CN107536871A - 一种用于降血糖的中药提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于降血糖的中药提取物的制备方法。准确称取桑叶置于圆底烧瓶内，加入提取剂，75‑90℃回流提取2‑5次，每次0.5‑2h，合并滤液后过滤，然后浓缩后得到酸性乙醇提取液，将732型阳离子树脂进行处理，将酸性乙醇提取液，过处理后的732型阳离子树脂，用0.5mol/L的氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩至无水并称重，得生物碱，即中药提取物；桑叶与提取剂的固液比为1：15‑30。本发明提取工艺简单，提取率高，活性高，同时提出了中药提取物对α‑葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法和中药提取物降血糖活性的研究方法，方法简单，为中药提取物的药效提供了依据。

Description

一种用于降血糖的中药提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，属于中药技术领域。

背景技术

糖尿病已成为严重危害人类健康的公共卫生问题，而我国是糖尿病患病率增长较快的国家之一，目前为糖尿病第一大国，研究开发新型糖尿病治疗药物刻不容缓。根据国际糖尿病联盟(IDF)统计结果，2015年世界上约有4.15亿糖尿病患者，预计到2040年将增长50％左右。病因是胰岛素绝对或相对不足，其特征是高血糖和尿糖，糖尿病及其并发症已成为一种严重危害人类健康的非传染性疾病。调查显示中国患者有1.14亿，居全球之首。与其他国家相比，我国国民的糖尿病发病率日益高涨，致死率仅低于肿瘤和心血管疾病。原有的磺酰脲类和双胍类药物对肝肾功能损伤的糖尿病患者是禁用的，植物中的活性成分医治该病成为全世界的研究热点。

我国中医药防治糖尿病的研究理念，从传统的临床经验的经验医学向更加注重科学证据的医学发展。目前，从天然中药植物中发现了大量降血糖物质，主要包括多糖、黄酮和生物碱等。生物碱类化合物因其良好的降血糖作用而备受关注，在过去的二十年中，大量植物生物碱被提取分离，目前分离的生物碱有数千种，多数具有降血糖药理活性，已广泛应用于医学领域。然而，对其生理功能的吸收和代谢机制、活性基团抑制机理及稳定机制等还缺乏全面深入的了解。

桑叶是桑科植物桑的干燥叶，又名家桑、荆桑、桑椹树、黄桑等，全国大部分地区多有生产。在中医书籍中记载，桑叶乃手、足阳明之药，治劳热咳嗽，明目长发，止消渴，其味苦、甘，性微寒，归肺、肝经。桑叶中含有多种药用有效成分，主要有多糖类、黄酮类及生物碱类，其他还有甾体及三萜类、挥发油类、氨基酸类、有机酸及其他化合物，其中黄酮类化合物含量较大。桑叶中DNJ提取方面的报道相对较少，超声波提取效果较好，桑叶和多糖提取，有报道65％的乙醇为提取剂，但醇提取的杂质比较多，后期难分离，也有微波辅助提取技术提取桑叶中生物碱的方法，生物碱是碱性物质与酸结合成盐后易溶于水，目前也多采用酸水提取液再过离子交换树脂柱的方法进行分离纯化。

发明内容

本发明提出了一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，提取工艺简单，提取率高，活性高，同时提出了中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法和中药提取物降血糖活性的研究方法，方法简单，为中药提取物的药效提供了依据。

为实现上述发明目的，本发明的一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，准确称取桑叶置于圆底烧瓶内，加入提取剂，75-90℃回流提取2-5次，每次0.5-2h，合并滤液后过滤，然后浓缩后得到酸性乙醇提取液，将732型阳离子树脂进行处理，将酸性乙醇提取液，过处理后的732型阳离子树脂，用0.5mol/L的氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩至无水并称重，得生物碱，即中药提取物；桑叶与提取剂的固液比为1：15-30。

