比对1-DNJ提取率的影响； 
图8为乙醇浓度及浸提时间对1-DNJ提取量的等高线(A)和响应面(B)； 
图9为乙醇浓度及pH值对1-DNJ提取量的等高线(A)和响应面(B)； 
图10为浸提时间及pH值对1-DNJ提取量的等高线(A)和响应面(B)。 
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于止。 
实施例1： 
一、1-DNJ的标准曲线及HPLC-ELSD检测图谱 
1)标准曲线绘制 
精密称取1-DNJ标准品3.56mg至50mL容量瓶中，利用超纯水溶解配制成含量为71.2μg·mL-1的母液，进样量分别为5μL，10μL，20μL，30μL，40μL，根据质量和峰面积的关系制作标准曲线。以标准品1-DNJ标准溶液质量X-对峰面积Y-进行线性回归，所得的回归方程为Y=624.56X-112.74，R2=0.9991，在0.356～2.848μg·mT-1范围内质量浓度与峰面积呈良好线性关系(见图1)。 
2)高效液相色谱蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测图谱 
用HCl调节乙醇溶液的pH约为6.5作为提取溶媒，精确称取10.0g桑叶粗粉加入提取溶媒中，置于80℃恒温水浴浸提两次，抽滤，合并滤液并浓缩，后于5000r·min-1离心约15min，收集上清液，抽滤，定容至10mL。用732H型阳离子交换树脂纯化富集，除去中性及酸性成分，去离子水洗至无色后用氨水／乙醇(70：30)溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩除去氨水／乙醇，用去离子水定容至5ml容量瓶中，精密量取1ml用去离子水定容至25ml容量瓶，0.45μm滤头过滤，备用，待HPLC-ELSD检测。 
色谱条件：色谱柱为DIKMA Platisil NH2(4.6mm×250mm，5μm)；流动相(乙腈-水=90：10)；流速为1.0ml·min-1;ELSD漂移管温度40℃；载气流速3.5×105Pa。分析 软件为：DesignExpert7.1.6，外标法分析计算。 
因为蒸发光检测器的特殊性，计算浓度不可用一般的紫外检测，峰面积-含量函数直接计算。样品中1-DNJ含量计算公式为，log A=b log m+log a。 
图2和图3分别为1-DNJ标准品及桑叶中1-DNJ的HPLC-ELSD检测图谱，从图中可看出样品中1-DNJ保留时间为7min，并且基线较平稳。说明通过HPLC-ELSD检测方法稳定可行。 
二、单因素实验 
在本试验中，分别选取浸提时间、乙醇浓度、pH值及液料比4个因素作为影响桑叶1-DNJ提取率的研究对象。选取时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5和3.0h；选取乙醇体积浓度为30％，40％，50％，60％和70％；选取pH值分别为：1，2，3，4，5，6和7；液料比为10，15，20，25和30ml提取溶媒/g粗粉。观察各因素对桑叶1-DNJ提取率的影响，每个样品重复3次。本文中所述的提取溶媒均为经HCl调节至一定pH值的乙醇溶液。 
1)浸提时间对桑叶1-DNJ提取率的影响 
在乙醇浓度为70％、pH值为7、液料比为20ml提溶媒／g桑叶粗粉、温度为80℃的条件研究较优的提取时间，分别选取提取时间1.0，1.5，2.0，2.5和3.0h。 
从图4可以看出，桑叶的1-DNJ质量分数随着浸提时间增加而逐渐增高，当浸提时间为2.1h时，桑叶1-DNJ提取率达到最高为0.1674％；但随着浸提时间的增加，1-DNJ含量反而减少。因此，浸提时间为2.0h较适宜。 
2)乙醇浓度对桑叶1-DNJ提取率的影响 
在浸提时间为2.0h、、pH值为7、液料比为20ml提溶媒/g桑叶粗粉、温度为80(研究较优的乙醇浓度，分别选取乙醇体积浓度为30％，40％，50％，60％和70％。 
从图5可以看出，桑桑叶的1-DNJ质量分数随着乙醇浓度增加而逐渐增高，当乙醇浓度为60v／v％时，桑叶1-DNJ质量分数逐渐平稳，当乙醇浓度达到70v／v％时，桑叶1-DNJ提取率最高为0.1713％。因此，乙醇浓度为65～70v／v％较适宜。 
3)pH值对桑叶1-DNJ提取率的影响 
在浸提时间为2.0h、乙醇体积浓度为70％、液料比为20ml提溶媒／g桑叶粗粉、温度为80℃的条件研究较优的pH值，分别选取pH值为1，2，3，4，5，6和7。 
从图6可以看出，桑叶的1-DNJ质量分数随着pH值降低而逐渐增高，当pH值为6时，桑叶1-DNJ质量分数达到最高为0.1598％；但随着pH值的降低，1-DNJ含量反而减少。因此，pH值为6较适宜。 
