CN117264019A - 一种苦荞蛋白源dpp-iv抑制肽及其分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食源性活性肽开发技术领域，具体涉及一种苦荞蛋白源DPP‑IV抑制肽及其分离纯化方法。通过苦荞蛋白制备、酶解、提取、分离纯化、鉴定获得了两条DPP‑IV抑制肽，分别是LAGQS（SEQ ID NO:1）和LREIDDADK（SEQ ID NO:5），该抑制肽的IC50值分别为0.74 mM和0.28 mM。采用DEAE‑52阴离子柱分离方法获得的抑制肽相较未优化前DPP‑IV抑制活性提升了7倍，较传统超滤法提升了近4倍；且无盐洗脱即可分离有效组分，避免了高盐洗脱产物进一步脱盐处理的繁琐工艺，大大提升了纯化效率。
Description
技术领域
本发明属于食源性活性肽开发技术领域，特别涉及一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽及其分离纯化方法。
背景技术
二肽基肽酶Ⅳ（DPP-IV）是调控血糖的重要靶点。在人体内DPP-IV具有降解胰高糖素样肽-1（GLP-1）的作用，阻碍了GLP-1发挥降低血糖的活性，从而使血糖失去控制。因此，DPP-IV抑制剂的研发成为治疗Ⅱ型糖尿病的重要途径。食源性活性肽则具有公认的DPP-IV抑制活性。但多肽复杂的制备工艺及筛选肽段的特异性的差异，限制了其工业化应用。
多肽的分离纯化方法对其特异性肽段序列的筛选、结构解析以及工业化应用都至关重要。已有报道的多肽分离纯化方法包括超滤、凝胶色谱和高效液相色谱。目前使用最多的方法是超滤。超滤是一种通过不同膜孔径，筛分出小分子量为主多肽的膜过滤法。由于苦荞多肽的分子量＜5kDa的组分占近一半，例如，苦荞清蛋白来源的多肽分子量＜5kDa占48.34%；苦荞球蛋白来源的多肽分子量＜5kDa占51.27%，超滤法作为绿色物理技术广泛应用于苦荞肽的提取。然而，这一方法忽略了带电荷的苦荞多肽具有更强的DPP-IV抑制活性的问题。因为多肽所带电荷不同极大的影响其与DPP-IV酶的结合，而苦荞多肽中既有碱性又有酸性氨基酸，所以超滤法不适用于DPP-IV抑制肽的分离纯化。
现有技术CN104738305A公开了一种苦荞麦活性肽的制备方法，其分离纯化方式采用的是凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，且该生物活性肽具有抗菌、抗氧化和降胆固醇的功能，并被应用于饲料添加剂；而本申请的苦荞肽具有DPP-IV的抑制功能，在治疗Ⅱ型糖尿病中具有潜质，并根据DPP-IV抑制活性与电荷的关系，采用DEAE-52阴离子交换柱获得了弱电性的、高DPP-IV抑制活性的苦荞肽，即在分离纯化方法和多肽功能上均不同。
本发明使用DEAE-52阴离子交换层析分离出带电强弱不同的苦荞多肽，特别适用于分离中性或酸性组分。DEAE-52是一种阴离子交换柱，其填料颗粒上带有正电荷。采用不同浓度的盐溶液洗脱可以分离带电物质，其中，中性物质（弱电荷组分）分离效率最高。我们研究发现，苦荞中DPP-IV抑制肽集中在弱电荷组分。因此，DEAE-52在分离苦荞DPP-IV抑制肽具有很强的针对性，仅采用无盐洗脱液，即可分离有效组分，避免了高盐洗脱产物进一步脱盐处理的繁琐工艺，大大提升了纯化效率。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的是为了提高苦荞多肽的分离纯化效率，获得高效的DPP-IV抑制肽，用于治疗Ⅱ型糖尿病。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽，所述抑制肽的氨基酸序列为：LAGQS，如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽，所述抑制肽的氨基酸序列为：LREIDDADK，如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供上述两种抑菌肽或其复合物在DPP-IV蛋白酶活性调控中的应用。