所述提取剂为酸性乙醇溶液，酸性乙醇溶液由盐酸溶液和无水乙醇混合而成，酸性乙醇溶液中盐酸浓度为0.01-0.04mol/L,乙醇浓度为50-80％。

所述732型阳离子树脂处理的方法为，将732型阳离子树脂用乙醇反复浸泡洗涤至洗出液澄清、无异味，然后用2mol/LHCl溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性，再以2mol/LNaOH溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性，最后以2mol/LHCl溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性。

生物碱含量的检测方法为采用酸碱滴定法测量，计算公式为：

总生物碱含量＝C_NaOH×(V_空白－V_NaOH)×180/1000w；

式中：V_空白为盐酸滴定液的体积(mL)；180为桑叶中哌啶类总生物碱平均相对分子量；W为样品质量(g)；C_NaOH为氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)，V_NaOH为滴定所用氢氧化钠的体积(mL)。

中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法为，在试管中加入PBS200μL，再加入0.72U/mLα-葡萄糖苷酶40μL，中药提取物10μL，混匀，37℃水浴15min，再加入PNPG40μL，混匀后37℃水浴30min，最后加入500μLNa₂CO₃溶液，于405nm波长下测定吸光度A值；

中药提取物对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：

A2：在磷酸缓冲液环境中，中药提取物与PNPG混合均匀水浴15min，达到酶的最佳活性温度37℃，然后加入酶，使之与PNPG有效反应，充分分解PNPG，PNPG本身无色，经过酶的分解后产生有色物质，溶液的颜色为中药提取物的颜色、PNPG自动分解、酶促进分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A1：背景组颜色为中药提取物颜色、PNPG自动分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A0：空白组颜色为PNPG自动分解、酶促进分解作用的总和。

中药提取物降血糖活性的研究方法为，选取体质量为180～200g的SD雄性大鼠60只，普通饲料喂养2周，自由进食、饮水，然后取体质量为220±5g的大鼠，选取6只作为空白组，其余按照造模方法进行腹腔注射STZ，3天后禁食12h眼眶取血测血糖含量，选取血糖含量＞16.1mmol/L的糖尿病模型大鼠分为5组，每组6只，即为模型组、阳性对照胰岛素组、中药提取物低剂量组、中药提取物中剂量组和中药提取物高剂量组，各组给药剂量如下:空白组、模型组灌胃等剂量生理盐水，中药提取物低剂量组为56mg/kg，中药提取物中剂量组112mg/kg，中药提取物高剂量组224mg/kg，连续灌胃7天，14天后称体重，禁食12h眼眶取血测血糖值。

桑的桑枝、桑树叶片、桑树皮和桑根中含有丰富的生物碱成分，其中主要成分为1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，简称1-DNJ)，化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式是C₆H₁₃NO₄，分子量为163。1-DNJ是一种天然糖的结构类似物，不带发色基团的小分子含氮化合物，含有大量羟基亲水集团，化合物极性很大，目前多采用HPLC-ELSD法检测。

本发明采用提取剂提取，阳离子树脂进行分离提纯，然后蒸干的方法，得到中药提取物，工艺简单，提取率高，活性高。

最终得到的中药提取物用于治疗、预防或减缓糖尿病，能够治疗、预防或减缓能够通过抑制α-葡萄糖苷酶而治疗、预防或减缓的糖尿病。

本发明的改进之处体现在：

1.本发明的提取工艺简单，提取率高，活性高。

2.本发明提出了中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法和中药提取物降血糖活性的研究方法，方法简单，为中药提取物的药效提供了依据。

附图说明

图1为本发明提取工艺流程图。

图2为本发明中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法流程图。

图3为本发明的桑叶中提取生物碱正交因素和水平表。

图4为本发明正交试验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

如图1所示，一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，准确称取桑叶置于圆底烧瓶内，加入提取剂，75-90℃回流提取2-5次，每次0.5-2h，合并滤液后过滤，然后浓缩后得到酸性乙醇提取液，将732型阳离子树脂进行处理，将酸性乙醇提取液，过处理后的732型阳离子树脂，用0.5mol/L的氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩至无水并称重，得生物碱，即中药提取物；桑叶与提取剂的固液比为1：15-30。

