CN101020655A - 一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从桑叶中提取1一脱氧野尻霉素(DNJ)的方法,是通过在桑叶的提取液中加入无机酸酸化处理,经冷却除去杂质,再经过柱层析获得。可使桑叶提取物含量不低于10%。用本发明方法获得的桑叶提取物经动物实验证实,对正常小鼠无影响,而对糖尿病模型小鼠具有比较明显的降血糖作用,可在制备降低血糖的保健品中应用。本发明方法由于不需要加入絮凝剂,在降低成本、提高含量的同时保证了后处理过程中没有外源性的物质带入,在将酸化液浓缩后直接采用国产离子交换柱层析进行分离,大大降低了成本。本发明方法设计合理,操作简便,无需特殊设备,非常适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取领域,具体涉及一种桑叶有效成分的提取物及制备方法。
背景技术
桑叶在《本草图经》中谓之“神仙叶”,具有滋阴补血、疏风散热、益肝通气、降压利尿之功效。桑叶的药理作用在《本草纲目》、《本草求真》、《食疗本草》、《药茶和药露》、《中药方剂学》等书目中均有记载,日本古书《吃茶养生记》记载桑叶有改善“饮水病”(即糖尿病)的作用。由此可见,桑叶其药用价值及保健功能无沦在我国还是在国外具有悠久的历史渊源,为我们的开发利用提供了可靠的依据。
桑叶还是国家卫生部门批准的药食两用物品,其味苦、甘、寒,入肺经,煎汁代茶能止消渴。目前,尽管我国桑树资源极为丰富,但主要还是用作养蚕饲料,每年养蚕之余,都有不少桑叶被废弃.从未来发展趋势看,开发桑叶保健产品潜力巨大。桑叶中含有的1一脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin DNJ)是人体小肠绒毛上的多种α一糖苷酶抑制剂,能阻止淀粉分解成为葡萄糖,竞争性地阻断小肠粘膜细胞刷状缘内的麦芽糖酶和蔗糖酶等双糖水解酶,使摄食的多糖、寡糖和双糖消化成葡萄糖、果糖等单糖的吸收过程受到阻止,继而降低血糖浓度,对治疗糖尿病及其并发症具有一定治疗作用。
现有的桑叶1一脱氧野尻霉素(DNJ)提取方法主要有两种,CN1579445A的方法所获得的桑叶提取物1一脱氧野尻霉素的含量仅为1.0~3.0%,主要通过加入絮凝剂再经醇沉后获得;CN1430964A的方法获得了高含量的桑叶总碱及DNJ提取物,但工艺过程较繁琐,在前处理过程中需提取后先浓缩至提取液至比重1.12-1.20,再加入原生药量的1-5倍量水溶解,调节pH后再加入絮凝剂静置12小时,而后续的分离过程也在经过离子交换树脂除去杂质后,需将树脂倒出用碱闷置4h后再回流提取,步骤多,操作不便,工业化生产的成本高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足,提供一种更为简便合理的从桑叶中提取1一脱氧野尻霉素(DNJ)的方法,是用分离方法获得,可使桑叶提取物含量不低于10%的。
本发明的提取物制备方法通过以下步骤实现:
(1)将桑叶粉碎成粗粉,用8倍量或以上的水或含水的亲水溶剂加热提取2~3次,亲水溶剂可以是甲醇、乙醇、乙腈及丙酮,加热提取的温度在50~100℃之间,以回流提取效果最佳;
(2)将提取液合并后加入盐酸、硫酸、硝酸或磷酸中的一种酸化至pH1~3,在10~30℃之间冷却至沉淀完全,过滤或离心除去沉淀;
(3)滤液适当浓缩后通过阳离子交换树脂,用水或含水的亲水溶剂洗至无色后,再用碱性甲醇或乙醇水溶液洗脱至近无色,其中的碱可以为氨水、二乙氨、三乙氨,碱的浓度为10%~50%,水溶液中甲醇或乙醇的浓度为10%~95%;阳离子交换树脂的型号为001×1.1;001×7;001×14.5或D151型。
(4)收集碱性甲醇或乙醇水溶液的洗脱液,浓缩成浸膏或喷雾干燥,即可得到1-脱氧野尻霉素的含量不低于10%的桑叶提取物。
用本发明方法获得的这种桑叶提取物,可以加入药剂学允许的赋形剂制备成药物制剂,制剂形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、气雾剂、喷雾剂。
用本发明方法获得的桑叶提取物1-脱氧野尻霉素(DNJ),可在制备降低血糖的保健品中应用,经动物实验证实,对正常小鼠无影响,而对糖尿病模型小鼠具有比较明显的降血糖作用。
本发明的有益之处是:提出了在提取过程中进行酸化处理,后冷却除去杂质的步骤具有重要作用,由于不需要加入絮凝剂,在降低成本、提高含量的同时保证了后处理过程中没有外源性的物质带入,在将酸化液浓缩后直接采用国产离子交换柱层析进行分离,大大降低了成本。本发明方法设计合理,操作简便,无需特殊设备,非常适合工业化生产。
具体实施方式
本发明结合具体实施例作进一步说明。
实施例1 桑叶提取物的制备
