KR101723368B1 - Lep 조사를 이용한 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기의 재배방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 황기(Astragalus membranaceus)에 LEP(Light emitting plasma)를 조사하여, 항산화 및 미백 활성이 증진되는 것을 특징으로 하는 황기의 재배방법, 상기 방법으로 재배된 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기, 상기 황기를 함유하는 가공식품, 피부 미백용 화장료 조성물, 항산화용 건강식품 조성물 및 항산화용 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 황기(Astragalus membranaceus)에 LEP(Light emitting plasma)를 조사하여, 항산화 및 미백 활성이 증진되는 것을 특징으로 하는 황기의 재배방법, 상기 방법으로 재배된 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기, 상기 황기를 함유하는 가공식품, 피부 미백용 화장료 조성물, 항산화용 건강식품 조성물 및 항산화용 약학 조성물에 관한 것이다.
최근 의학 및 사회·경제·문화의 발달로 높은 삶의 질을 성취하고자 하는 현대인들의 요구가 증가하면서 웰니스(wellness)에 대한 관심이 증가하고 있는 추세이다. 웰니스란 웰빙(well-being), 행복(happiness) 및 건강(fitness)의 합성어로 건강한 상태를 뜻하며, 웰빙을 유지하기 위한 잠재력을 극대화할 수 있는 체계적인 노력을 의미하는 것으로 육체적, 정신적, 감성적, 사회적 지역 영역을 포괄하는 개념이다. 웰니스 산업은 적극적인 건강증진과 예방 활동을 통해 최적의 건강상태와 높은 수준의 삶의 질을 추구하는데 필요한 제품, 시스템, 서비스 등을 생산, 유통하여 부가가치를 창출하는 산업이다. 웰니스 산업분야에서 웰에이징산업의 핵심은 노화속도 늦추기(Anti-Aging)와 건강하게 늙기(Healthy Aging)로 요약될 수 있다. 한국표준산업분류의 세세분류 항목을 활용하여 웰니스 산업을 추정한 결과, 총 시장 규모는 약 75조 9,802억원으로 2009년 GDP대비 약 7% 규모이며, 그 중에서 웰에이징 분야는 시장규모 14조 8,954억원, 사업체수 124,516개, 종사자수 226,360명 정도의 규모로 추정되고 있다. 특히 주름, 색소침착 개선 등의 기능성 화장품의 성장세가 두드러지고 있으며 뷰티산업에서 중요한 부분을 차지하고 그 수요도 점차 늘어나고 있는 추세이다.
웰니스 산업으로 인하여 건강과 관련된 의약품, 화장품, 식품 등의 수요가 급증하고 있으며, 그 원천을 천연의 자생 식물자원으로부터 얻으려고 하는 노력이 점차 고조되고 있다. 화장품 및 기능성 식품의 첨가물 등에서 많이 활용되고 있는 활성성분은 주로 합성 물질로서 이들은 변이원성, 독성, 내성 및 발암물질 유발 등 많은 문제점들을 안고 있으므로, 이러한 합성물질들의 문제점을 보완할 수 있는 천연 항산화제에 대한 관심이 집중되고 있다. 국내 화장품시장 현황은 4조원이며, 식물성 원료시장은 약 2,600억원으로 총 7,000여종 중 20%를 차지한다(2013, 소비자 가격 기준). 이러한 사회적 트렌드에 따라 미용, 의학 등 다양한 분야에서 천연물 원료로 항노화(anti-aging), 미백(skin-lightning) 등의 과학적 연구를 통해 기능성이 입증된 성분을 천연자원에서 탐색 및 개발하고 있으며, 이전부터 약재로 사용하던 다양한 약용작물에 초점을 맞추어 연구가 진행되고 있는 실정이다.
황기(Astragalus membranaceus B.)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 약용작물로 국내에서 재배되는 약용작물 중에서도 중요도가 높은 10대 약용작물 중 하나이며, 한국, 중국, 일본 등의 아시아 지역과 유럽의 일부 지역에 널리 분포하고 있다. 우리나라에서는 전국 어느 곳에서나 재배가 가능하며, 특히 중북부 고랭지에서 뿌리 생육이 양호하고 품질이 좋은 2년생 이상의 다년근 재배가 가능하다. 국내의 주요재배 지역은 전국적으로 58개 지역 정도이고 그 중에서 강원도 정선, 삼척, 충북 제천이 주산단지이다. 현재 황기는 지역별로 일년생을 재배하여 출하하는 지역과 약재로 활용하기 위하여 다년생을 재배하고 있는 지역도 있으나 경제성을 고려하여 일년생 재배를 선호하고 있다.
