KR20040101621A

KR20040101621A - 카뎁신 케이의 활성을 저해하는 메밀 추출물

Info

Publication number: KR20040101621A
Application number: KR1020030033290A
Authority: KR
Inventors: 이정희; 신정걸; 백영진
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2003-05-26
Filing date: 2003-05-26
Publication date: 2004-12-03

Abstract

본 발명은 골다공증에 관여하는 효소인 카뎁신 K(Cathepsin K)의 활성을 억제하는 작용을 하는 메밀 추출물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메밀에 증류수를 첨가하여 90 내지 100℃에서 가열 (끊는 물에 중탕)하고, 중탕된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조한 추출물로서 카뎁신 K효소의 활성을 억제하여 골다공증을 예방하고 치료할 수 있는 물질과 이의 제조방법에 관한 것이다.

이러한 본 발명은, 메밀 추출물은 카뎁신 K 효소 활성을 효과적으로 억제하는 효과가 있으며, 상기 메밀 추출물의 유효성분을 포함하여 약 또는 기능성식품을 만들면 골다공증 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있다. 특히, 칼슘제제에 상기 메밀 추출물의 유효성분을 추가하는 경우 골다공증 예방 및 치료를 위한 의약품을 만들 수 있다.

Description

카뎁신 케이의 활성을 저해하는 메밀 추출물{MATERIAL FOR INHIBITING ACTIVITY OF CATHEPSIN K BY EXTRACTING OF FAGOPYRUM TATARICUM}

본 발명은 골다공증에 관여하는 효소인 카뎁신 K(Cathepsin K)의 활성을 억제하는 작용을 하는 메밀 추출물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메밀에 증류수를 첨가하여 80℃에서 중탕 가열하거나, 메밀에 70% 에탄올을 첨가하여 70℃에서 중탕 가열한 후, 그 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조한 추출물로서 카뎁신 K효소의 활성을 억제하여 골다공증을 예방하고 치료할 수 있는 물질과 이의 제조방법에 관한 것이다.

골다공증을 비롯한 골대사 관련 질환은 생활수준의 향상, 노인인구의 증가로 인해 매년 증가될 것으로 예상된다. 영국의 경우 매년 15만명 정도가 골다공증에 의한 골절이 일어나며, 이로인해 매년 7억5천만 파운드가 지출된다고 한다. 미국의 경우 인구의 10%에 해당하는 2천5백만명의 골다공증 환자 중 매년 130만명 이상이 골절로 고생한다고 하며, 이와 관련된 치료비 규모가 200억 달러에 달한다고 한다. 우리나라의 경우 아직 정확한 통계자료가 없으나 골다공증 환자는 약 200만명으로 추정된다.

초기에는 아무런 증세도 없이 진행되는 골다공증은 45세 여성의 50%에서 진행되며, 75세이상 여성의 90%는 심한 골다공증이 있다고 한다.

카뎁신 K는 최근에 발견된 papain계열의 cystein protease로서, 골조직의 재흡수에 관여하는 중요한 단백질이다(Bromme et al., 1995, Bossard et al., 1996). Bone Remodeling에서 재흡수 단계는 뼈의 표면에 부착되어 있는 파골세포에 의해 이루어진다. 파골세포는 낮은 pH를 유지하고 있는 resorption pit에 카뎁신 K와 같은 단백분해효소를 분비한다(D'Alessio et al., 1999). 카뎁신 K는 효과적인 collagenase로서 typeI과 typeII 콜라겐을 절단한다(Bromme et al., 1999). 골다공증은 파골세포에서 뼈의 재흡수 속도가 조골세포에서의 뼈의 생성 속도보다 빠르게 나타나므로 카뎁신 K의 이런 작용은 골다공증을 치료하기 위한 효과적인 drug target으로 생각되고 있다. 그래서 현재 골다공증을 예방, 치료하기 위해서 카뎁신 K에 대한 억제물질을 찾기 위한 연구가 진행되고 있다.

현재까지 알려진 카뎁신 K의 억제물질은 alkoxymethylketone(Marquis, Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 581-588), NO donors(Percival, Biochemistry, 1999, 38, 13574-13583), 카뎁신 K의 propeptide(Billington, Biochem. Biophy. Res. Comm., 2000, 276, 924-929)등이 알려져 있다.