取桑叶药材200g左右粉碎,加3升水,回流提取2.5小时,过滤后滤渣再加3升水回流2小时,合并滤液,共5.2L。将此提取液用6N的盐酸酸化至pH1~3后在-8℃冷藏2h,过滤除去沉淀,滤液浓缩至2L后通过阳离子交换树脂001×1.1,用水洗至无色后,再加入氨水至50%乙醇水溶液中使氨水含量达50%洗脱,收集此部分洗脱液,浓缩成浸膏得1.8g,用HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量为11.8%。
实施例2 桑叶提取物的制备
取500克左右药材粉碎,加5升30%的甲醇回流提取2小时,过滤后滤渣再加4升30%的乙醇回流2小时,合并滤液,共8.2L。将此提取液用5N的硫酸酸化至pH1~3后在-15℃冷藏2h,过滤除去沉淀,滤液浓缩至5L后通过阳离子交换树脂001×7,用水洗至中性后再用30%甲醇洗至无色,继而加入二乙氨至70%甲醇水溶液使其含量达20%洗脱,收集此部分洗脱液,浓缩成浸膏得4.1g,用HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量为13.1%。
实施例3 桑叶提取物的制备
取桑叶药材1kg左右粉碎,加8升20%的丙酮,回流提取2.5小时,过滤后滤渣再加8升20%的丙酮回流2小时,合并滤液,共12.6L;将此提取液用5N的磷酸酸化至pH1~3后在-30℃冷藏2h,过滤除去沉淀,滤液浓缩至6L后通过阳离子交换树脂001×14.5,用水洗至中性后再用60%丙酮洗至无色,继而加入二乙氨至60%甲醇水溶液使其含量达30%洗脱,收集此部分洗脱液,浓缩成浸膏得9.6g,用HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量为12.6%。
实施例4 桑叶提取物的制备
取桑叶药材1kg左右粉碎,加10升10%的乙腈,回流提取2小时,过滤后滤渣再加8升10%的乙腈回流2小时,合并滤液,共15.6L;将此提取液用5N的磷酸酸化至pH1~3后在-30℃冷藏2h,过滤除去沉淀,滤液浓缩至6L后通过阳离子交换树脂D151,用水洗至中性后再用60%乙腈洗至无色,继而加入三乙氨至70%甲醇水溶液使其含量达10%洗脱,,收集此部分洗脱液,浓缩成浸膏得11.2g,用HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量为10.9%。
实施例5桑叶提取物的制备
取桑叶药材1kg左右粉碎,加8升50%的乙醇,回流提取2小时,过滤后滤渣再加6升10%的乙腈回流2小时,合并滤液,共11L;将此提取液用6N的硝酸酸化至pH1~3后在-30℃冷藏2h,过滤除去沉淀,滤液浓缩至6L后通过阳离子交换树脂001×7,用水洗至中性后再用60%乙醇洗至无色,继以50%氨水乙醇溶液洗脱,收集此部分洗脱液,浓缩成浸膏得12.3g,用HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量为12.4%。
实施例6
本发明含量测定方法采用高效液相法,包含以下步骤:HPLC条件:C18柱,柱温30℃,流动相为乙腈∶0.1%醋酸水溶液(35∶65),流速0.8ml/min,检测波长254nm;
柱前衍生化:反应在1.5ml的离心管中进行。精密称取适量样品以蒸馏水定容至100ml,取20μl样品溶液,加入硼酸盐缓冲溶液(pH=8.5)20μl,再加入40μl 5mmol/L的FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)的乙腈溶液,振摇,室温下反应20分钟,再加入20μl 0.1mol/L的甘氨酸水溶液使剩余的衍生化试剂反应完全,10分钟后加入400μl 0.1%醋酸水溶液。
标准曲线的制备:精密称取1-脱氧野尻霉素标准品适量,以蒸馏水定容至100ml即得标准溶液,用蒸馏水将母液稀释成不同浓度的标准溶液系列,分别取10μl标准溶液同上述衍生化步骤衍生并进液相测定峰面积,以标准品质量为横坐标,峰面积为纵坐标计算标准曲线。
实施例7 片剂
取上述1~5任一实施例方法获得的桑叶提取物30g,粉碎后过80目筛,与淀粉60g混匀,加10%淀粉浆10g制成软材加入硬脂酸镁1g,干淀粉10g混匀后压制成1000片,即得。每片含桑叶提取物30mg。
实施例8 胶囊剂
取上述1~5任一实施例方法获得的桑叶提取物30g,粉碎后过80目筛,加10%淀粉浆制成软材,用14目筛制粒后,置60℃~70℃干燥后于12目筛整粒,套入1号空心胶囊中。共装1000粒,每粒胶囊含桑叶提取物30mg。
实施例9 丸剂
取上述1~5任一实施例方法获得的桑叶提取物30g,粉碎后过80目筛,适量蜂蜜作黏合剂泛制成丸。
实施例10 颗粒剂
取上述1~5任一实施例方法获得的桑叶提取物30g,粉碎后过80目筛,加10%淀粉浆制成软材,用14目筛制粒后,置60℃~70℃干燥后于12目筛整粒,分装,密封,包装即得。
实施例11 喷雾剂