황기는 숙근성 다년생 식물로 줄기는 녹자색을 띠며 키는 70~120 cm에 달하고 가지도 많다. 7~8월에 줄기 윗부분의 잎겨드랑이에서 꽃대가 올라와 나비모양의 담황색 꽃이 총상화서로 피며, 꼬투리 속에 열매가 맺힌다. 꼬투리는 어릴 때는 짙은 녹색이고 성숙하면서 자색으로 변하며 완전히 익으면 회갈색으로 되고, 크기는 3~5 cm 정도 자라며, 8~10개의 종자가 들어있다. 뿌리는 원뿌리가 곧게 뻗으며 외피는 황갈색이나 잘라 보면 둘레는 유백색이고 속살은 황백색을 나타낸다.
황기의 일반성분은 100 g당 단백질이 13 g, 지질이 1 g, 조섬유 35 g의 수준으로 나타나며 칼슘이 360 ㎎, 인이 1,000 ㎎, 칼륨이 2,800 ㎎정도로 구성되어 있고, 이러한 일반성분의 구성은 재배 년 수에 따라 약간의 차이를 나타내고 있다. 또한 트리터페노이드(triterpenoids), 이소플라보노이드(isoflavonoids), 다당류(polysaccharides) 등이 주요성분으로 알려져 있으며, 그 밖에 다양한 성분들이 포함되어 있다. 황기에 포함된 트리터페노이드 성분은 아스트라갈로사이드 Ⅰ-Ⅳ와 같은 사포닌류의 배당체가 주로 포함되어 있고, 이소플라보노이드 성분은 포르모노네틴과 칼리코신이 대표적이며 두 성분의 배당체와 (6R, 11R) 3-하이드록시-9,10-디메톡시프테로카르판-3-O-D-글루코사이드와 7'',2''-디하이드록시-3'',4''-디메톡시이소플라반-7-O-D-글루코사이드의 6가지 성분이 주요성분으로 보고된 바 있다. 약리작용으로는 항산화, 항바이러스, 면역증강 작용 및 간기능 보호, 자궁 수축작용 등 다양한 효능이 있다.
식물의 품질과 기능성 성분함량을 높일 수 있는 다양한 부가적 환경스트레스 중 광 환경의 조절은 기능성 물질함량 증대를 위한 가장 효과적인 방법으로 알려져 있다. 현재 상업적으로 이용되는 인공광원에는 발광에 따른 고열의 발생과 에너지 손실이 많은 고압나트륨등(High Pressure Sodium Lamp; HPS)이나 메탈할라이드등(Metal Halide Lamp; MH)보다는 형광등(Fluorescent Lamp; FL)을 주로 이용하고 있다. 형광등은 광 자체에 크게 열을 포함하지 않는 근접조명용 광원으로서의 특징을 가지고 있어 조명 효율을 큰 폭으로 올릴 수 있는 장점이 있지만, 발광효율이 낮아 광포화점이 높은 작물에 적용하기에는 광합성에 필요한 빛의 밝기인 광합성유효광양자속(photosynthetic photon flux; PPF)이 부족하다.
최근 기존의 인공광원들의 여러 문제를 보완할 수 있는 새로운 식물생산용 인공광원으로 발광플라즈마(light emitting plasma; LEP)가 주목받고 있다. LEP는 고체상태의 고밀도 광원으로 전력을 주파수출력으로 전환하고 소자의 내용물을 플라즈마 상태로 기화시켜서 강력한 백색광을 내는 발광원리를 가지고 있다. 또한, 기존 인공광원 대비 발열이 적고 에너지효율과 광강도가 높으며 소형으로 수명이 길고 특히, 현재까지의 인공광원 중에서 태양광의 파장과 가장 가까운 인공광원으로서 UV-A 및 UV-B 뿐만 아니라 극소량의 적외선까지 포함하는 넓은 파장영역을 가지고 있다. 그러나, 식물생산용 인공광원으로서의 국내·외 LEP에 관한 연구는 부족한 실정이다.