본 발명은 골다공증에 효과를 나타내는 메밀 추출물 및 그 제조방법을 제공하며, 상기 메밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도1는 본 발명에 따른 일실시예에 있어서, 추출 방법에 따른 메밀 추출물의 카뎁신 K 활성을 나타낸 그래프,

도 2는 본 발명에 따른 일실시예에 있어서, 메밀의 에탄올 추출물의 농도별 카뎁신 K 활성을 나타낸 그래프,

도3은 본 발명에 따른 일실시예에 있어서, 메밀의 열수 추출물의 역상 크로마토그래피 분획물의 카뎁신 K 활성을 나타낸 그래프.

도4는 본 발명에 따른 쿼세틴의 카뎁신 K 억제 활성을 나타낸 그래프

도5는 본 발명에 따른 루틴의 카뎁신 K 억제 활성을 나타낸 그래프

본 발명에 의한 메밀 추출물은, 메밀로부터 추출되며 카뎁신 K효소의 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

상기 카뎁신 K효소의 활성을 저해하는 유효성분은 루틴인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 골다공증 예방 및 치료용 조성물과 기능성 식품은 상기 메밀 추출물을 유효성분으로 포함한다.

한편, 본 발명에 의한 메밀 추출물의 제조방법은, 메밀에 증류수를 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 메밀 추출물은, 메밀에 70% 에탄올을 첨가하여 70℃에서 70분 동안 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 카텝신 K 억제 효과가 있는 조성물을 제조하는데 이용되는 메밀은 마디풀과의 일년생 쌍떡잎 식물이다. 메밀 식물체는 생육기간이 60-80일로 짧고 서늘한 기후에 알맞으며, 재배시 많은 양의 화학비료와 농약을 사용할 필요가 없기 때문에 무공해 작물로 알려졌다.

메밀은 식물분류학적으로 보통메밀(Fugopyrum esculentum)과 달단메밀(Fugopyrum tataricum)로 나누어진다. 보통메밀은 자가불화합성 타가수정작물이고, 달단메밀은 자가화합성 자가수정작물이다. 우리나라에서는 보통메밀이 재배되고 있으며, 달단메밀은 중국, 네팔을 비롯한 히말라야 고산지대에서 재배되고 있다. 보통메밀은 주로 메밀국수, 빵, 묵, 수제비, 부침, 전병, 떡 등을 만드는 데 사용되며, 달단메밀은 메밀죽, 빵을 만드는데 주로 이용되고 있다.

메밀의 주성분은 전분으로 약 70%를 차지하고, 단백질은 약 10%를 함유하고 있다. 보통메밀과 달단메밀은 양질의 단백질과 필수 아미노산을 고루 함유하고 있고, 특히 화곡류 식량 작물에서 결핍되어 있는 라이신 함량이 높다. 또한 여러종류의 비타민과 필수 미량 요소를 많이 함유하고 있다. 특히 달단메밀의 경우에 보통메밀에 비하여 성인병 예방과 치료에 효과가 좋은 것으로 알려진 루틴이 상당히 많이 함유되어 있다.

메밀에 포함된 flavonoid계 물질인 루틴은 당뇨병, 각종 혈관계 질환 및 치근막염의 예방과 치료에 효능이 있으며, 쿼세틴(quercetin)을 비롯한 각종 페놀성 물질은 천연의 항산화제는 물론 각종 의약품의 원료로서 유용한 것으로 알려졌다. 메밀에는 거의 대부분 루틴만 존재하며, 쿼세틴은 가공과정에서 극소량 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한 식품업계에 있어서도 루틴은 각종 음료 및 주류의 색소안정 첨가제로 개발의 여지가 있을 뿐만 아니라 메밀에 함유된 티로신 억제제(tyrosine inhibitor)는 각종 야채 및 과일의 갈변을 방지하는 천연의 선도 유지제로 개발이 유망하다(최병한 등, Korean J. Crop. Sci. 41(s):69-93, 1996)

본 발명자는 식용 식물 추출물 중 카뎁신 K의 활성을 억제하는 추출물에 대해 연구하는 과정에서 메밀의 열수 추출물과 에탄올 추출물이 카뎁신 K를 강하게 억제하는 것을 발견하였다.

본 발명의 메밀 추출물 제조방법으로는 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 즉, 메밀을 분말로 만든 후 물, 에탄올, 메탄올 등의 극성 용매 및 에테르, 헥산 등의 비극성 용매를 가하여 추출할 수 있지만, 물, 에탄올 및 메탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 추출물은 일반 식품과 건강보조식품에 첨가하여 사용될 수 있으며, 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조하여 약제학적 제제로 제형화하여 이용할 수도 있다. 또한, 필요에 따라 메밀 추출물 이외에 골다공증을 예방 또는치료하는데 사용하는 공지물질 또는 새로운 물질을 추가로 포함하여 상승작용을 발휘하도록 할 수도 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] 메밀로부터 열수 추출물 제조

중국에서 채집한 달단메밀을 50g씩 파쇄하여 취하고 증류수 1000ml를 첨가하고, 80℃에서 2시간 추출(뚜껑을 덮고 중탕하였으므로 2시간 가열후에 남은 용액도 처음과 거의 동일)한 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다.

