CN102659861A - 一种曲札茋苷的纯化方法 - Google Patents

一种曲札茋苷的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化合物提取纯化领域，特别涉及一种曲札茋苷的纯化方法。该方法通过取拉萨大黄经乙醇提取经非极性大孔树脂第一纯化后，经乙醇水溶液洗脱，收集第一洗脱液经苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂第二纯化后，用浓度为80～95％的乙醇水溶液洗脱，收集第二洗脱液后精制即得。该方法操作简便，易于重现，缩短了纯化时间，并降低了能耗，使得曲札茋苷的纯度提高至98％以上。

Description

一种曲札茋苷的纯化方法
技术领域
本发明涉及化合物提取纯化领域，特别涉及一种曲札茋苷的纯化方法。
背景技术
曲札茋苷的化学结构为3，5，3’，4’-三羟基二苯乙烯-3’-b-D-葡萄糖苷类(3，5，3’，4’-trihydroxy-stilbene-3’b-D-glucoside)，分子式C20H22O9；分子量406.13，结构如式I所示：
Figure BDA0000154709140000011
式I
曲札茋苷易溶于甲醇、乙醇、热水，碳酸氢钠和氢氧化钠水溶液，可溶于乙酸乙酯，微溶于冷水、难溶于乙醚。
曲札茋苷是从药材拉萨大黄根茎中提取的有效成份。拉萨大黄Rheumlhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao是大黄属波叶组植物，为藏族民间用草药，藏名叫曲札，以根茎晒干入药。《新修晶珠本草》中将其列为藏药中称为“亚大黄”，即“曲札”药材的一个习用品种，其根及根茎入药。《如意宝树》中说“亚大黄性缓，锐，化性平”。拉萨大黄主产于我国西藏、四川等地。拉萨大黄根茎的化学成分目前尚无报道，我们的前期研究发现其中有多个二苯乙烯类化合物，含量较多的是曲札茋苷、甲基虎杖苷和虎杖苷。此外，拉萨大黄还含有鞣质和其它成份如多糖等。拉萨大黄几乎不含蒽醌类化合物。曲札茋苷作为临床制剂，需要较高的纯度，因此，提取曲札茋苷后进行纯化具有现实意义。
茋苷类物质目前现有纯化技术主要为硅胶柱层析，所用洗脱溶剂一般包括石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚等。将大量有机溶剂应用于工业生产不利于生产条件的控制，尤其氯仿是沸点低、毒性大的溶剂，不仅影响操作人员的人身安全，而且污染环境。同时考虑到硅胶柱通常难以再生、样品处理量也相对较小，且目前的纯化技术不能获得理想纯度的曲札茋苷，因此，提供一种能够获得较高纯度的曲札茋苷的纯化方法，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种曲札茋苷的纯化方法。该方法通过取拉萨大黄经乙醇提取经非极性大孔树脂第一纯化后，经乙醇水溶液洗脱，收集第一洗脱液苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂第二纯化后，用浓度为80～95％的乙醇水溶液洗脱，收集第二洗脱液后精制即得。该方法操作简便，易于重现，缩短了纯化时间，并降低了能耗，使得曲札茋苷的纯度提高至97％以上。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种曲札茋苷的纯化方法，包括如下步骤：
步骤1：取拉萨大黄提取液预处理后经非极性大孔树脂第一纯化后水洗，经第一乙醇水溶液洗脱，收集第一洗脱液减压浓缩后获得第一粗品；
步骤2：取所述第一粗品经苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂第二纯化后，经第二乙醇水溶液洗脱，收集第二洗脱液后精制即得；
所述拉萨大黄提取液按照如下方法制备：取拉萨大黄经有机溶剂提取，收集上清，获得所述拉萨大黄提取液；所述有机溶剂选自C1-C4的醇或C3-C4的酮中的一种或两者以上的混合液。拉萨大黄(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao)，蓼科大黄属，采用中药常用方法，选用C1-C4的醇或C3-C4的酮中的一种或两者以上的混合液作为提取溶剂，根据相似相溶原理，获得拉萨大黄提取液。
在本发明的一些实施例中，拉萨大黄提取液中含有曲札茋苷、甲基虎杖苷、虎杖苷。
在本发明的一些实施例中，步骤1中拉萨大黄提取液中，曲札茋苷在拉萨大黄提取液中的含量为5～25％，甲基虎杖苷在拉萨大黄提取液中的含量为40～50％，虎杖苷在拉萨大黄提取液中的含量为18～22％。
作为优选，步骤2中苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂为ADS-7型大孔树脂、ADS-2型大孔树脂、R600型大孔树脂、ADS-17型大孔树脂、DA201型大孔树脂、NKA-II型大孔树脂、HPD-826型大孔树脂或HPD-500型大孔树脂。非极性大孔吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合制得的不带任何功能基，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适于极性溶剂中吸附非极性物质，也称为芳香族吸附剂，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。曲札茋苷为多羟基二苯乙烯苷类化合物，结构中具苯环，非极性大孔树脂层析能够较好地实现曲札茋苷与其它主要化学成分如糖类、甲基虎杖苷以及多数鞣质类化合物的分离。因此，本发明提供的纯化方法中，采用非极性柱大孔树脂作为层析分离方法。作为优选，步骤1中非极性大孔树脂为D101型大孔树脂。