所述提取剂为酸性乙醇溶液，酸性乙醇溶液由盐酸溶液和无水乙醇混合而成，酸性乙醇溶液中盐酸浓度为0.01-0.04mol/L,乙醇浓度为50-80％。

所述732型阳离子树脂处理的方法为，将732型阳离子树脂用乙醇反复浸泡洗涤至洗出液澄清、无异味，然后用2mol/LHCl溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性，再以2mol/LNaOH溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性，最后以2mol/LHCl溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性。

如图2所示，生物碱含量的检测方法为采用酸碱滴定法测量，计算公式为：

总生物碱含量＝C_NaOH×(V_空白－V_NaOH)×180/1000w；

式中：V_空白为盐酸滴定液的体积(mL)；180为桑叶中哌啶类总生物碱平均相对分子量；W为样品质量(g)；C_NaOH为氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)，V_NaOH为滴定所用氢氧化钠的体积(mL)。

中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法为，在试管中加入PBS200μL，再加入0.72U/mLα-葡萄糖苷酶40μL，中药提取物10μL，混匀，37℃水浴15min，再加入PNPG40μL，混匀后37℃水浴30min，最后加入500μLNa₂CO₃溶液，于405nm波长下测定吸光度A值；

中药提取物对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：

A2：在磷酸缓冲液环境中，中药提取物与PNPG混合均匀水浴15min，达到酶的最佳活性温度37℃，然后加入酶，使之与PNPG有效反应，充分分解PNPG，PNPG本身无色，经过酶的分解后产生有色物质，溶液的颜色为中药提取物的颜色、PNPG自动分解、酶促进分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A1：背景组颜色为中药提取物颜色、PNPG自动分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A0：空白组颜色为PNPG自动分解、酶促进分解作用的总和。

中药提取物降血糖活性的研究方法为，选取体质量为180～200g的SD雄性大鼠60只，普通饲料喂养2周，自由进食、饮水，然后取体质量为220±5g的大鼠，选取6只作为空白组，其余按照造模方法进行腹腔注射STZ，3天后禁食12h眼眶取血测血糖含量，选取血糖含量＞16.1mmol/L的糖尿病模型大鼠分为5组，每组6只，即为模型组、阳性对照胰岛素组、中药提取物低剂量组、中药提取物中剂量组和中药提取物高剂量组，各组给药剂量如下:空白组、模型组灌胃等剂量生理盐水，中药提取物低剂量组为56mg/kg，中药提取物中剂量组112mg/kg，中药提取物高剂量组224mg/kg，连续灌胃7天，14天后称体重，禁食12h眼眶取血测血糖值。

实施例1

在提取过程中，按照以下条件，盐酸浓度为0.02mol/L，料液比1︰20g/mL，回流温度80℃，提取3次，每次1h，通过改变乙醇浓度50％、60％、70％、80％条件下分别进行提取，来考察桑叶生物碱得率随乙醇浓度的变化关系。结果如图3和图4。

实施例2

在提取过程中，按照以下条件，乙醇浓度为60％、盐酸浓度为0.02mol/L，料液比1︰20g/mL，回流温度80℃，每次1h，通过改变提取次数2、3、4、5次条件下分别进行提取，来考察桑叶生物碱得率随提取次数的变化关系。结果如图3和图4。

实施例3

乙醇浓度为60％、盐酸浓度为0.02mol/L，料液比1︰20g/mL，回流温度80℃，提取3次，通过改变提取时间0.5、1、1.5和2h条件下分别进行提取，来考察桑叶生物碱得率随提取时间的变化关系。结果如图3和图4。

