CN104256047A - 一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备dpp-iv抑制肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法，包括如下步骤：将新鲜豆渣与水混合后的豆渣悬液放置于30-50℃，当pH为3.0-5.0时取出，悬液分层后收集最下层的豆渣蛋白质，室温晾干，加入蛋白酶制得DPP-IV抑制肽粗品粉末，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-IV抑制肽纯品。本发明豆渣蛋白质的提取方法简单，制备过程中不需要添加任何酸液或碱液，避免了对环境的污染。采用豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽工艺简单，成本低廉，制备而成的DPP-IV抑制肽的抑制率介于4.1～93.2％之间，半数抑制浓度介于42.70μg/mL～2593.64μg/mL。
Description
技术领域
本发明属于保健食品领域，具体涉及一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法。
背景技术
在豆腐、豆浆和大豆分离蛋白(SPI)的加工中，有大量的副产物豆渣产生，而且豆渣含有15％～20％的蛋白质。国内每年用于加工豆腐或豆奶的大豆约400万吨，用于加工大豆分离蛋白的大豆约为300万吨，产生的豆渣数量是非常庞大的。豆渣是一种纤维状残渣，长期以来，由于新鲜豆渣含水量高(可达75-78％)，容易腐败变质，通常作为废弃物直接丢弃，极少用来食用，只有部分被用作词料或肥料。因此，豆渣利用率低，其潜在营养价值未得到充分的开发利用，甚为可惜。然而，随着人们对食品营养需求的提升，对豆渣的研究也越来越深入。
目前，豆渣中蛋白质的提取方法通常主要是碱溶酸沉法。碱溶酸沉提取工艺是利用弱碱性水溶液浸泡低变性脱脂豆粕，使豆粕中可溶性蛋白质溶于弱碱性水溶液中，然后采用盐酸溶液滴加进入已溶解蛋白质的弱酸溶液中，调节其pH值到大豆蛋白的等电点(pH＝4.2-4.6)，使大豆蛋白质沉淀下来，最后通过过滤、溶解、中和、灭菌和喷雾干燥，得到粉末状大豆分离蛋白产品。采用碱溶酸沉法时，常规使用的酸液和碱液分别为HCl和NaOH，这两种试剂容易造成环境的污染。
2型糖尿病发病和进展的一个重要原因是胰岛功能的进行性衰退，包括β细胞胰岛素分泌缺陷和α细胞胰升糖素不适当的分泌增加造成的胰岛素与胰升糖素比例失调。胰升糖素样肽1(GLP-1)是一种在食物营养物质刺激下，由肠道内分泌细胞合成分泌的肠促胰素(Incretin)，具有葡萄糖依赖性促胰岛素分泌的特性，可通过促进β细胞的胰岛素分泌、抑制α细胞不适当的胰升糖素分泌、延缓胃排空及抑制食欲等多个途径参与机体血糖稳态调节。同时，GLP-1还可促进β细胞增殖、抑制β细胞凋亡，增加胰岛素合成、改善β细胞功能。
但内源性活性GLP-1半寿期极短，迅速被二肽基肽酶(DPP-IV)裂解而失活，不能达到2型糖尿病治疗浓度。DPP-IV抑制剂，可以选择性抑制DPP-IV活性，阻止内源性活性GLP-1裂解，延长其半衰期，提高其血浆水平和效能。
DPP-IV抑制剂通常为酮类化合物和哌嗪类化合物，均具有不同程度的毒副作用。此外，中国专利CN101029081中，公布了重组蛋白Exendin-4多肽具有DPP-IV抑制特性，该多肽通常采用化学合成法和基因工程菌发酵法来生产，工序繁琐，价格也比较昂贵，且产品稳定性也较差。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种豆渣蛋白质的简易的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法。
为了实现上述目的，本发明提供：
一种豆渣蛋白质的提取方法，按如下步骤进行：
(1)将新鲜的豆渣按照料液比为1∶10～1∶100加入水，搅拌均匀；
(2)将豆渣液放置于30-50℃温度条件下，放置时间1.0～24h，在此过程中豆渣液的pH值不断降低，待pH值为3.0-5.0时，将豆渣液取出，室温下冷却降温，此时豆渣液分成三层，最上层为浅黄色漂浮物，中间层为水，最下层为析出的浅黄色蛋白质，采用玻璃容器将最上层的黄色漂浮物弃去；
(3)采用2-12层120目以上纱布过滤，除去水，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，将豆渣蛋白质放置于室温自然晾干。
采用上述的豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽的方法，按如下步骤进行：
(1)按料液比为1∶20～1∶200向豆渣蛋白质中加入水，调节pH值至1.5～10.0；
(2)按蛋白酶与加水之前的豆渣蛋白质比为1∶200～1∶20再加入蛋白酶，调节温度至20～60℃，进行水解反应0.5～6h，水解反应结束后，灭酶得到水解液；