中等极性大孔吸附树脂是含酯基的吸附树脂，且多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂。其表面兼有疏水和亲水两部分。既可极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶剂中吸附极性物质，也称为脂肪族吸附剂，例如聚丙烯酸酯型聚合物。极性大孔吸附树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂，它们通过静电相互作用吸附极性物质，如丙烯酰胺。拉萨大黄提取液中的成分较多，经一次层析分离不能达到理想纯度的产物曲札茋苷，本发明的纯化方法提供了一种对曲札茋苷专属性很强的树脂——苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂，不仅能够脱色还对其他杂质有很好的吸附作用，能够很好的纯化目标物，同时又缩短了结晶时间，提高了效率。产率高且工艺稳定重现性好，不受药材含量的高低影响。
作为优选，步骤1中第一乙醇水溶液的浓度为20～30％。
作为优选，步骤1中第一乙醇水溶液的浓度为25～30％。
作为优选，步骤1中非极性大孔树脂为40～80目。
作为优选，步骤2中第二乙醇水溶液的浓度为80～95％。
作为优选，步骤2中第二洗脱液为4～6倍柱体积。
优选地，步骤2中第二洗脱液为4～5倍柱体积。
优选地，步骤2中第二洗脱液为4倍柱体积。
作为优选，步骤1中第一洗脱液为2～6倍柱体积。
作为优选，步骤1中水洗所用水的体积为4～6倍柱体积。
优选地，步骤1中水洗所用水的体积为5～6倍柱体积。
作为优选，步骤2中精制包括取第二洗脱液浓缩、加水溶解析晶后抽滤获得第二粗品，加水溶解后加活性炭脱色、过滤、冷却结晶、抽滤、干燥的步骤。
作为优选，步骤1中预处理包括过滤收集滤液、减压浓缩、加水溶解、静置收集上清液的步骤。
作为优选，步骤2精制过程中加水溶解的步骤具体为，取第二粗品，加8～10倍体积的水溶解。
本发明提供一种曲札茋苷的纯化方法。该方法通过取拉萨大黄经乙醇提取经非极性大孔树脂第一纯化后，经乙醇水溶液洗脱，收集第一洗脱液经苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂第二纯化后，用浓度为80～95％的乙醇水溶液洗脱，收集第二洗脱液后精制即得。该方法操作简便，易于重现，缩短了纯化时间，并降低了能耗，使得曲札茋苷的纯度提高至97％以上。
附图说明
图1示实施例1中拉萨大黄药材提取液的HPLC谱图；
图2示实施例1中拉萨大黄药材提取液经第一纯化后收集第一洗脱液的HPLC谱图；
图3示实施例1中第一洗脱液经第二纯化后收集第二洗脱液的HPLC谱图；
图4示实施例1中第二洗脱液精制后所得产物的HPLC谱图；
图5示曲札茋苷标准品在实施例1的洗脱条件下的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种曲札茋苷的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种曲札茋苷的纯化方法中所用药材、树脂、试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
取拉萨大黄药材粗粉2000g，分别以16L95％乙醇回流提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，残渣加水2000ml搅拌使溶散。取样做HPLC检测，见图1。
量取药液上清液1600ml，上样至D101大孔吸附树脂，以水冲洗5-6倍柱体积，再用25％-30％乙醇水溶液冲柱，收集2-6倍体积的流出液，混合后取样，做HPLC检测。见图2。余下溶液减压浓缩除去乙醇，得水溶液约1400ml。
取剩余的水溶液各200ml，选用不同类型的树脂进行二次上样，以90％乙醇进行洗脱，收集5倍柱体积的乙醇溶液，分别浓缩至干，加水25ml析晶24小时，抽滤，滤饼减压干燥，取样测定浓度，计算纯度及收率，见表1。
表1不同类型的树脂纯化后结果
Figure BDA0000154709140000051
Figure BDA0000154709140000061
经试验发现，将药液二次上样至ADS-7树脂后能得到高纯度的曲札茋苷，见图3。并且纯度为98.7％，收率为92.3％，外观很好，用其他树脂在各方面均有所欠缺。ADS-7不仅对色素和杂质有很好的吸附，同时也相当于脱水剂，药液过柱后，有效成分吸附在树脂柱上。再用乙醇洗脱后，得到的溶液为高醇溶液，便于浓缩，缩短了浓缩时间，提高了效率。
经附树脂再次分离后，杂质峰基本已除净。加之ADS-7的脱色作用使色泽更浅，更利于回收溶液。
将上述所得粗品称取10g，加入水90ml，加热使完全溶解，加入0.5g活性炭，加热沸腾3min，趁热过滤，静置冷却析晶24小时。减压干燥至样品完全干燥，得曲札茋苷原料(编号20110311)。取样做HPLC检测，见图4。
取曲札茋苷原料(编号20110401)适量，按照《中国药典》一部附录IU注射剂项下规定进行检验。
性状：为类白色粉末，味苦。
干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2％。
炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1％。
有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。
重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量＜20ppm。
树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。