한국공개특허 제2012-0138949호에는 플라즈마 조명을 이용한 곡물 또는 식물 재배방법이 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 LEP 조사를 이용한 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 재배하는 기술은 전무한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 황기를 재배하는 데 있어서, 황기의 항산화 및 미백 활성과 같은 기능성을 증진시키기 위해, 황기에 LEP(Light emitting plasma)를 조사하여, LEP를 조사하지 않거나, 다른 광원을 조사하여 재배된 황기에 비해 항산화 활성, 티로시나아제 저해 활성 등의 생리활성 효과가 향상된 황기의 재배방법을 확립하는 데 그 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 황기(Astragalus membranaceus)에 LEP(Light emitting plasma)를 조사하여, 항산화 및 미백 활성이 증진되는 것을 특징으로 하는 황기의 재배방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 재배된 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 황기를 함유하는 가공식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 LEP(Light emitting plasma)를 조사하여 재배된 황기는 LEP를 조사하지 않거나, 다른 광원을 조사하여 재배된 황기에 비해 항산화 활성, 티로시나아제 저해 활성 등의 생리활성과 총 페놀 및 플라보노이드와 같은 기능성 물질 함량이 증진되어 항노화 및 미백에 효과적이므로, 상기 방법으로 재배된 황기를 이용하여 식품, 의약품, 화장품 산업 등에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 파장별 광량을 측정한 그래프이다. (A) LEP 파장, (B) 광합성 반응
도 2는 인공광원별 재배된 황기의 DPPH 라디칼 저해능을 비교한 그래프이다.
도 3은 인공광원별 재배된 황기의 총 페놀 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 인공광원별 재배된 황기의 총 플라보노이드 함량을 비교한 그래프이다.
도 5는 인공광원별 재배된 황기의 티로시나아제 저해 활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 인공광원별 재배된 황기의 플라보노이드 생합성 유전자 발현 양상을 비교한 것이다.
도 2 내지 6의 Con(Control): 형광등, Red: LED 적색광, Blue: LED 청색광, Green: LED 녹색광, White: LED 백색광, LEP: LEP 처리하여 재배한 황기를 의미한다.
도 2는 인공광원별 재배된 황기의 DPPH 라디칼 저해능을 비교한 그래프이다.
도 3은 인공광원별 재배된 황기의 총 페놀 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 인공광원별 재배된 황기의 총 플라보노이드 함량을 비교한 그래프이다.
도 5는 인공광원별 재배된 황기의 티로시나아제 저해 활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 인공광원별 재배된 황기의 플라보노이드 생합성 유전자 발현 양상을 비교한 것이다.
도 2 내지 6의 Con(Control): 형광등, Red: LED 적색광, Blue: LED 청색광, Green: LED 녹색광, White: LED 백색광, LEP: LEP 처리하여 재배한 황기를 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황기(Astragalus membranaceus)에 LEP(Light emitting plasma)를 조사하여, 항산화 및 미백 활성이 증진되는 것을 특징으로 하는 황기의 재배방법을 제공한다.
본 발명의 황기의 재배방법에서, 상기 LEP 조사는 바람직하게는 하루에 12~20시간 동안 조사할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하루에 16시간 동안 조사할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 황기의 재배방법은 보다 구체적으로는
(a) 황기 종자를 23~27℃의 배양실에서 상토가 담긴 포트에 심는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 심은 황기 종자에 LEP(Light emitting plasma)를 하루에 12~20시간 동안 조사하고 재배하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(a) 황기 종자를 25℃의 배양실에서 상토가 담긴 포트에 심는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 심은 황기 종자에 LEP(Light emitting plasma)를 하루에 16시간 동안 조사하고 재배하는 단계를 포함할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 황기를 재배하는 것이 황기 내 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증진시킬 뿐만 아니라, 항산화 및 미백 활성과 같은 기능성이 증진된 황기로 재배할 수 있었다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 재배된 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 황기를 함유하는 가공식품을 제공한다. 상기 가공식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 황기를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 떡류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분인 황기는 티로시나아제 저해 활성을 가지므로 피부 미백 용도로 사용이 가능하며, 또한 항산화 활성을 가지므로 항산화 용도로 사용이 가능할 수 있다. 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 황기는 항산화 활성이 증진되었으므로, 상기 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환, 바람직하게는 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 염증반응, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 및 심근경색 등에서 선택되는 1종 이상의 질환을 억제 또는 치료하기 위한 의약품, 건강보조제, 화장료, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물이 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있다.
