CN104906199A - 一种荞麦壳黄酮类提取物及作为dpp4抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荞麦壳黄酮类提取物，它是将荞麦壳干燥、粉碎、加水，高温高压提取；过滤，滤液大孔树脂动态吸附-洗脱，制得；经实验证实，Ⅱ型糖尿病大鼠给药后，具有降糖作用。可使Ⅱ型糖尿病大鼠血清中INS水平显著升高，证明了荞麦壳提取物对胰岛β细胞的保护作用非常明显，促进胰岛素的分泌达到正常水平。荞麦壳黄酮类提取物对DPP4酶表现出较强的抑制活性，效果优于芦丁，槲皮素和异槲皮苷，荞麦壳黄酮类提取物是混合物，说明其除黄酮类化合物外还含有其它有效成份，可作为天然的DPP4抑制剂。荞麦壳为防治Ⅱ型糖尿病的辅助药物提供新的原材料资源，同时纯化的荞麦壳黄酮类化合物可为成为新型的、安全的、天然的治疗Ⅱ型糖尿病的靶点药物。

Description

一种荞麦壳黄酮类提取物及作为DPP4抑制剂的用途

技术领域

本发明属保健食品和药品领域，具体涉及一种荞麦壳黄酮类提取物及作为DPP4抑制剂的用途。

背景技术

糖尿病是以糖代谢紊乱为主的全身性代谢紊乱疾病，被列为世界第三大疾病。按发病特点可分为Ⅰ型（胰岛素依赖型）和Ⅱ型（非胰岛素依赖型）糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病患者数量占九成以上。目前口服降糖药以双胍类、磺脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等药物为主，这些药物容易导致患者低血糖，副作用大且耐受性有限。近年来随着研究不断深入，出现了一系列可作用于新靶点并且能持续控制血糖水平的新型抗糖尿病药物。

DPP4，二肽基肽酶IV，是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶，广泛存在于肾脏、结缔组织、胃肠道和淋巴结等组织中。GLP-1，胰高血糖素样肽-1，在体内主要由肠道L细胞分泌。其主要的功能是刺激胰岛素的分泌，所以围绕GLP-1开发的药物已成为Ⅱ型糖尿病新药研发的一个重要靶点。由于 GLP-1 在体内的半衰期很短，很快就能被 DPP4为主的酶降解而失活，故难于临床应用。DPP4抑制剂的结构与DPP4的天然底物的结构相似，可以竞争性的与DPP4活化部位结合，但其亲和力却远大于它的天然底物，从而改变 DPP4的构象，降低其催化活性。故能有效延长 GLP-1 半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖浓度，因此，导致DPP4失活从而不分解GLP-1的DPP4抑制剂已成为糖尿病新药研究的一个热点。

目前研究最为深入并已应用于临床的DPP4抑制剂有西格列汀（Sitagliptin）、维格列汀（Vildagliptin）和沙格列汀（Saxagliptin）。这些抑制剂均为化学合成药物，价格昂贵，不利于投入日常消费。同时，像磷酸西格列汀这类药物具有很多副作用，如出现超敏反应、肝酶升高、上呼吸道感染；血管性水肿、剥脱性皮肤损害，以及皮疹、荨麻疹、 胰腺炎等。因此，研发一种新型、经济、安全的 DPP4抑制剂是目前普遍受到关注的问题。

黄酮类化合物是天然植物的生物活性成分之一，具有良好的降低血糖、血脂的功效。荞麦壳中黄酮类化合物含量丰富，且作为辅助降糖药更为安全。但荞麦壳通常作为荞麦加工的副产物被废弃，没有得到充分重视和利用，而且造成资源的浪费。本试验以荞麦壳提取物为原材料，考察其对Ⅱ型糖尿病大鼠的胰岛素水平的影响以及对DPP4的抑制活性，旨在以详实可靠的数据证明荞麦壳黄酮在改善Ⅱ型糖尿病和对DPP4抑制作用中潜在的开发价值，为荞麦壳的开发和应用提供科学坚实的理论依据，为防治Ⅱ型糖尿病的辅助药物提供新的原材料资源。

发明内容

本发明的目的是为解决市场上DPP4抑制剂均为化学合成药物，价格昂贵、副作用大的问题，而提供一种纯天然、价格便宜的荞麦壳黄酮类提取物。

一种荞麦壳黄酮类提取物，它是由下述方法制备的：

将荞麦壳干燥、粉碎、加水，加热提取；过滤，滤液真空浓缩或冷冻干燥，得荞麦壳黄酮提取物；

所述的高温为121℃，高压加热20min后过滤；

所述的滤液，再经大孔树脂动态吸附-洗脱，蒸发去除溶剂制得；

所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。

一种荞麦壳黄酮类提取物在制备DPP4抑制剂药物方面的应用；

一种荞麦壳黄酮类提取物在制备预防治疗糖尿病的保健品或药物方面的应用。

    本发明提供了一种荞麦壳黄酮类提取物，它是将荞麦壳干燥、粉碎、加水，高温高压提取；过滤，滤液大孔树脂动态吸附-洗脱，制得；经实验证实，Ⅱ型糖尿病大鼠给药后，具有降糖作用。可使Ⅱ型糖尿病大鼠血清中INS水平显著升高，证明了荞麦壳提取物对胰岛β细胞的保护作用非常明显，促进胰岛素的分泌达到正常水平。荞麦壳黄酮类提取物对DPP4酶表现出较强的抑制活性，效果优于芦丁，槲皮素和异槲皮苷，荞麦壳黄酮类提取物是混合物，说明其除黄酮类化合物外还含有其它有效成份，可作为天然的DPP4抑制剂。荞麦壳为防治Ⅱ型糖尿病的辅助药物提供新的原材料资源，同时纯化的荞麦壳黄酮类化合物可为成为新型的、安全的、天然的治疗Ⅱ型糖尿病的靶点药物。