含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5％乙酸水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000。
洗脱条件：
Figure BDA0000154709140000071
对照品溶液的制备：分精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。
本品按干燥品计算，曲札茋苷(C20H22O9)含量为98.7％。
实施例2
取拉萨大黄药材粗粉2000g，分别以16L95％丙酮回流提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，残渣加水2000ml搅拌使溶散。静置24小时。取上清药液备用。取样做HPLC检测。
量取药液上清液1600ml，上样至D101大孔吸附树脂，以水冲洗5-6倍柱体积，再用25％-30％乙醇水溶液冲柱，收集2-6倍体积的流出液，混合后取样，做HPLC检测。余下溶液减压浓缩除去乙醇，得水溶液约1400ml。
取剩余的水溶液各200ml，选用HPD-500进行二次上样，以90％乙醇进行洗脱，收集5倍柱体积的乙醇溶液，分别浓缩至干，加水25ml析晶24小时，抽滤，滤饼减压干燥，取样测定浓度，计算纯度及收率，纯度为90.2％，收率为58.3％。
经试验发现，将药液二次上样至HPD-500树脂后能得到高纯度的曲札茋苷。并且收率较高，外观很好。HPD-500不仅对色素和杂质有很好的吸附，同时也相当于脱水剂，药液过柱后，有效成分吸附在树脂柱上。再用乙醇洗脱后，得到的溶液为高醇溶液，便于浓缩，缩短了浓缩时间，提高了效率。
经附树脂再次分离后，杂质峰基本已除净。加之HPD-500的脱色作用使色泽更浅，更利于回收溶液。
将上述所得粗品称取10g，加入水90ml，加热使完全溶解，加入0.5g活性炭，加热沸腾3min，趁热过滤，静置冷却析晶24小时。减压干燥至样品完全干燥，得曲札茋苷原料(编号20110311)。取样做HPLC检测，见图4。
取曲札茋苷原料(编号20110401)适量，按照《中国药典》一部附录IU注射剂项下规定进行检验。
性状：为类白色粉末，味苦。
干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2％。
炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1％。
有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。
重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量＜20ppm。
树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。
含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5％乙酸水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000，具体见表2。
洗脱条件：
Figure BDA0000154709140000091
对照品溶液的制备：分精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。
本品按干燥品计算，曲札茋苷(C20H22O9)含量为89.3％。
实施例3
取拉萨大黄药材粗粉2000g，分别以16L95％甲醇回流提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，残渣加水2000ml搅拌使溶散。静置24小时。取上清药液备用。取样做HPLC检测。
量取药液上清液1600ml，上样至D101大孔吸附树脂，以水冲洗5-6倍柱体积，再用25％-30％乙醇水溶液冲柱，收集2-6倍体积的流出液，混合后取样，做HPLC检测。余下溶液减压浓缩除去乙醇，得水溶液约1400ml。
取剩余的水溶液各200ml，选用ADS-17进行二次上样，以90％乙醇进行洗脱，收集5倍柱体积的乙醇溶液，分别浓缩至干，加水25ml析晶24小时，抽滤，滤饼减压干燥，取样测定浓度，计算纯度及收率，产物纯度为92.8％，粗品收率为59.2％。
经试验发现，将药液二次上样至ADS-17树脂后能得到高纯度的曲札茋苷。并且收率较高，外观很好。ADS-17不仅对色素和杂质有很好的吸附，同时也相当于脱水剂，药液过柱后，有效成分吸附在树脂柱上。再用乙醇洗脱后，得到的溶液为高醇溶液，便于浓缩，缩短了浓缩时间，提高了效率。
经附树脂再次分离后，杂质峰基本已除净。加之ADS-17的脱色作用使色泽更浅，更利于回收溶液。
将上述所得粗品称取10g，加入水90ml，加热使完全溶解，加入0.5g活性炭，加热沸腾3min，趁热过滤，静置冷却析晶24小时。减压干燥至样品完全干燥，得曲札茋苷原料(编号20110311)。取样做HPLC检测。
取曲札茋苷原料(编号20110401)适量，按照《中国药典》一部附录IU注射剂项下规定进行检验。
性状：为类白色粉末，味苦。
干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2％。
炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1％。
有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。
重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量＜20ppm。