本发明提供一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
（1）苦荞蛋白制备：将苦荞粉和石油醚混合，获得脱脂苦荞粉，然后再通过pH调节、透析、除盐、干燥，获得苦荞蛋白。
（2）苦荞蛋白酶解：采用4%复合酶对pH7，2%苦荞蛋白进行酶解；所述复合酶包括：中性酶、风味酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶。
（3）苦荞肽复合物提取：将（2）反应后溶液煮沸，灭活蛋白酶，离心收集上清，获得苦荞肽粗提物。
（4）苦荞肽分离纯化：采用DEAE-52阴离子柱和液相色谱分离纯化中性苦荞肽组分；所述DEAE-52阴离子柱利用洗脱液选择中性多肽组分；所述洗脱液为无盐洗脱液；所述中性肽组分为苦荞蛋白源的DPP-IV抑制肽。
（5）苦荞肽鉴定：采用NanoLC-MS/MS对苦荞DPP-IV抑制肽进行测序、分析。
具体的苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽的分离纯化方法步骤为：
（1）苦荞蛋白制备：将苦荞粉与石油醚按1：5料液比混合，室温搅拌1 h（600 rpm）。经减压抽滤，并干燥，获得脱脂苦荞粉。脱脂苦荞粉按照10%比例加水，调节pH值7-13，搅拌1h后，6000 rpm离心5 min得上清蛋白液。调节上清蛋白液pH值至4.5，6000 rpm离心5 min后收集苦荞蛋白沉淀。沉淀用水复溶后，调节pH为7，经透析24 h，除去盐离子，再经干燥，获得苦荞蛋白。
（2）苦荞蛋白酶解：2%的苦荞蛋白溶液调整pH为7，充分搅拌1 h，煮沸15 min后与4%复合酶（中性酶、风味酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶）进行反应。各酶粉逐个加入前调整苦荞蛋白液至最佳酶反应温度和pH值。
（3）苦荞肽复合物提取：苦荞蛋白酶解液充分搅拌，煮沸10 min灭活蛋白酶，10000rpm离心10 min，收集水解物上清液为苦荞肽粗提物。
（4）苦荞肽分离纯化：采用DEAE-52阴离子柱分离带中性弱电荷的苦荞肽组分。将苦荞肽粗提物上样到DEAE-52阴离子柱，采用超纯水以0.3 mL/min的流速洗脱。采用紫外分光光度计测定洗脱液在280 nm的吸光值，并用BCA法定量多肽，调整至同一浓度后测定每个组分的DPP-IV酶抑制活性，从中筛选出抑制率最高的组分。采用液相色谱，将活性最高苦荞肽进一步纯化，筛选高活性DPP-IV抑制肽的序列。流动相A为0.1%三氟乙酸的超纯水，流动相B为0.1%三氟乙酸的乙腈，进样量50 μL PP-IV抑制实验，筛选出最佳活性组分。
（5）苦荞肽鉴定：采用NanoLC-MS/MS对苦荞DPP-IV抑制肽进行测序（ThermoScientific Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪，ThermoFisher），并采用BLAST®工具明确苦荞多肽序列。
本发明提供一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽的分离纯化方法在苦荞肽或在DPP-IV抑制肽筛选中的应用。
本发明相比现有技术的有益效果为：
（1）采用DEAE-52阴离子柱分离的带中性弱电荷的苦荞肽具有高DPP-IV抑制活性，DPP-IV抑制活性最高的肽段序列为五肽LAGQS和九肽LREIDDADK，抑制DPP-IV活性的IC50值分别为0.74 mM和0.28 mM。
（2）DEAE-52阴离子柱分离方法相较于其他分离纯化方法得到的苦荞肽对DPP-IV抑制活性具有明显提升，相较未优化前DPP-IV抑制活性提升了7倍，较传统超滤法提升了近4倍。
