CN116283728A - 一种桑叶1-dnj的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及桑叶资源化利用技术领域，具体公开了一种桑叶1‑DNJ的高效提取方法，其包括以下步骤：(1)取桑叶进行紫外辐射预处理；(2)将处理后的桑叶进行粉碎，得到桑叶粉；(3)将步骤(2)得到的桑叶粉进行超临界萃取处理；(4)步骤(3)得到的萃余物经分离纯化，得到1‑DNJ水溶液。本发明所述的桑叶1‑DNJ的提取方法可简单、高效地实现桑叶中有效成分1‑DNJ的提取，且提取过程未引入有害有机溶剂，提取出的桑叶有效成分可用于食品、药品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及桑叶资源化利用技术领域，尤其是涉及一种桑叶1-DNJ的高效提取方法。
背景技术
1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)系强效α-葡萄糖苷酶抑制剂。1-DNJ可以有效抑制人体糖分的转化，降低血液中的糖含量，降低空腹血糖和餐后血糖的升高效果优于磺脲类药物，发生低血糖及其它副作用的可能性远低于其它降血糖药物，安全性非常高；而且使用1-DNJ可以不改变正常的饮食结构，是一种非常便捷、安全的降血糖成分；同时1-DNJ还具有优良的抗病毒、抗肿瘤转移等多种生物活性。
目前，1-DNJ的获取通常来自桑科植物桑的枝、叶、根中，尤其是桑叶独具的生长性和易加工性，常被作为1-DNJ提取的首选原料。现有技术中对1-DNJ的提取所采用的桑叶，在初处理时常将其粉碎为粉末状，然后采用水提、有机溶剂浓缩、树脂柱层析提高纯度等工艺步骤从桑叶中获得1-DNJ。上述技术方案中存在的缺陷是，(1)桑叶的机械粉碎难以将桑叶细胞壁破损，或者桑叶细胞壁实际破损率不高，而1-DNJ等有效成分普遍存在于桑叶细胞壁内的胞液中，在桑叶细胞壁破损率较低的情况下内部有效成分难以溶出，因此1-DNJ的提取率/实际得率并不高；(2)提取分离1-DNJ的柱层析提纯过程需要使用大量有机溶剂比如乙醇、氨水或甲醇进行洗脱，后续工艺涉及含大量有机溶剂洗脱液的处理、提取液的浓缩等，更重要的是，提取过程也会不可避免地使用较多的有机溶剂，影响高生物活性的药用终产物1-DNJ的安全性；(3)浓缩后得到的是成分复杂、1-DNJ含量较低的水溶性桑叶水溶性复合提取物，而且由于有机溶剂的使用，难以直接作为以1-DNJ为主体的有效活性原料。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种桑叶1-DNJ的高效提取方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，其包括以下步骤：
(1)取桑叶进行紫外辐射预处理；
(2)将处理后的桑叶进行粉碎，得到桑叶粉；
(3)将步骤(2)得到的桑叶粉进行超临界萃取处理；
(4)步骤(3)得到的萃余物经分离纯化，得到1-DNJ水溶液。
进一步地，步骤(1)中所述的紫外辐射预处理为，采用280--320nm的中波UV-B对桑叶进行辐射，处理时间30-60min，辐射结束后，置于暗处静置10-20h。
进一步地，步骤(2)中所述的桑叶粉为50-150目的桑叶粉。
进一步地，步骤(3)中所述的超临界萃取处理为，将步骤(2)得到的桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速1-3ml/min，萃取温度35-50℃，萃取压强30-45MPa，萃取时间1-3h；分离釜1的压强设置为7-9MPa，分离釜2的压强设置为3-5MPa。
进一步地，步骤(4)中所述的萃余物的分离纯化工艺，包括以下步骤：
a)从萃取釜取出桑叶粉，加入20-30倍的蒸馏水，于60-80℃提取1-2h，提取2-3次；
b)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
c)加入选择性去杂沉降剂，搅拌后于30-35℃静置2-4h，然后离心、抽滤，取沉淀；
d)用HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
e)加入三氯化铁络合沉淀；
f)离心除去沉淀，即可得到1-DNJ水溶液。
进一步地，所述的选择性去杂沉降剂为0.8-1.2mg/ml的管仲溶液。
进一步地，所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法所得桑叶1-DNJ提取率为0.50-0.60％，固体1-DNJ产品得率为1-3％，纯度为25-40％。
本申请采用紫外线辐射的方法对桑叶进行预处理，然后通过超临界萃取与分离纯化等方法提取桑叶中的以1-DNJ为主体的有效活性成分。其中：
紫外辐射预处理可以促进桑叶1-DNJ的合成；使桑叶细胞壁破损，有利于有效成分溶出。本申请采用的紫外辐射预处理为中波紫外辐射(UV-B，280-320nm)，其属于生物有效辐射，UV-B辐射穿透能力强，能量高，对新鲜桑叶的氮代谢造成一定影响。新鲜桑叶受到UV-B辐射时，体内能吸收紫外线的次生代谢产物如黄酮、生物碱等的含量会增加，对紫外辐射预处理后的新鲜桑叶进行适当的遮阴处理可以有效促进桑叶1-DNJ的合成；同时，在UV-B诱导下，桑叶的细胞壁和亚细胞结构会遭受严重的破坏，使内部胞液成分充分溶出；UV-B辐射处理可能会降低桑叶中叶绿素的含量，但对本申请的目标产物无显著不利影响。
超临界萃取可实现对桑叶粉的脱脂处理，促进后续1-DNJ的提取；超临界萃取处理可以促进脂质、色素等杂质的溶出，并进一步促进桑细胞的破壁，有利于后续的1-DNJ提取。