树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。
含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5％乙酸水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000。
洗脱条件：
Figure BDA0000154709140000111
对照品溶液的制备：分精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。
本品按干燥品计算，曲札茋苷(C20H22O9)含量为91.7％。
实施例4
取拉萨大黄药材粗粉2000g，分别以16L95％丁酮回流提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，残渣加水2000ml搅拌使溶散。静置24小时。取上清药液备用。取样做HPLC检测。
量取药液上清液1600ml，上样至D101大孔吸附树脂，以水冲洗5-6倍柱体积，再用25％-30％乙醇水溶液冲柱，收集2-6倍体积的流出液，混合后取样，做HPLC检测。余下溶液减压浓缩除去乙醇，得水溶液约1400ml。
取剩余的水溶液各200ml，选用R-600进行二次上样，以90％乙醇进行洗脱，收集5倍柱体积的乙醇溶液，分别浓缩至干，加水25ml析晶24小时，抽滤，滤饼减压干燥，取样测定浓度，计算纯度及收率，产物纯度为89.8％，粗品收率为58.0％。经试验发现，将药液二次上样至R-600树脂后能得到高纯度的曲札茋苷。并且纯度较高，外观很好。R-600不仅对色素和杂质有很好的吸附，同时也相当于脱水剂，药液过柱后，有效成分吸附在树脂柱上。再用乙醇洗脱后，得到的溶液为高醇溶液，便于浓缩，缩短了浓缩时间，提高了效率。
经附树脂再次分离后，杂质峰基本已除净。加之R-600的脱色作用使色泽更浅，更利于回收溶液。
将上述所得粗品称取10g，加入水90ml，加热使完全溶解，加入0.5g活性炭，加热沸腾3min，趁热过滤，静置冷却析晶24小时。减压干燥至样品完全干燥，得曲札茋苷原料(编号20110311)。取样做HPLC检测，见图4。
取曲札茋苷原料(编号20110401)适量，按照《中国药典》一部附录IU注射剂项下规定进行检验。
性状：为类白色粉末，味苦。
干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2％。
炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1％。
有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。
重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量＜20ppm。
树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。
含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5％乙酸水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000。
洗脱条件：
Figure BDA0000154709140000131
对照品溶液的制备：分精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。
本品按干燥品计算，曲札茋苷(C20H22O9)含量为88.6％。
实施例5
取拉萨大黄药材粗粉2000g，分别以16L95％丁醇回流提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，残渣加水2000ml搅拌使溶散。静置24小时。取上清药液备用。取样做HPLC检测。
量取药液上清液1600ml，上样至D101大孔吸附树脂，以水冲洗5-6倍柱体积，再用25％-30％乙醇水溶液冲柱，收集2-6倍体积的流出液，混合后取样，做HPLC检测。余下溶液减压浓缩除去乙醇，得水溶液约1400ml。
取剩余的水溶液各200ml，选用DA201进行二次上样，以90％乙醇进行洗脱，收集5倍柱体积的乙醇溶液，分别浓缩至干，加水25ml析晶24小时，抽滤，滤饼减压干燥，取样测定浓度，计算纯度及收率，产物纯度为91.6％，粗品收率为57.8％。经试验发现，将药液二次上样至DA201树脂后能得到高纯度的曲札茋苷。并且纯度较高，外观很好。DA201不仅对色素和杂质有很好的吸附，同时也相当于脱水剂，药液过柱后，有效成分吸附在树脂柱上。再用乙醇洗脱后，得到的溶液为高醇溶液，便于浓缩，缩短了浓缩时间，提高了效率。
经附树脂再次分离后，杂质峰基本已除净。加之DA201的脱色作用使色泽更浅，更利于回收溶液。
将上述所得粗品称取10g，加入水90ml，加热使完全溶解，加入0.5g活性炭，加热沸腾3min，趁热过滤，静置冷却析晶24小时。减压干燥至样品完全干燥，得曲札茋苷原料(编号20110311)。取样做HPLC检测，见图4。
取曲札茋苷原料(编号20110401)适量，按照《中国药典》一部附录IU注射剂项下规定进行检验。
性状：为类白色粉末，味苦。
干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2％。
炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1％。
有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。
重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量＜20ppm。