（3）DEAE-52在分离苦荞肽时具有很强的针对性，仅采用无盐洗脱液，即可分离有效组分，避免了高盐洗脱产物进一步脱盐处理的繁琐工艺，大大提升了纯化效率。
附图说明
图1 DPP-IV抑制活性最强苦荞肽二级质谱图。
图2不同浓度盐溶液洗脱分离的苦荞肽。
图3不带电荷苦荞肽的DPP-IV抑制活性。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步详细解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，苦荞粉为2022年四川省昭觉县收获的籽粒在环太公司加工制成的全粉；中性酶、风味酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等购买自源叶生物公司；石油醚、三氟乙酸、乙腈、Tris-HCl缓冲液等实验中用到的化学试剂为常规试剂，可在国药集团化学试剂有限公司购买。DEAE-52离子柱为购买填料Biorigin BN26102后自行制备。
实施例1、苦荞蛋白源DPP-IV抑菌肽的制备
苦荞肽来源于苦荞粉，经过蛋白制备、酶解、提取、分离、纯化的步骤，获得多条高DPP-IV抑制活性的苦荞肽。具体实验步骤为：
苦荞蛋白制备：将苦荞粉与石油醚按1：5料液比混合，室温搅拌1 h（600 rpm）。经减压抽滤，并干燥，获得脱脂苦荞粉。脱脂苦荞粉按照10%比例加水，调节pH值7-13，搅拌1 h后，6000 rpm离心5 min得上清蛋白液。调节上清蛋白液pH值至4.5，6000 rpm离心5 min后收集苦荞蛋白沉淀。沉淀用水复溶后，调节pH为7，经透析24 h，除去盐离子，再经干燥，获得苦荞蛋白。
苦荞蛋白酶解：2%的苦荞蛋白溶液调整pH为7，充分搅拌1 h，煮沸15 min后与4%复合酶（中性酶、风味酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶）进行反应。各酶粉按顺序逐个加入前调整苦荞蛋白液至最佳酶反应温度和pH值，添加顺序及最适条件如下表1所示：
表1 蛋白酶的添加顺序及适用条件
苦荞肽复合物提取：苦荞蛋白酶解液充分搅拌，煮沸10 min灭活蛋白酶，10000rpm离心10 min，收集水解物上清液为苦荞肽粗提物。
苦荞肽分离：采用DEAE-52阴离子柱分离带中性弱电荷的苦荞肽组分。将苦荞肽粗提物上样到DEAE-52阴离子柱，采用超纯水以0.3 mL/min的流速洗脱。采用紫外分光光度计测定洗脱液在280 nm的吸光值，并用BCA法定量多肽，调整至同一浓度后测定每个组分的DPP-IV酶抑制活性，从中筛选出抑制率最高的组分。
BCA法详细步骤如下：
20 μL的蛋白标准品与200 μL的 BCA工作液混合，60 ℃放置15 min，在570 nm检测吸光值。BCA工作液=工作液A：工作液B = 50：1（体积比例），混合均匀后使用。
工作液A：1 % BCA二钠盐，0.4 %氢氧化钠，0.16 %酒石酸钾钠，2 %无水碳酸钠，0.95 %石炭酸氢钠，均匀混合，调整 pH 11.25 。
工作液B：4 %硫酸铜
标准曲线的制作如下表2所示。
表2 标准曲线的制作
通过实验得知标准蛋白浓度在0 ~ 1 mg/mL 范围最适，浓度和吸光值成线性关系。因此蛋白样品适当稀释后，与标准曲线检测相同方法测定吸光值，根据标准曲线求算浓度再乘以稀释倍数。
DPP-IV抑制实验是以西格列汀作为阳性对照，作为多肽对DPP-IV的抑制效果的参考。按表3所示，加入Tris- HCl缓冲液配制的多肽样品溶液或者Tris-HCl缓冲液作为阴性对照，随后加入发光底物甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺（终浓度为 250 μmol/L），混合后在37℃ 下孵育5 min。在混合体系中再次加入50 μL 8U/L DPP-IV酶液（终浓度为4 U/L），混匀后立即在酶标仪405 nm波长下测定吸光值A0min作为背景值。孔板在37℃下孵育30 min后，在405 nm波长下测定吸光值A30min，计算A30min和A0min的吸光值差值A样品。每组实验设平行3次。根据公式便可计算出各样品DPP-IV的抑制率，公式计算如下：