4)液料比对桑叶1-DNJ提取率的影响 
在浸提时间为2.0h、pH值为7、乙醇体积浓度为70％、温度为80℃的条件研究较优的液料比，分别选取液料比为10，15，20，25和30ml提取溶媒/g桑叶粗粉。 
从图7可以看出，桑叶的1-DNJ质量分数随着液料比升高而逐渐增高，当液料比为25即25mL提取溶媒／g桑叶粗粉时，桑叶1-DNJ质量分数达到最高为0.1600％；但随着液料比的升高，1-DNJ含量反而减少。因此，液料比为25较适宜，但液料比对桑叶1-DNJ提取效果的影响不显著。 
三、响应面法优化桑叶中1-DNJ的提取工艺 
根据单因素实验结果，选取对桑叶1-DNJ提取效果影响较显著的3个因素，利用DesignExpert7.1.6软件根据Box-Behnken设计原则设计试验，并对所得数据进行分析。 
1)响应面分析因素水平的选择 
根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇浓度、浸提时间和pH值3个因素，分别以A，B和C表示。而对桑叶1-DNJ提取效果影响不显著的液料比，统一选择提取效果较好的液料比25(即25ml提取溶媒／g桑叶粗粉)。以单因素试验结果的最适条件作为中水平，即0水平，高水平与低水平选择与中水平接近的数值，试验因素水平设计见表1。 
表1因素A(乙醇浓度，v／v)、B(浸提时间)和C(pH值)的值与相应水平 
Figure BDA0000452986520000051
以A，B和C为自变量，以桑叶1-DNJ得率为响应值Y，设计试验方案，相应的结果见表2。试验1～17组中的3，5，6，7，11组是0点，其余为析因点。 
2)模型的建立和统计分析 
根据所得数据应用Design Expert7.1.6软件进行多元回归分析，得到响应变量(乙醇浓度A，提取液料比B，pH值Ｃ）与响应值(Ｙ，桑叶1-DNJ得率)之间的多元二次回归方程。 
Y=-0.25784+0.027284A+0.48230B+0.63701C+6.04000*1０－3AB-6.99750*10-3AC-0.11920BC-1.91375*10-4A2-0.13305B2+0.017912C２
回归模型方差分析见表2。回归方程方差分析可见，实验所选用的模型著(P值<5％即可)。缺拟项相对于纯差不显著(P>5％)说明模式可靠；乙醇浓度、浸提时间、pH值三者 对提取效果影响的显著性为：A>B>C，即乙醇浓度>浸提时间>pH值。表2Box-Behnken响应面试验设计及结果 
实验编号 A B C 1-DNJ含量(‰)
1 1 1 0 1.8827
2 0 1 1 1.7576
3 0 0 0 1.8821
4 1 0 -1 2.0037
5 0 0 0 1.8391
6 0 0 0 1.8829
7 0 0 0 1.8844
8 1 0 1 1.8637
9 -1 0 1 1.8946
10 0 -1 -1 1.8533
11 0 0 0 1.8805
12 -1 0 -1 1.7547
13 0 -1 1 1.9358
14 1 -1 0 1.8812
15 -1 1 0 1.7144
16 -1 -1 0 1.8337
17 0 1 -1 1.9135
注：实验因素A、B、C分别表示即乙醇浓度、浸提时间、pH值。表3回归模型方差分析 
Figure BDA0000452986520000061
Figure BDA0000452986520000071
3)试验结果分析与优化 
应用Design Expert7.1.6软件在回归方程的基础上绘制响应面及等高线(如图8～10)。若等高线为椭圆，则表明此2因素交互作用明显，若为圆形，则表明交互作用不明显。 
由图8可得，当pH值为2时，乙醇浓度与浸提时间2个因素之间的交互作用见图8。桑叶1-DNJ提取率随着乙醇浓度的增加和浸提时间的增加而增加，但当乙醇浓度达到60％后，1-DNJ含量开始减少，并且从图8B的响应趋势可以看出：乙醇浓度为60％、浸提时间为2.5h时，提取的1-DNJ较多。 
由图9可得，当浸提时间为2.5h时，乙醇浓度与pH值2个因素之间的交互作用见图9。桑叶1-DNJ提取率随着pH值的降低和乙醇浓度的增加而增加，但当乙醇浓度达到60％后，1-DNJ含量开始减少，并且从图9B的响应趋势可以看出：乙醇浓度比pH值对提取效率的影响更大；乙醇浓度为60％、pH值为2时，1-DNJ提取率则较高。 
由图10可得，当乙醇浓度为60％时，浸提时间与pH值2个因素之间的交互作用见图10。桑叶1-DNJ提取率随着pH值的降低和浸提时间的增加而增加，但当pH值达到2后，1-DNJ含量开始减少，并且从图10B的响应趋势可以看出：浸提时间比pH值对提取效率的影响更大；浸提时间为2.5h、pH值为2时，1-DNJ提取量达到最高值。 