树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。
含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5％乙酸水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000。
洗脱条件：
Figure BDA0000154709140000151
对照品溶液的制备：分精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。
本品按干燥品计算，曲札茋苷(C20H22O9)含量为91.2％。
实施例6
取拉萨大黄药材粗粉2000g，分别以16L95％丙醇回流提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，残渣加水2000ml搅拌使溶散。静置24小时。取上清药液备用。取样做HPLC检测。
量取药液上清液1600ml，上样至D101大孔吸附树脂，以水冲洗5-6倍柱体积，再用25％-30％乙醇水溶液冲柱，收集2-6倍体积的流出液，混合后取样，做HPLC检测。余下溶液减压浓缩除去乙醇，得水溶液约1400ml。
取剩余的水溶液各200ml，选用NKA-II进行二次上样，以90％乙醇进行洗脱，收集5倍柱体积的乙醇溶液，分别浓缩至干，加水25ml析晶24小时，抽滤，滤饼减压干燥，取样测定浓度，计算纯度及收率，产物纯度为92.0％，粗品收率为58.4％。经试验发现，将药液二次上样至NKA-II树脂后能得到高纯度的曲札茋苷。并且纯度较高，外观很好。NKA-II不仅对色素和杂质有很好的吸附，同时也相当于脱水剂，药液过柱后，有效成分吸附在树脂柱上。再用乙醇洗脱后，得到的溶液为高醇溶液，便于浓缩，缩短了浓缩时间，提高了效率。
经附树脂再次分离后，杂质峰基本已除净。加之NKA-II的脱色作用使色泽更浅，更利于回收溶液。
将上述所得粗品称取10g，加入水90ml，加热使完全溶解，加入0.5g活性炭，加热沸腾3min，趁热过滤，静置冷却析晶24小时。减压干燥至样品完全干燥，得曲札茋苷原料(编号20110311)。取样做HPLC检测。
取曲札茋苷原料(编号20110401)适量，按照《中国药典》一部附录IU注射剂项下规定进行检验。
性状：为类白色粉末，味苦。
干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2％。
炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1％。
有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。
重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量＜20ppm。
树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。
含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5％乙酸水，按下表进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000。
洗脱条件：
Figure BDA0000154709140000171
对照品溶液的制备：分精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。
本品按干燥品计算，曲札茋苷(C20H22O9)含量为91.8％。
实施例7
实验动物：SPF级ICR小鼠50只(由昆明制药集团实验动物中心提供)，体重18-22g，雌雄各半。实验前置动物于室内适应环境一周，室温18-25℃。采用架式笼养，标准饲料喂养。
受试药的制备：曲札茋苷批号，20110401，用相关辅料配制成40mg/ml的曲札茋苷受试药液。0.45um微孔滤膜过滤备用。
实验方法：将50只小鼠称重标记，随机分为曲札茋苷5个不同剂量组(每组10只)。根据预试实验所得结果，曲札茋苷受试药的0％(Dn)和100％(Dm)死亡剂量分别为0.51g和1.13g。由此确定组间比为0.85，分为5个剂量组，分别为0.96g/kg，0.80g/kg，0.68g/kg，0.60g/kg，0.51g/kg剂量组。
按不同剂量组分别静脉注射不同剂量的曲札茋苷受试药液。即分别给予曲札茋苷受试药液0.24ml/10g，0.20ml/10g，0.17ml/10g，0.15ml/10g，0.13ml/10g。给药后逐日观察14天，并详细记录其死亡数目、死亡时间及主要毒性反应。按照Bliss法统计LD50值以及95％可信区间。
实验结果：
曲札茋苷引起小鼠中毒反应情况，结果见表3。
表3各组小鼠的死亡时间与死亡数目
  死亡时间  15min   30min   60min   120min   240min   480min
  0.96g/kg  7   0   0   0   0   0
  0.80g/kg  6   0   0   0   0   0
  0.68g/kg  3   1   0   0   0   0
  0.60g/kg  1   0   0   0   0   1
  0.51g/kg  0   0   0   0   0   0
表4各组小鼠主要毒性反应发生率
  毒性反应   呼吸困难(％)   紫绀(％)   抽搐(％)   烦躁(％)   昏睡(％)
  0.96g/kg   70   0   70   70   20
  0.80g/kg   60   0   60   60   20
  0.68g/kg   40   0   40   40   10