实施例4

乙醇浓度为60％、盐酸浓度为0.02mol/L，回流温度80℃，提取3次，每次1h，通过改变料液比1︰15、1︰20、1︰25、1︰30g/mL条件下分别进行提取，来考察桑叶生物碱得率随料液比的变化关系。结果如图3和图4。

实施例5

乙醇浓度为60％、料液比1︰20g/mL，回流温度80℃，提取3次，每次1h，通过改变盐酸浓度0.01、0.02、0.03、0.04mol/L条件下分别进行提取，来考察桑叶生物碱得率随盐酸浓度的变化关系.结果如图3和图4。

实施例6

乙醇浓度为60％、料液比1︰20g/mL，盐酸浓度为0.02mol/L，提取3次，每次1h，通过改变提取温度75、80、85、90℃条件下分别进行提取，来考察桑叶生物碱得率随提取温度的变化关系。结果如图3和图4。

实施例7

生物碱含量的检测方法为采用酸碱滴定法测量，计算公式为：

总生物碱含量＝C_NaOH×(V_空白－V_NaOH)×180/1000w；

式中：V_空白为盐酸滴定液的体积(mL)；180为桑叶中哌啶类总生物碱平均相对分子量；W为样品质量(g)；C_NaOH为氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)，V_NaOH为滴定所用氢氧化钠的体积(mL)。

中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法为，在试管中加入PBS200μL，再加入0.72U/mLα-葡萄糖苷酶40μL，中药提取物10μL，混匀，37℃水浴15min，再加入PNPG40μL，混匀后37℃水浴30min，最后加入500μLNa₂CO₃溶液，于405nm波长下测定吸光度A值；

中药提取物对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：

A2：在磷酸缓冲液环境中，中药提取物与PNPG混合均匀水浴15min，达到酶的最佳活性温度37℃，然后加入酶，使之与PNPG有效反应，充分分解PNPG，PNPG本身无色，经过酶的分解后产生有色物质，溶液的颜色为中药提取物的颜色、PNPG自动分解、酶促进分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A1：背景组颜色为中药提取物颜色、PNPG自动分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A0：空白组颜色为PNPG自动分解、酶促进分解作用的总和。

以以下化合物做为抑制剂，结果如下：

从结果来看，桑叶生物碱＞槲皮素-3-o-β-D-吡喃半乳糖苷＞山奈酚-3-o-β-D-吡喃葡萄糖苷＞草质素-7-O-(3”-β-D-葡萄糖基)-α-L-鼠李糖苷＞异槲皮苷＞鼠李黄素-3-o-β-D-吡喃半乳糖苷＞槲皮素-3'-o-β-D-葡萄糖苷，桑叶生物碱效果最好。

实施例8

中药提取物降血糖活性的研究方法为，选取体质量为180～200g的SD雄性大鼠60只，普通饲料喂养2周，自由进食、饮水，然后取体质量为220±5g的大鼠，选取6只作为空白组，其余按照造模方法进行腹腔注射STZ，3天后禁食12h眼眶取血测血糖含量，选取血糖含量＞16.1mmol/L的糖尿病模型大鼠分为5组，每组6只，即为模型组、阳性对照胰岛素组、中药提取物低剂量组、中药提取物中剂量组和中药提取物高剂量组，各组给药剂量如下:空白组、模型组灌胃等剂量生理盐水，中药提取物低剂量组为56mg/kg，中药提取物中剂量组112mg/kg，中药提取物高剂量组224mg/kg，连续灌胃7天，14天后称体重，禁食12h眼眶取血测血糖值。