分离纯化处理工艺可以有效沉降去除桑叶提取液中的杂质，通过吸附沉降-解吸附的机理，有效去除有效成分提取液中的鞣质、脂质、蛋白等杂质，提高1-DNJ得率。桑叶水提液中除含有1-DNJ外，还含有蛋白质、多糖、鞣质、脂质等，其中1-DNJ结构带有叔氨基(如下图左所示)，在水溶液中电离带正电荷，而其他成分不带电荷。选择性去杂沉降剂管仲溶液中的管仲主要成分分子式含有多个苯酚结构(如下图右所示)，在水溶液中电离出H离子，使其本身带负电。将管仲溶液加入桑叶水提液中时，带负电的管仲主要成分与1-DNJ发生静电吸引而产生选择性沉降，其余物质则不会。将沉降物质离心收集，得到管仲与1-DNJ的混合物。调节其pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa，抑制其电离，从而解除了管仲与1-DNJ的电荷吸附作用，使其重新溶于水。然后加入三氯化铁，三价铁离子与管仲中的酚羟基配位络合而沉淀。除去沉淀，即可得到纯度较高的1-DNJ水溶液。
管仲除与1-DNJ发生静电选择性沉降外，还会与桑叶水提液中的其他不带电杂质与营养物质如脂质、蛋白质、多糖、黄酮等产生一定的物理吸附，导致少量的杂质与1-DNJ一起被沉降。但是由于此物理吸附作用力较小，被吸附的杂质含量较少，后续经过多次离心分离即可有效去除杂质，使最终得到的产品中物理吸附的杂质含量控制在5％以内。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果为：
本发明所述的桑叶1-DNJ的提取方法可简单、高效地实现桑叶中有效成分1-DNJ的提取，且提取过程未引入有害有机溶剂，提取出的桑叶有效成分可用于食品、药品等领域；提取过程中采用的紫外辐射预处理可促进桑叶1-DNJ的合成，同时对桑叶的细胞壁和亚细胞结构进行破坏，有利于胞内液体的充分溶出，提高1-DNJ的提取率/实际得率；所述的超临界萃取可促进桑叶粉的脱脂，以及桑细胞的进一步破壁，以利于后续1-DNJ的提取；所述的分离纯化处理可选择性沉降去除桑叶提取液中的杂质，得到纯度较高的1-DNJ产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地说明。
实施例1：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B(280-320nm，下同)对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间40min，辐射结束后，置于暗处静置20h；
(2)将处理后的桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)将250g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速2ml/min，萃取温度45℃，萃取压强35MPa，萃取时间1.5h，分离釜1的压强设置为7MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(4)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入20倍的蒸馏水，于70℃提取1.5h，提取3次；
(5)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(6)向提取液中加入0.8mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置3h，然后离心、抽滤，取沉淀，并重复3次；
(7)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
(8)加入0.01mol/L三氯化铁溶液至无沉淀产生，其中沉淀为三价铁离子与管仲中的酚羟基配位络合形成，下同；
(9)离心除去沉淀，重复3次，即可得到1-DNJ水溶液。
实施例2：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间30min，辐射结束后，置于暗处静置20h；
(2)将处理后的桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)将300g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速1ml/min，萃取温度40℃，萃取压强40MPa，萃取时间1h。分离釜1的压强设置为7MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(4)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入30倍的蒸馏水，于70℃提取1h，提取3次；
(5)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(6)向提取液中加入1.0mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置3h。然后离心、抽滤，取沉淀，并重复3次；
(7)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
(8)加入0.01mol/L三氯化铁溶液至无沉淀产生；
(9)离心除去沉淀，重复3次，即可得到1-DNJ水溶液。
实施例3：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间60min，辐射结束后，置于暗处静置15h；
(2)将处理后的桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)将300g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速1ml/min，萃取温度45℃，萃取压强40MPa，萃取时间3h。分离釜1的压强设置为9MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(4)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入30倍的蒸馏水，于80℃提取2h，提取3次；