  0.60g/kg   10   0   10   10   10
  0.51g/kg   0   0   0   0   0
曲札茋苷各组小鼠给药及死亡情况，见表5。
表5曲札茋苷各组小鼠给药及死亡数目(n＝10)
  组别   鼠数(n)   剂量(g/kg)   死亡数(只)   死亡率(％)
  1   10   0.96   7   70
  2   10   0.80   6   60
  3   10   0.68   4   40
  4   10   0.60   2   20
  5   10   0.51   0   0
表6曲札茋苷LD50以及95％可信限
  Prob(概率)   Dose(剂量)   Lower   Upper
  0.01   408.61141   196.22383   511.01990
  0.05   493.07046   296.51025   581.46189
  0.10   545.01549   368.12882   625.22564
  0.15   583.12007   424.62808   658.69702
  0.20   615.29553   474.08214   688.84919
  0.25   644.31048   519.08757   718.55537
  0.30   671.53103   560.56752   749.73896
  0.35   697.78043   598.72825   784.04880
  0.40   723.63668   633.53924   822.96183
  0.45   749.56446   665.09725   867.69599
  0.50   775.98801   693.81755   919.19534
  0.55   803.34303   720.39272   978.32719
  0.60   832.12667   745.64113   1046.22024
  0.65   862.96112   770.40403   1124.64328
  0.70   896.69332   795.54544   1216.47500
从试验结果看，曲札茋苷注射受试药液的LD50为775.99mg/kg，其95％可信区间为693.82-919.20mg/kg(P＝0.95)。说明该样品的安全性较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种曲札茋苷的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取拉萨大黄提取液预处理后经非极性大孔树脂第一纯化后水洗，经第一乙醇水溶液洗脱，收集第一洗脱液减压浓缩后获得第一粗品；
步骤2：取所述第一粗品经苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂第二纯化后，经第二乙醇水溶液洗脱，收集第二洗脱液后精制即得；
所述拉萨大黄提取液按照如下方法制备：取拉萨大黄经有机溶剂提取，收集上清，获得所述拉萨大黄提取液；所述有机溶剂选自C1-C4的醇或C3-C4的酮中的一种或两者以上的混合液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中所述苯乙烯骨架结构的极性或中极性树脂为ADS-7型大孔树脂、ADS-2型大孔树脂、R600型大孔树脂、ADS-17型大孔树脂、DA201型大孔树脂、NKA-II型大孔树脂、HPD-826型大孔树脂或HPD-500型大孔树脂。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述第一乙醇水溶液的浓度为20～30％。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述非极性大孔树脂为D101型大孔树脂。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述非极性大孔树脂为40～80目。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中所述第二乙醇水溶液的浓度为80～95％。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述拉萨大黄提取液中包含曲札茋苷、甲基虎杖苷和虎杖苷。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述拉萨大黄提取液中，曲札茋苷在所述拉萨大黄提取液中的含量为5～25％，甲基虎杖苷在所述拉萨大黄提取液中的含量为40～50％，虎杖苷在所述拉萨大黄提取液中的含量为18～22％。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中所述第二洗脱液的体积为4～6倍柱体积。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述水洗所用水的体积为4～6倍柱体积。
11.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中所述精制包括取所述第二洗脱液浓缩、加水溶解、析晶后，抽滤获得第二粗品，加水溶解后加活性炭脱色、过滤、冷却结晶、抽滤、干燥的步骤。
12.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中所述预处理包括过滤收集滤液、减压浓缩、加水溶解、静置收集上清液的步骤。
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