利用链脲霉素造模后大鼠出现多饮、多食、多尿、体质量减轻，“三多一少”症状十分明显。分别于0天，7天，14天取血后测定各组大鼠的血糖值，结果见下表。给药前，模型组、胰岛素组、生物碱低、中、高剂量组大鼠的血糖值与空白组均有明显差异(P＜0.01)，说明链脲霉素诱导高血糖模型造模成功。造模后，模型组大鼠空腹血糖持续升高，胰岛素组、生物碱中、高剂量组血糖值在给药7天时虽然有一定程度的下降，但血糖值变化不大，第14天时，胰岛素组和生物碱高剂量组的血糖值与模型组有明显差异(P＜0.05)，但与空白组的差异也较大，这可能与链脲霉素造模机制有关，链脲霉素造成胰腺β-细胞的损伤是不可能完全恢复的。在14天内，生物碱低剂量组对改善大鼠高血糖的效果不明显。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，其特征在于：准确称取桑叶置于圆底烧瓶内，加入提取剂，75-90℃回流提取2-5次，每次0.5-2h，合并滤液后过滤，然后浓缩后得到酸性乙醇提取液，将732型阳离子树脂进行处理，将酸性乙醇提取液，过处理后的732型阳离子树脂，用0.5mol/L的氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩至无水并称重，得生物碱，即中药提取物；桑叶与提取剂的固液比为1：15-30。

2.如权利要求1所述的一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述提取剂为酸性乙醇溶液，酸性乙醇溶液由盐酸溶液和无水乙醇混合而成，酸性乙醇溶液中盐酸浓度为0.01-0.04mol/L,乙醇浓度为50-80％。

3.如权利要求2所述的一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述732型阳离子树脂处理的方法为，将732型阳离子树脂用乙醇反复浸泡洗涤至洗出液澄清、无异味，然后用2mol/LHCl溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性，再以2mol/LNaOH溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性，最后以2mol/LHCl溶液浸泡4h，以超纯水洗至中性。

4.如权利要求1所述的一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，其特征在于，生物碱含量的检测方法为采用酸碱滴定法测量，计算公式为：

总生物碱含量＝C_NaOH×(V_空白－V_NaOH)×180/1000w；

式中：V_空白为盐酸滴定液的体积(mL)；180为桑叶中哌啶类总生物碱平均相对分子量；W为样品质量(g)；C_NaOH为氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)，V_NaOH为滴定所用氢氧化钠的体积(mL)。

5.如权利要求1所述的一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，其特征在于，中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的实验方法为，在试管中加入PBS200μL，再加入0.72U/mLα-葡萄糖苷酶40μL，中药提取物10μL，混匀，37℃水浴15min，再加入PNPG40μL，混匀后37℃水浴30min，最后加入500μLNa₂CO₃溶液，于405nm波长下测定吸光度A值；

中药提取物对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：

A2：在磷酸缓冲液环境中，中药提取物与PNPG混合均匀水浴15min，达到酶的最佳活性温度37℃，然后加入酶，使之与PNPG有效反应，充分分解PNPG，PNPG本身无色，经过酶的分解后产生有色物质，溶液的颜色为中药提取物的颜色、PNPG自动分解、酶促进分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A1：背景组颜色为中药提取物颜色、PNPG自动分解、酶抑制剂抑制分解作用的总和；

A0：空白组颜色为PNPG自动分解、酶促进分解作用的总和。

6.如权利要求1所述的一种用于降血糖的中药提取物的制备方法，其特征在于，中药提取物降血糖活性的研究方法为，选取体质量为180～200g的SD雄性大鼠60只，普通饲料喂养2周，自由进食、饮水，然后取体质量为220±5g的大鼠，选取6只作为空白组，其余按照造模方法进行腹腔注射STZ，3天后禁食12h眼眶取血测血糖含量，选取血糖含量＞16.1mmol/L的糖尿病模型大鼠分为5组，每组6只，即为模型组、阳性对照胰岛素组、中药提取物低剂量组、中药提取物中剂量组和中药提取物高剂量组，各组给药剂量如下:空白组、模型组灌胃等剂量生理盐水，中药提取物低剂量组为56mg/kg，中药提取物中剂量组112mg/kg，中药提取物高剂量组224mg/kg，连续灌胃7天，14天后称体重，禁食12h眼眶取血测血糖值。