(5)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(6)向提取液中加入1.2mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置2h。然后离心、抽滤，取沉淀，并重复3次；
(7)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
(8)加入0.01mol/L三氯化铁溶液至无沉淀产生；
(9)离心除去沉淀，重复3次，即可得到1-DNJ水溶液。
对比例1：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)将新鲜桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(2)将300g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速1ml/min，萃取温度40℃，萃取压强40MPa，萃取时间1h。分离釜1的压强设置为7MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(3)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入20倍的蒸馏水，于70℃提取1.5h，提取3次；
(4)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(5)向提取液中加入1.2mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置3h。然后离心、抽滤，取沉淀，并重复3次；
(6)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
(7)加入0.01mol/L三氯化铁溶液至无沉淀产生；
(8)离心除去沉淀，重复3次，即可得到1-DNJ水溶液；
(9)将1-DNJ水溶液浓缩干燥，即得1-DNJ粉末。
对比例2：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间30min，辐射结束后，置于暗处静置20h；
(2)将新鲜桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)桑叶粉中加入30倍的蒸馏水，于80℃提取2h，提取3次；
(4)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(5)向提取液中加入1.2mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置3h。然后离心、抽滤，取沉淀，并重复3次；
(6)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
(7)加入0.01mol/L三氯化铁溶液至无沉淀产生；
(8)离心除去沉淀，重复3次，即可得到1-DNJ水溶液；
(9)将1-DNJ水溶液浓缩干燥，即得1-DNJ粉末。
对比例3：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间60min，辐射结束后，置于暗处静置20h；
(2)将处理后的桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)将250g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速2ml/min，萃取温度45℃，萃取压强35MPa，萃取时间1.5h。分离釜1的压强设置为7MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(4)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入20倍的蒸馏水，于70℃提取1.5h，提取3次；
(5)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(6)向提取液中加入1.2mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置3h。然后离心、抽滤，取沉淀，离心1次；
(7)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
(8)加入0.01mol/L三氯化铁溶液至无沉淀产生；
(9)离心除去沉淀，重复3次，即可得到1-DNJ水溶液；
(10)将1-DNJ水溶液浓缩干燥，即得1-DNJ粉末。
对比例4：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间60min，辐射结束后，置于暗处静置20h；
(2)将处理后的桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)将250g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速2ml/min，萃取温度45℃，萃取压强35MPa，萃取时间1.5h。分离釜1的压强设置为7MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(4)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入20倍的蒸馏水，于70℃提取1.5h，提取3次；
(5)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(6)向提取液中加入1.2mg/ml管仲溶液，搅拌后于30℃静置3h。然后离心、抽滤，取沉淀，并重复3次；