(3)将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得DPP-IV抑制肽粗品粉末；
(4)将DPP-IV抑制肽粗品粉末配成浓度为20-200mg/ml的溶液，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-IV抑制肽纯品。
所述的步骤(2)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。
所述的步骤(3)中干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
所述的步骤(4)中膜分离采用的膜孔径有10kDa、5kDa和3kDa，柱层析填料有：SP-葡聚糖凝胶C-25，CM-葡聚糖凝胶C-25，葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15，葡聚糖凝胶G-10；当采用葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15和葡聚糖凝胶G-10时，DPP-IV抑制肽粗品粉末需要用水溶解；当采用SP-葡聚糖凝胶C-25和CM-葡聚糖凝胶C-25，DPP-IV抑制肽粗品粉末需要用乙酸缓冲液溶解。
本发明的有益效果在于：本发明豆渣蛋白质的提取方法简单，通过将豆渣液置于30-50℃温度条件下，放置时间1.0～24h，由于豆渣中的油脂和蛋白质等营养成分，在遇到氧气时被氧化或经微生物作用或高温氧化，会产生小分子酸。在此过程中豆渣液的pH值不断降低，不需要添加任何酸液或碱液就能实现对豆渣液体pH值的控制，避免了对环境的污染。
采用豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽工艺简单，制备而成的DPP-IV抑制肽的抑制率介于4.1～93.2％之间，半数抑制浓度介于42.70μg/mL～2593.64μg/mL。本发明提供的技术方案为豆渣蛋白质的利用开辟了新途径，符合精深加工范畴，通过采用废弃的豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽，较传统的制备方法而言，大大降低了生产成本，且产品无毒副作用。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图
具体实施方式
以下将结合实施例，对本发明进行进一步、详细的说明，所有原料均购自于市场或依现有技术制备。
一种豆渣蛋白质的提取方法，按如下步骤进行：
(1)将新鲜的豆渣按照料液比为1∶10～1∶100加入水，搅拌均匀；
(2)将豆渣液放置于30-50℃温度条件下，放置时间1.0～24h，在此过程中豆渣液的pH值不断降低，待pH值为3.0-5.0时，将豆渣液取出，室温下冷却降温，此时豆渣液分成三层，最上层为浅黄色漂浮物，中间层为水，最下层为析出的浅黄色蛋白质，采用玻璃容器将最上层的黄色漂浮物弃去；
(3)采用2-12层120目以上纱布过滤，除去水，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，将豆渣蛋白质放置于室温自然晾干。
采用上述的豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽的方法，按如下步骤进行：
(1)按料液比为1∶20～1∶200向豆渣蛋白质中加入水，调节pH值至1.5～10.0；
(2)按蛋白酶与加水之前的豆渣蛋白质比为1∶200～1∶20再加入蛋白酶，调节温度至20～60℃，进行水解反应0.5～6h，水解反应结束后，灭酶得到水解液；
(3)将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得DPP-IV抑制肽粗品粉末；
(4)将DPP-IV抑制肽粗品粉末配成浓度为20-200mg/ml的溶液，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-IV抑制肽纯品。
所述的步骤(2)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。
所述的步骤(3)中干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
所述的步骤(4)中膜分离采用的膜孔径有10kDa、5kDa和3kDa，柱层析填料有：SP-葡聚糖凝胶C-25，CM-葡聚糖凝胶C-25，葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15，葡聚糖凝胶G-10；当采用葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15和葡聚糖凝胶G-10时，DPP-IV抑制肽粗品粉末需要用水溶解；当采用SP-葡聚糖凝胶C-25和CM-葡聚糖凝胶C-25，DPP-IV抑制肽粗品粉末需要用乙酸缓冲液溶解。
实施例1
一、豆渣蛋白质的提取方法