4)最佳提取工艺的确定 
由Box-Behnken模型分析，桑叶1-DNJ提取优化工艺参数为：乙醇浓度66.53％、pH值为6.66，浸提时间2.73h。在此最优条件下，桑叶1-DNJ提取量预测值为0.100％。为验证该模型的可靠性，实际测得桑叶1-DNJ的含量与模型预测值相差小于1％，说明该模型可以应用于桑叶1-DNJ提取的优化。 
实施例2 
响应面法优化的桑叶1-DNJ的提取方法 
1)取体积浓度为66.5％的乙醇溶液，并用HCl调节pH值为6.7作为提取溶媒，加入10g桑叶粉未，使液料比为25，即25ml提取溶媒／g桑叶粗粉，置于80℃恒温水浴浸提2.7h，抽滤，分别得1-DNJ初步提取液和桑叶滤渣； 
2)将桑叶滤渣按步骤1)重复浸提1次，将2次所得1-DNJ初步提取液混合； 
3)将混合的1-DNJ初步提取液混合通过旋转蒸发浓缩，然后5000rpm离心约15min，收集上清液，抽滤，收集滤液； 
4)将滤液用超纯水稀释至体积为提取溶媒的0.04倍，用732H型阳离子交换树脂纯化富集，除去中性及酸性成分，去离子水清洗离子交换柱，洗至流出液为无色后，用体积比为7：3的氨水和乙醇混合液开始洗脱，收集洗脱液，减压浓缩除去氨水和乙醇，得浓缩液，即桑叶1-DNJ的提取液； 
5)桑叶1-DNJ的提取率：用去离子水将上述浓缩液定容至5ml容量瓶中，精密量取1ml用去离子水定容至25ml容量瓶，经0.45μm的滤头过滤，将滤液经HPLC-ELSD检测，根据检测结果计算桑叶1-DNJ的提取率为0.1946％。 
本发明方法获得的1-DNJ的提取率高达0.1946％，明显高于现有酸水提取工艺(马静，万志平，正交优化桑叶中1-脱氧野尻霉素酸水提取的工艺[J]；食品研究与开发；2010(31)10：36-38)的提取率0.062％，且本发明方法稳定，多次重复提取实验，均可获得约0.2％的桑叶1-DNJ提取率。 

Claims (6)

1.一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取体积浓度为40～70%的乙醇溶液并调节pH值为2～7作为提取溶媒，加入桑叶粗粉，混匀，使液料比为10～30，即10～30mL提取溶媒/g桑叶粗粉，在70～90℃条件下浸提1.5～3h，抽滤，分别得1-DNJ初步提取液和桑叶滤渣；
2）将桑叶滤渣按步骤1）重复浸提1～4次，将每次所得1-DNJ初步提取液混合；
3）将混合的1-DNJ初步提取液进行减压浓缩，离心，收集上清液，抽滤，收集滤液；
4）再将滤液用超纯水稀释至体积为提取溶媒的0.03～0.1倍，再经纯化，减压浓缩，即得桑叶1-DNJ提取液。
2.一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：通过响应面法优化后，包括以下步骤：
1）取体积浓度为66.5%的乙醇溶液并调节pH值为6.7作为提取溶媒，加入桑叶粗粉，混匀，使液料比为25，即25mL提取溶媒/g桑叶粗粉，在80℃条件下浸提2.7h，抽滤，分别得1-DNJ初步提取液和桑叶滤渣；
2）将桑叶滤渣按步骤1）重复浸提1次，将2次所得1-DNJ初步提取液混合；
3）将混合的1-DNJ初步提取液进行减压浓缩，离心，收集上清液，抽滤，收集滤液；
4）再将滤液用超纯水稀释至体积为提取溶媒的0.04倍，再经纯化，减压浓缩，即得桑叶1-DNJ提取液。
3.根据权利要求1和2所述的一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：所述调节pH用到的调节剂选自盐酸、硫酸和醋酸。
4.根据权利要求1和2所述的一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：所述离心为：4500～5500rpm 离心13～18 min。
5.根据权利要求1和2所述的一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：所述纯化的具体过程为：将溶液用732H型阳离子交换树脂纯化富集，除去中性及酸性成分，去离子水清洗离子交换柱，洗至流出液至无色后，用体积比为7：3的氨水和乙醇混合液开始洗脱，收集洗脱液。
6.根据权利要求2所述的一种酸性乙醇溶液提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于：在所述的响应面法优化过程中，设置乙醇浓度、pH值、浸提时间3个变量，并利用DesignExpert7.1.6软件根据Box-Behnken设计原则进行优化。
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