(7)用0.1mol/L HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa，即可得到1-DNJ水溶液；
(8)将1-DNJ水溶液浓缩干燥，即得1-DNJ粉末。
对比例5：一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，具体步骤如下：
(1)采用中波UV-B对新鲜采摘桑叶进行紫外辐射预处理，处理时间60min，辐射结束后，置于暗处静置20h；
(2)将处理后的桑叶进行干燥粉碎，得100目桑叶粉；
(3)将250g桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速2ml/min，萃取温度45℃，萃取压强35MPa，萃取时间1.5h。分离釜1的压强设置为7MPa，分离釜2的压强设置为5Mpa；
(4)萃取结束后，从萃取釜取出桑叶粉，加入20倍的蒸馏水，于70℃提取1.5h，提取3次；
(5)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
(6)向提取液中加入1.0mg/ml壳聚糖溶液，搅拌后于25℃静置3h。然后离心、抽滤，取上清，并重复3次，得到1-DNJ水溶液；
(7)将1-DNJ水溶液浓缩干燥，即得1-DNJ粉末。
计算公式：
测试例：将实施例1-3及对比例1-5制备过程中得到的1-DNJ水提液、1-DNJ溶液和粉末产品进行测试，其提取率、得率、纯度、及所得粉末中蛋白质、多糖、黄酮等杂质含量如表1所示。
其中，1-DNJ测定：高效液相色谱法；
蛋白质测定：凯氏定氮法；
多糖、黄酮测定：分光光度法；
测试数据可得，实施例所得桑叶1-DNJ提取率均在0.50-0.60％之间，得率在1-2％之间，纯度在28-39％之间；实施例2的1-DNJ提取率较其他两组较低，是由于UV-B辐射时间较短，对桑叶细胞壁的破壁程度较弱，同时水提时间较短，造成1-DNJ的溶出不充分；实施例3得到最高的1-DNJ提取率和纯度，主要是由于UV-B辐射时间适宜，桑叶细胞壁破壁程度高，同时超临界萃取充分，对桑粉中杂质的去除效果较好，另外，管仲的用量适宜，对1-DNJ的纯化过程较彻底。
对比例1与实施例相比具有较低的1-DNJ提取率、得率和纯度，主要是因为未对桑叶进行UV-B辐射，桑叶细胞壁未经过破壁处理，影响了后续提取过程中1-DNJ的溶出；对比例2虽经过UV-B的破壁处理，但未经过超临界萃取脱脂除杂及对桑叶细胞壁/亚细胞结构的进一步破坏，也在一定程度影响了1-DNJ提取过程中的溶出，导致1-DNJ提取率降低；对比例3在得到1-DNJ粗提取液后，利用管仲絮凝的过程中只离心1次，导致与管仲进行物理吸附的杂质未充分解离，减弱了1-DNJ与管仲的结合强度，使1-DNJ提取率较实施例稍降低，并且由于最终得到的1-DNJ提取液中含有管仲物理吸附的杂质，导致产品的得率增高但纯度降低；对比例4在管仲絮凝并酸解后，未使用三氯化铁沉降管仲，导致得到的产品中含有大量管仲，因此产品得率增高，纯度降低；对比例5选用壳聚糖作为絮凝剂替换管仲，未得到与管仲相当的沉降效果，所得1-DNJ提取液中1-DNJ含量较低，因此1-DNJ提取率与得率较低。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改或等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取桑叶进行紫外辐射预处理；
(2)将处理后的桑叶进行粉碎，得到桑叶粉；
(3)将步骤(2)得到的桑叶粉进行超临界萃取处理；
(4)步骤(3)得到的萃余物经分离纯化，得到1-DNJ水溶液。
2.根据权利要求1所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的紫外辐射预处理为，采用280--320nm的中波UV-B对桑叶进行辐射，处理时间30-60min，辐射结束后，置于暗处静置10-20h。
3.根据权利要求1所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于：步骤(2)中所述的桑叶粉为50-150目的桑叶粉。
4.根据权利要求1所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于：步骤(3)中所述的超临界萃取处理为，将步骤(2)得到的桑叶粉置于超临界萃取釜中，以95％乙醇为夹带剂，夹带剂流速1-3ml/min，萃取温度35-50℃，萃取压强30-45M Pa，萃取时间1-3h；分离釜1的压强设置为7-9MPa，分离釜2的压强设置为3-5MPa。
5.根据权利要求1所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于：步骤(4)中所述的萃余物的分离纯化工艺，包括以下步骤：
a)从萃取釜取出桑叶粉，加入20-30倍的蒸馏水，于60-80℃提取1-2h，提取2-3次；
b)提取结束后，将提取液离心，抽滤，取上清液；
c)加入选择性去杂沉降剂，搅拌后于30-35℃静置2-4h，然后离心、抽滤，取沉淀；
d)用HCl溶解并调节沉淀pH至弱酸性，小于1-DNJ的pKa；
e)加入三氯化铁络合沉淀；
f)离心除去沉淀，即可得到1-DNJ水溶液。
6.根据权利要求5所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于：所述的选择性去杂沉降剂为0.8-1.2mg/ml的管仲溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法，其特征在于：所述的桑叶1-DNJ的高效提取方法所得桑叶1-DNJ提取率为0.50-0.60％，固体1-DNJ产品得率为1-3％，纯度为25-40％。
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