取10g新鲜豆渣与500ml水混合均匀，将豆渣悬液放置于35℃的恒温箱内，8h后，测量pH值为4.5，取出，室温冷却，取出上层漂浮层后，将剩余的混合液采用12层纱布过滤，待过滤完成后，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，进行室温自然晾干，得到5.83g蛋白，该蛋白含水率为12.31％。
二、采用上述的豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽的方法
取5g豆渣蛋白，与100ml水混合，调节pH值到9.0，添加0.05g碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中维持pH值为9.0±0.5，温度维持在20～60℃，进行水解反应6h后，采用沸水灭酶10min，冷却后，调节pH值到中性，经离心后，获得上清液，采用冷冻干燥法，获得DPP-IV抑制肽粗品粉末。DPP-IV抑制肽的浓度为2.0mg/nL时，其DPP-IV抑制率为35.81±1.04％，半数抑制浓度为1790.23μg/mL。
三、采用上述DPP-IV抑制肽粗品粉末纯化获得高纯度肽
DPP-IV抑制肽粗品粉末2g，溶于100mL去离子水中后进行超滤膜过滤，分别采用膜孔径为10000Da，5000Da，3000Da进行截留分子量，获得＞10000Da，10000-5000Da，5000-3000Da和＜3000Da的四个组分。DPP-IV抑制肽浓度为2mg/mL时，四个组分的DPP-IV抑制率分别为22.59％，31.37％，45.03％和67.92％。
Claims (5)
1.一种豆渣蛋白质的提取方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)将新鲜的豆渣按照料液比为1∶10～1∶100加入水，搅拌均匀；
(2)将豆渣液放置于30-50℃温度条件下，放置时间1.0～24h，在此过程中豆渣液的pH值不断降低，待pH值为3.0-5.0时，将豆渣液取出，室温下冷却降温，此时豆渣液分成三层，最上层为浅黄色漂浮物，中间层为水，最下层为析出的浅黄色蛋白质，采用玻璃容器将最上层的黄色漂浮物弃去；
(3)采用2-12层120目以上纱布过滤，除去水，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，将豆渣蛋白质放置于室温自然晾干。
2.根据权利要求1所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-IV抑制肽的方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)按料液比为1∶20～1∶200向豆渣蛋白质中加入水，调节pH值至1.5～10.0；
(2)按蛋白酶与加水之前的豆渣蛋白质比为1∶200～1∶20再加入蛋白酶，调节温度至20～60℃，进行水解反应0.5～6h，水解反应结束后，灭酶得到水解液；
(3)将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得DPP-IV抑制肽粗品粉末；
(4)将DPP-IV抑制肽粗品粉末配成浓度为20-200mg/ml的溶液，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-IV抑制肽纯品。
3.根据权利要求2所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-IV抑制肽的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。
4.根据权利要求2所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-IV抑制肽的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
5.根据权利要求2所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-IV抑制肽的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中膜分离采用的膜孔径有10kDa、5kDa和3kDa，柱层析填料有：SP-葡聚糖凝胶C-25，CM-葡聚糖凝胶C-25，葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15，葡聚糖凝胶G-10；当采用葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15和葡聚糖凝胶G-10时，DPP-IV抑制肽粗品粉末需要用水溶解；当采用SP-葡聚糖凝胶C-25和CM-葡聚糖凝胶C-25，DPP-IV抑制肽粗品粉末需要用乙酸缓冲液溶解。
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