[실시예2]

중국에서 채집한 달단메밀을 50g씩 파쇄하여 취하고 70% 에탄올 1000ml를 첨가하고, 70℃에서 70분간 추출한 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다.

[실시예3] 메밀 추출물의 추출 방법에 따른 카뎁신 K 저해 활성

실시예1과 실시예2에서 얻는 메밀 추출물을 동결건조한 후 10% DMSO 용액에 1mg/ml의 농도가 되도록 용해시킨 용액을 시료 용액으로 사용하였다. 50mM MES(2-[N-Morpholino]ethane -sulfonic acid), 2.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 10%디메틸설포옥사이드(dimethyl sulfoide, DMSO)가 함유된 완충용액에 10μM이 되도록 녹인 후, 96 well plate에 200㎕ 첨가하고, 시료 용액 20㎕와 카뎁신 K 효소액 20㎕를 첨가한 후, 25℃에서 20분간 반응시켰다. Synergy HT(Bio-Tek산, Fluorescence, Absorbance, Luminescence 측정 가능한 기기)를 사용하여 여기(excitation)파장과 방사(emission)파장이 각각 360/40nm, 460/40nm인 조건에서 생성되는 형광을 측정한 결과, 표1 및 도1와 같이 나타났다. 표1 및 도1을 참고하면, 메밀 열수추출물 1mg/ml의 농도에서 카뎁신 K는 약 45%정도 억제되는 것으로 나타났으며, 메밀 에탄올 추출물 1mg/ml의 농도에서는 약 75% 정도 억제되는 것으로 나타났다.

<표 1> 메밀 추출물의 추출방법에 따른 카뎁신 K의 활성량

(460/40nm에서의 형광)

단위 : FU

시간(분)	증류수	메밀(물)	메밀(에탄올)
0	72	54	39
2	91	63	41
4	109	70	41
6	130	78	44
8	147	86	46
10	165	95	48
12	185	103	50
14	203	110	54
16	220	119	57
18	238	128	60
20	260	137	63

[실시예4] 메밀 에탄올 추출물의 농도에 따른 카뎁신 K 저해 활성 측정

실시예2에서 얻은 상등액을 동결건조한 후, 1.0 mg/ml, 0.25mg/ml,0.06mg/ml, 0.016mg/ml의 농도가 되도록 10% DMSO로 다시 녹인 후 시료 용액으로 사용하였다. 카뎁신 K의 억제활성의 측정은 실시예3과 동일하게 실시하였다. 그 결과 카뎁신 K의 저해 활성은 표2 및 도2와 같이 나타났으며, 1mg/ml의 농도에서 약 70%, 0.25mg/ml의 농도에서 약 30%의 억제율을 나타내었다.

<표 2> 메밀 에탄올 추출물의 농도에 따른 카뎁신 K 활성량

(460/40nm에서의 형광)

단위:FU

시간(분)	1mg/ml	0.25mg/ml	0.063mg/ml	0.016mg/ml	0mg/ml
0	36	60	72	76	84
2	40	79	108	116	132
4	47	101	141	155	177
6	53	123	174	189	219
8	60	145	203	225	257
10	68	169	233	257	297
12	77	197	261	288	334
14	86	234	289	319	367
16	100	268	315	350	401
18	121	297	339	379	433
20	143	325	365	407	465