附图说明

图1为荞麦壳提取物BHEs的HPLC分析结果；其中(A) 标品检测结果. (1)芦丁 (2) 异槲皮苷 (3)槲皮素； (B) 荞麦壳提取物检测结果；

图2为样品对 DPP4的浓度依赖型抑制曲线。

具体实施方式

实施例1

 将干燥后的荞麦壳用高速粉碎机粉碎、过60目筛后放入干净的烧杯中，加入粗粉质量10倍的蒸馏水，在121℃条件下，高压加热20min后过滤，滤渣重复提取2次。将滤液合并，在60℃条件下真空浓缩至膏状，冷冻干燥24h后即获得荞麦壳黄酮粗提物（BHEs），其颜色为棕色。上清液配制成1%浓度的母液，试验时稀释使用。

取25mg BHEs加入50ml蒸馏水溶解，加入常规方法处理的D101型大孔树脂2 g，在常温下置于100 r/min摇床中24 h后；将吸附有效成分的大孔树脂用70%乙醇50ml浸泡，在常温下置于100 r/min摇床中24 h后，将大孔树脂滤出，剩余液体即为吸附。吸附和未吸附的液体分别在60℃条件下旋转蒸发去除溶剂，用恒温水浴锅在100℃条件下水浴干燥直至固体析出，最后真空干燥处理得到干燥的吸附物（BHEs-A）和未吸附物（BHEs-NA）。

采用已经公布的NaNO₂-Al(NO₃)₃比色法和常规HPLC法分别对BHEs、BHEs-A、BHEs-NA中的总黄酮含量和黄酮类物质进行检测分析。结果表明，三种样品的黄酮含量呈现显著性差异，其中BHEs为（390.28±26.61） mg/g，占荞麦壳粗提取物的39.03%； BHEs-A为（643.18±43.95） mg/g，占荞麦壳粗提物的64.32%，BHEs-NA中残留的总黄酮含量较少，仅为（106.88±3.47）mg/g。如图1所示，根据图1（A）中标准品芦丁（1）、异槲皮苷（2）、槲皮素（3）出现峰的时间分析荞麦壳提取物中是否含有该物质，由图1（B）可知，荞麦壳提取物中主要含有芦丁和异槲皮苷，槲皮素并未在BHEs中检测到。

实施例2  一种荞麦壳黄酮提取物BHEs-A对DPP4抑制活性的测定

将BHEs-A抑制剂药液、标准品溶液进行梯度稀释，分别配制成1.0、0.5、0.1、0.05、0.01mg/mL，备用。按照SIGMA公司DPP4抑制剂试剂盒使用方法测定。分别设置空白组、阴性对照组、阳性对照组、阳性空白组、试验组和颜色对照组。Sitagliptin抑制剂、DPP4酶以及底物用buffer稀释。使用黑色96孔板检测，总反应体系为100μL。各组先分别加样品25μL，空白组及阴性对照组用buffer代替，阳性对照与阳性空白组加Sitagliptin抑制剂；然后向每组加50μL稀释的DPP4酶，空白组、阳性空白和颜色对照组加50μLbuffer代替，避光混匀，在37℃条件下温育10min；最后向各组加入稀释的底物25μL，37℃避光混匀，15-30min内每分钟测定一次吸光度（λ_ex=360nm、λ_em=460nm）。计算抑制剂的抑制率和半数抑制浓度（IC₅₀）。公式如下：

                                                 

 

式中，Slope_EC为抑制剂斜率；Slope_SM为空白组斜率。

以抑制剂的浓度为横坐标，以抑制剂对 DPP4的抑制率的剩余活性为纵坐标作图，得到抑制剂对 DPP4的IC₅₀值曲线，如图2。从图中可以看出，与标准品相比，BHF也具有很好的抑制率。通过 SPSS17.0统计学软件计算出其IC₅₀，BHF（黄酮以芦丁计）的半数抑制浓度为26.7-38.6μmol/L，芦丁、槲皮素、异槲皮苷标准品的半数抑制浓度分别为46.60μmol/L、67.60μmol/L和42.30μmol/L。说明荞麦壳黄酮类化合物对DPP4酶机制效果优于芦丁，槲皮素和异槲皮苷。荞麦壳黄酮类提取物是混合物，说明其除含黄酮类化合物外还含有其它有效成份，