取上述1~5任一实施例方法获得的桑叶提取物30g,粉碎后过80目筛,适量水溶解,灭菌后灌装。
实施例12DNJ提取物对正常小鼠血糖水平的影响
正常小鼠随机分为5组,每组10只,DNJ提取物低、中、高剂量组分别给予200、400、800mg/kg,阴性对照组给予0.5%CMC-Na 20ml/kg,阳性对照组给予格列齐特100mg/kg,每天1次灌胃给药,连续3天,于末次给药前禁食12h,于给药前和给药后1、2h尾静脉取血,3000rpm×10min,分离血清,用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。
对正常小鼠给药3天,末次给药后1h后,与阴性对照组比较,DNJ提取物400、800mg/kg剂量组有明显的降血糖作用(P<0.05和P<0.01),阳性对照药格列齐特100mg/kg组也具有明显的降血糖作用(P<0.001);末次给药后2h后,与阴性对照组比较,阳性对照组仍具有显著的降血糖作用(P<0.001),而DNJ提取物的降血糖作用不明显(P>0.05)。
实施例13 DNJ提取物对正常小鼠注射葡萄糖引起高血糖的影响
正常小鼠随机分为5组,每组10只,禁食12小时后灌胃给药,DNJ提取物低、中、高剂量组分别给予200、400、800mg/kg,阴性对照组给予0.5%CMC-Na20ml/kg,阳性对照组给予格列齐特100mg/kg,给药1h后,每只小鼠腹腔注射葡萄糖2g/kg,注射葡萄糖1h后,小鼠摘眼球取血,3000rpm×10min,分离血清,用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。
正常小鼠灌胃给药1h后再腹腔注射葡萄糖2g/kg,1h后测定血糖值。与阴性对照组比较,DNJ提取物400、800mg/kg剂量组有明显的降血糖作用(P<0.001和P<0.01),阳性对照药格列齐特100mg/kg组也具有明显的降血糖作用(P<0.001)。
实施例14 DNJ提取物对正常小鼠淀粉耐量的影响
正常小鼠随机分为5组,每组10只,禁食12小时后灌胃给药,DNJ提取物低、中、高剂量组分别给予50、100、200mg/kg,阴性对照组给予0.5%CMC-Na 20ml/kg,阳性对照组给予阿卡波糖20mg/kg,给药0.5h后,每只小鼠以可溶性淀粉5g/kg灌胃,分别于给药前,给淀粉后0.5、1、2h尾静脉取血,3000rpm×10min,分离血清,用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。
正常小鼠灌胃给药0.5h后可溶性淀粉5g/kg灌胃,与阴性对照组比较,DNJ提取物100mg/kg剂量组于给淀粉后1h有明显的降血糖作用(P<0.05),阳性对照药阿卡波糖20mg/kg组在给淀粉后0.5h和1h均有明显的降血糖作用(P<0.05和P<0.01)。
Claims (6)
1.一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法,是将桑叶粉碎成粗粉,用水或含水的亲水溶剂加热提取,其特征是通过以下步骤实现:
(1)将桑叶粉碎成粗粉,用水或含水的亲水溶剂加热提取2~3次,加热提取的温度在50~100℃之间;
(2)将提取液合并后加入无机酸酸化至pH1~3,在10~-30℃之间冷却至沉淀完全,过滤或离心除去沉淀;
(3)滤液浓缩后通过阳离子交换树脂,用水或含水的亲水溶剂洗至无色后,再用碱性甲醇或乙醇水溶液洗脱至近无色;
(4)收集洗脱液,浓缩成浸膏或喷雾干燥,即得到1-脱氧野尻霉素的含量不低于10%的桑叶提取物。
2.根据权利要求1所述的一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法,其特征是:步骤(2)中的无机酸选用盐酸、硫酸、硝酸或磷酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法,其特征是:步骤(3)中的碱性水溶液选用氨水、二乙氨、三乙氨中的一种,碱的浓度为10%~50%,水溶液中甲醇或乙醇的浓度为10%~95%。
4.根据权利要求1所述的一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法,其特征是:亲水溶剂选用甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法,其特征是:获得的桑叶提取物与药剂学允许的赋形剂制备成药物制剂,制剂形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、气雾剂、喷雾剂。
6.根据权利要求1所述的方法获得的桑叶提取物1-脱氧野尻霉素在制备降低血糖的保健品中应用。
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