[실시예5] 메밀 열수 추출물의 정제 분획물의 카뎁신 K 저해 활성

실시예1에서 얻은 메밀 열수 추출물의 상등액을 SOURCE™ 5RPC 컬럼(Amersham Biosciences사)을 사용하여 정제한 후, 각각의 분획물에 대하여 카뎁신 K 저해 활성을 측정하였다(도3 참조). 이때 이동상(移動相)으로는 0.05% TFA(Trifluoroacetic acid)가 함유된 증류수와 0.05% TFA가 함유된 acetonitrile을 사용하였으며, 유속 0.7ml/min인 조건에서 정제를 실시하였다. 도3의 그래프 중점선으로 그려진 그래프에서 볼 수 있듯이, 시료를 주입한 후로부터 이동상이 약 5분 정도 흐른 뒤의 활성억제률이 약 50%로 최대가 되었으며, 이때의 OD_355nm값도 1350mAU로 최대를 나타내었다. 따라서, SOURCE™ 5RPC 컬럼을 이용하여 상기와 같은 조건으로 본 발명에 따른 메밀 열수 추출물을 정제할 때는, 시료주입 후 이동상이 5분 정도 흘렀을 때 정제된 추출물에 카뎁신 K의 활성을 억제하는 유효성분이 가장 많음을 알 수 있었다. 한편, 루틴을 메밀 열수 추출물의 정제와 동일한 조건으로 정제한 결과 시료를 주입한 후로부터 이동상이 약 5분 정도 흐른 뒤, 즉 메밀 열수 추출물이 최대 피크를 나타내는 시간과 동일한 시간에 피크가 나타났다. 따라서 메밀 열수 추출물에서 카뎁신 K의 억제활성을 나타내는 주요 성분은 루틴으로 추측된다.

[실시예6] 루틴(rutin)과 쿼세틴(quercetin)의 카뎁신K 저해활성

루틴(Sigma사)과 쿼세틴(Sigma사)을 100% DMSO로 농도가 1mg/ml이 되도록 용해시킨 후, 각각의 농도를 0.25mg/ml, 0.0625mg/ml, 0.0156mg/ml이 되도록 희석한 후 시료용액으로 사용하였다. 카뎁신 K의 억제활성의 측정은 실시예3과 동일하게 실시하였다. 그 결과, 쿼세틴의 경우 표3과 도4에 나타낸 바와 같이 1mg/ml의 농도에서 약 80%, 0.25mg/ml의 농도에서는 약 50% 정도의 억제활성을 나타났다. 루틴의 경우에는 표4와 도5에 나타낸 바와 같이 1mg/ml의 농도에서 약 60%, 0.25mg/ml의 농도에서는 약 30% 정도의 억제활성을 나타났다.

<표 3> 쿼세틴의 농도에 따른 카뎁신 K 활성량

(460/40nm에서의 형광)

단위:FU

시간(분)	0mg/ml	0.0156mg/ml	0.0625mg/ml	0.25mg/ml	1mg/ml
0	70	64	62	44	23
2	98	86	83	54	27
4	124	109	103	66	30
6	149	131	124	76	32
8	177	152	145	88	35
10	203	173	166	100	39
12	232	194	189	111	41
14	256	214	208	122	45
16	282	235	229	132	50
18	309	258	247	144	54
20	334	278	268	154	58

<표 4> 루틴의 농도에 따른 카뎁신 K 활성량

(460/40nm에서의 형광)

단위:FU

시간(분)	0mg/ml	0.0156mg/ml	0.0625mg/ml	0.25mg/ml	1mg/ml
0	68	64	59	52	31
2	87	84	80	66	38
4	111	101	101	79	44
6	133	122	122	96	52
8	154	142	143	109	60
10	177	162	164	124	68
12	198	184	183	141	76
14	221	204	204	155	82
16	242	224	224	172	90
18	261	242	245	187	96
20	283	262	264	202	103

이상과 같이 본 발명에 의하면, 메밀 추출물은 카뎁신 K 효소 활성을 효과적으로 억제하는 효과가 있으며, 상기 메밀 추출물의 유효성분을 포함하여 약 또는 기능성식품을 만들면 골다공증 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있다. 특히, 칼슘제제에 상기 메밀 추출물의 유효성분을 추가하는 경우 골다공증 예방 및 치료를 위한 의약품을 만들 수 있다.

Claims

메밀로부터 추출되며 카뎁신 K효소의 활성을 저해하는 메밀 추출물.
제1항에 있어서, 상기 카뎁신 K효소의 활성을 저해하는 유효성분은 루틴인 것을 특징으로 하는 메밀 추출물.
제1항의 메밀 추출물 중 카뎁신 K의 활성을 저해하는 유효성분을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물.
제1항의 메밀 추출물 중 카뎁신 K의 활성을 저해하는 유효성분을 포함하는 골다공증 예방용 기능성 식품.
제1항에 의한 메밀 추출물의 제조방법으로서, 증류수를 첨가하여 80℃ 내지 100℃에서 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하는 것을 특징으로 하는 열수에 의한 메밀 추출물의 제조방법.
제1항에 의한 메밀 추출물의 제조방법으로서, 70~100%의 에탄올을 첨가하여 40℃ 내지 80℃에서 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하는 것을 특징으로 하는 에탄올에 의한 메밀 추출물의 제조방법.