实施例3荞麦壳提取物（BHE）对Ⅱ型糖尿病的改善研究

Ⅱ型糖尿病大鼠模型的制备

将大鼠在标准化动物房饲养，不限食限水。一周后随机抽取若干大鼠为正常组。其余大鼠饲喂高脂高糖饲料4周。4周后，禁食12h，腹腔注射链脲佐菌素（STZ）30mg/kg，1周后再次注射1次。对照组给1%缓冲液30mg/kg做安慰剂，72h后空腹血糖值＞11.0 mmol/L的为成模标准。

试验分组及给药

将造模成功的糖尿病大鼠随机分为5组，加上正常对照组共6组。实验前进行空腹血糖测定。各组大鼠分组及灌胃处理情况如下：

正常组：双蒸水灌胃10mL/kg/d；

模型组：双蒸水灌胃10mL/kg/d；

BHE高剂量组（HBHE）：糖尿病大鼠给BHE试药200mg/kg/d；

BHE中剂量组（MBHE）：糖尿病大鼠给BHE试药100mg/kg/d

BHE低剂量组（LBHE）：糖尿病大鼠给BHE试药50mg/kg/d；

阳性对照组：盐酸二甲双胍对大鼠灌胃100mg/kg/d。

每天给药1次，连续给药28d，所有实验大鼠除检测要求外均饮用双蒸水，不限制采水采食。

荞麦壳提取物对大鼠空腹血糖（FBG）的影响

大鼠禁食（不禁水）12h后，剪尾静脉采血，按照说明书使用血糖仪测定各试验大鼠FBG，给药后每周测定1次指标，记录试验结果。

造模3天后大鼠禁食12小时，测空腹血糖值，正常组与模型组比较结果极显著差别（P＜0.01），大鼠血糖明显升高，说明Ⅱ型糖尿病模型成立。与模型组相比，HBHE组给药1周开始，血糖值有显著降低趋势；MBHE组和阳性对照组给药4周血糖值有所降低，但差异不显著；LBHE组空腹血糖值始终没有明显降低。给药28天后，HBHE组、MBHE组结果与模型组比较有显著差别，HBHE组血糖值最低，优于其他组，空腹血糖水平有所降低。结果提示一定剂量的荞麦壳提取物对空腹血糖受损有保护作用，可对大鼠起一定降糖作用。

血清中胰岛素（INS）的测定

给药28试验大鼠在处死前禁食12h，注射20%乌拉坦后腹主动脉取全血。各组离心后的血清待测样，按INS试剂盒说明书，应用双抗体夹心法检测各组大鼠血清中的INS水平。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠胰岛素(INS)浓度。血清中INS的检测结果见表2。

胰岛β细胞分泌胰岛素，保护胰岛β细胞有利于降血糖。从表2中可以看出，模型组与正常组相比，血清中INS水平有显著降低，说明胰岛素分泌不足，符合糖尿病特征。在给予了不同剂量的荞麦壳提取物试药28天后，中、高剂量的BHE组在INS水平与模型组相比均有显著的升高，并且指标优于阳性对照组；同时低剂量BHE组虽指标下降，但没有统计学意义。说明各剂量的试验组对Ⅱ型糖尿病大鼠的胰岛素分泌均具有改善作用，同时高剂量组的INS指标已经恢复到正常水平，证明了荞麦壳提取物高剂量组对胰岛β细胞的保护作用非常明显，因而促进胰岛素的分泌达到正常水平。

给药一段时间后，BHF可显著降低空腹血糖值，提示一定剂量的荞麦壳提取物对空腹血糖受损有保护作用，可对大鼠起一定降糖作用。一定剂量荞麦壳提取物可使Ⅱ型糖尿病大鼠血清中INS水平显著升高，证明了荞麦壳提取物对胰岛β细胞的保护作用非常明显，因而促进胰岛素的分泌达到正常水平。同时，经纯化后的荞麦壳黄酮类化合物（BHF）对DPP4酶表现出较强的抑制活性，结果提示BHF可作为天然的DPP4抑制剂。荞麦壳为防治Ⅱ型糖尿病的辅助药物提供新的原材料资源，同时纯化的荞麦壳黄酮类化合物可能为成为新型的、安全的、天然的治疗Ⅱ型糖尿病的靶点药物。

Claims (6)

1.    一种荞麦壳黄酮类提取物，它是由下述方法制备的：将荞麦壳干燥、粉碎、加水，加热提取；过滤，滤液真空浓缩或冷冻干燥，得荞麦壳黄酮提取物。

2.根据权利要求1所述的一种荞麦壳黄酮类提取物，其特征在于：所述的高温为121℃，高压加热20min后过滤。

3.根据权利要求1或2所述的一种荞麦壳黄酮类提取物，其特征在于：所述的滤液，再经大孔树脂动态吸附-洗脱，蒸发去除溶剂制得。

4.根据权利要求3所述的一种荞麦壳黄酮类提取物，其特征在于：所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。

5.根据权利要求1所述的一种荞麦壳黄酮类提取物在制备DPP4抑制剂药物方面的应用。

6.根据权利要求1所述的一种荞麦壳黄酮类提取物在制备预防治疗糖尿病的保健品或药物方面的应用。