DPP-IV抑制率=（A阴性对照-A样品）/A阴性对照×100%
表3 DPP-IV酶抑制实验中试剂添加量及顺序
通过绘制吸光度变化的倒数与底物浓度倒数的Lineweaver-Burk图来确定抑制类型，纵坐标截距即1/Vmax，横坐标截距为-1/Km。活性多肽浓度设定为 IC50、 IC50/2、0 mg/mL，Gly-Pro-pNA浓度设定为0.25、0.5、1.0、1.5、3.0 mmol/L。初速度的测定采用30 min内吸光值的变化量来表示。
苦荞肽纯化：采用液相色谱，将活性最高苦荞肽进一步纯化，筛选高活性DPP-IV抑制肽的序列。流动相A为0.1%三氟乙酸的超纯水，流动相B为0.1%三氟乙酸的乙腈，进样量50μL，流速1 mL/min。采用梯度洗脱：流动相A 0 min，5 % B；5 min，10% B; 22 min，20% B，24min，60% B；25 min，5% B；30 min，5% B。分别对收集的多肽进行DPP-IV抑制实验，筛选出最佳活性组分。
苦荞肽鉴定：采用NanoLC-MS/MS对苦荞DPP-IV抑制肽进行测序（ThermoScientific Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪，ThermoFisher），并采用BLAST®工具明确苦荞多肽序列。
分离出DPP-IV抑制活性最强的苦荞肽5个，各组分结果如表4所示，净电荷数为0和-2的多肽序列显示出更低的DPP-IV抑制IC50值，即更强的抑制活性，说明中性和带电荷较弱的多肽是苦荞中DPP-IV抑制活性更强的成分。其中，九肽LREIDDADK（SEQ ID NO:5）和五肽LAGQS（SEQ ID NO:1）的DPP-IV抑制活性最强（图1）。
表4 DPP-IV抑制活性最高的苦荞肽段序列
注：序列中氨基酸缩写为：L-亮氨酸；A-丙氨酸；G-甘氨酸；Q-谷氨酰胺；S-丝氨酸；R-精氨酸；D-天冬氨酸；P-脯氨酸；K-赖氨酸；E-谷氨酸；H-组氨酸；I-异亮氨酸
实施例2 苦荞肽的分离纯化方法比较
针对苦荞肽粗提物采用不同分离纯化方法获取苦荞肽，并通过产物的DPP-IV抑制活性评估分离纯化方法的优劣势。分离纯化方法包括（1）苦荞肽粗提物直接采用液相色谱柱纯化；（2）苦荞肽粗提物采用DEAE-52离子柱分离后再经液相色谱柱纯化（实施例1的分离纯化方法）；（3）苦荞肽粗提物采用超滤法分离后再经液相色谱柱纯化：超滤膜是根据自身孔径大小分离苦荞肽组分，采用截留分子量为3 kDa以下的苦荞肽，即将苦荞肽粗提物用0.45 μM水膜过滤，冷冻离心（转速8000 rpm，4 ℃，30 min）后，将苦荞肽截留分离为>10kDa，3-10 kDa、<3 kDa组分。DEAE-52离子柱分离和超滤分离的苦荞肽均取<3 kDa组分进行纯化和DPP-Ⅳ抑制活性测定。
结果发现，相对于（1）和（3）方法，DEAE-52离子柱可以根据带电荷情况分离出苦荞肽，且带中性弱电荷的苦荞肽具有最强的DPP-IV抑制活性。从表5结果可以看出DPP-IV抑制率，无分离技术处理直接液相色谱筛选出的多肽在不同浓度下的DPP-IV抑制率均显著低于经过分离处理的多肽抑制率；超滤分离处理的多肽浓度达到0.25 mg/mL时的DPP-IV抑制率与DEAE-52分离处理的多肽浓度在0.05mg/ml时的DPP-IV抑制率相同，约为30%。这说明，分离处理能够优化苦荞肽的DPP-IV抑制活性，而且DEAE-52分离的效果比超滤更好。
无分离技术筛选出的DPP-IV抑制肽IC50约为2.0 mM，超滤法分离技术优化的IC50约为1.0 mM，而DEAE-52离子柱分离技术优化的IC50最低至0.28mM。DEAE-52离子柱分离处理使得苦荞肽的DPP-IV抑制活性较未优化前提升了7倍，较传统超滤法提升了近4倍。
表5 DEAE-52分离纯化方法筛选DPP-IV抑制肽的优势
注：表中小写字母为每一列不同处理组间的比较分析，不同字母在P<0.05被认为存在显著性差异。
实施例3 DEAE-52离子柱分离时的盐浓度优化
根据肽与离子交换树脂的结合强度，不同浓度的盐溶液会洗脱分离出带电荷强弱不同的苦荞肽，为对比不同带电荷苦荞肽的DPP-IV酶抑制活性，本试验采用纯水和低浓度盐溶液洗脱DEAE-52，分离带中性弱电荷的苦荞肽组分。将苦荞肽粗提物上样到DEAE-52离子柱后，分别采用不同浓度的NaCl溶液（0、0.1、0.2、0.3mM）依次进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min。采用紫外分光光度计测定洗脱液在280nm的吸光值，并用BCA法定量多肽，调整至同一浓度后测定每个组分的DPP-IV酶抑制活性，从中筛选出抑制率最高的组分。
结果发现，水洗脱苦荞肽的DPP-IV抑制活性显著高于NaCl盐洗脱的组分活性。随着盐溶液浓度升高组分在苦荞肽中含量的占比越来越小（图2），且对DPP-IV抑制活性也呈下降趋势（图3）。因此，水洗苦荞肽的含量最高、活性最强，恰好避免了盐洗脱导致的后续繁琐的透析分离工艺。可见，DEAE-52技术对高活性的苦荞DPP-IV抑制肽的分离，具有极强的针对性和适用性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽，其特征在于，所述抑制肽的氨基酸序列为：LAGQS，如SEQ ID NO:1所示。
2.一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽，其特征在于，所述抑制肽的氨基酸序列为：LREIDDADK，如SEQ ID NO:5所示。
3.一种苦荞蛋白源DPP-IV抑制肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）苦荞蛋白制备：将苦荞粉和石油醚混合，获得脱脂苦荞粉，然后再通过pH调节、透析、除盐、干燥，获得苦荞蛋白；
（2）苦荞蛋白酶解：采用4%复合酶对pH7，2%苦荞蛋白进行酶解；
（3）苦荞肽复合物提取：将（2）反应后溶液煮沸，灭活蛋白酶，离心收集上清，获得苦荞肽粗提物；
（4）苦荞肽分离纯化：采用DEAE-52阴离子柱和液相色谱分离纯化中性、高DPP-IV抑制活性的苦荞肽组分；
（5）苦荞肽鉴定：采用NanoLC-MS/MS对苦荞DPP-IV抑制肽进行测序、分析。
4.如权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，所述（2）苦荞蛋白酶解的复合酶包括：中性酶、风味酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶。
5.如权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，所述（4）苦荞肽分离纯化的DEAE-52阴离子柱利用洗脱液选择中性多肽组分；
所述洗脱液为无盐洗脱液；
所述中性肽组分为苦荞蛋白源的DPP-IV抑制肽。
6.如权利要求1所述的抑制肽或其复合物在DPP-IV蛋白酶活性调控中的应用。
7.如权利要求2所述的抑制肽或其复合物在DPP-IV蛋白酶活性调控中的应用。
8.如权利要求1和权利要求2所述的抑制肽按照不同比例协同在DPP-IV蛋白酶活性调控中的应用。
9.如权利要求3-5之一所述的分离纯化方法在苦荞肽筛选中的应用。
10.如权利要求3-5之一所述的分离纯化方法在DPP-IV抑制肽筛选中的应用。
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