상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다.
또한 항산화 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료 및 광원 종류
본 발명에서 사용한 황기(A. membranaceus)의 종자는 정선 농업기술원에서 분양받아 전문가의 동정을 받은 후 실험에 사용하였으며, 황기 종자를 멸균한 상토가 담긴 포트에 심고 25℃에서 생육시켰으며, LED 적색광, 청색광, 녹색광 및 백색광과 LEP, 대조구로 형광등을 광원으로 사용하였다. lux 측정기계(Lutron LX-101 Lux meter)로 광량을 측정한 결과, 대조구(fluorescent lamp 1700lux), LED 적색광(650nm) 2050lux, LED 청색광(450nm) 520lux, LED 녹색광(510nm) 1780lux, LED 백색광 3555lux, LEP(신광 I.T.S) 2410lux였다(도 1).
2. 인공광원 조사
황기 종자는 크기와 무게를 고르게 정선하여 4℃에 8주간 저온처리한 후에 실험에 사용하였다. 90×15 ㎜의 일회용 페트리디쉬에 필터 페이퍼를 2장을 깔고 황기종자를 50립 3반복으로 치상하였다. 그 후에 25℃의 온도가 유지되는 배양실에서 각각 대조구(fluorescent lamp, 1700 lux), LED 적색광(650nm), LED 청색광(450nm), LED 녹색광(510nm), LED 백색광, LEP의 6가지 광 조건을 하루에 16시간 유지하였고, 발아가 진행하는 동안 수분이 마르지 않도록 1일 1회 증류수를 이용하여 수분을 공급하였다.
3. 인공광원별 황기의 생리활성 검정
1) 추출 및 농축
황기의 지상부와 지하부를 수확하여 3일간 음지에서 건조하여 3 cm로 잘게 잘라 주었다. 하지만 인공광원별 조건에서 8주간 생육한 황기는 그 양이 충분치 않아 식물체 전체를 분석에 사용하였다. 추출한 용매는 80% 에탄올을 이용하여 72시간동안 추출하였고 필터 페이퍼(250㎜φ, Hyundai micro NO.20)로 여과한 후에 회전 농축기(N-1110, EYELA, Japan)를 이용하여 45℃의 온도에서 감압 농축하였다.
2) DPPH 활성 검정
DPPH는 517 nm에서 특정 광흡수를 나타내는 보라색의 화합물로 그 자체가 매우 안정한 자유라디칼(free radical)이다. 이 라디칼은 에탄올 등의 유기용매에서 매우 안정하며, 특히 여러가지 항산화기작 중에서 양성자 라디칼 소거능(proton-radical scavenging)에 의해서 탈색이 되어 육안으로 항산화 활성을 쉽게 알 수 있다.
항산화 활성 측정은 DPPH 자유 라디칼 소거법을 변형하여 이용하였다. 각 처리군 별로 농축한 시료를 80% 에탄올을 이용하여 각각 100, 500, 1,000, 2,500 ppm의 농도로 희석하여 만들어 주었다. 그 후에 96-웰 플레이트에 각 ppm 별 시료화합물을 100 ㎕씩 넣고 0.15 mM DPPH 용액 100 ㎕을 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시켜 주었다. 반응 후 UV 분광광도계를 사용하여 519 nm의 흡광도에서 측정하였다. 흡광도 측정 후 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 농도인 RC50 (㎍/㎖)을 나타냈으며, 항산화제로 사용되고 있는 수용성 비타민인 아스코르브산(ascorbic acid)과 비교하였다.
3) 총 페놀 함량 검정
페놀성 물질과 특이적으로 반응하여 색이 변하는 발색시약에 의한 방법인 folin-ciocalteau 시약을 사용하여 측정하였다. 이는 페놀의 종류를 측정하는 방법이 아닌 총 페놀 함량을 측정하는 방법으로 시료 100 ㎕에 folin-ciocalteau 시약 50 ㎕을 넣어 5분간 안정화시켜준 후 20% Na2CO3(w/v)을 300 ㎕를 첨가하여 15분 동안 안정화시킨 뒤에 1 ㎖의 증류수를 첨가하여 725 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 갈산(gallic acid)을 이용하여 검량선을 작성해 결과를 나타냈다.
4) 총 플라보노이드 함량 검정
농도별로 희석한 시료 100 ㎕에 80% 에탄올 900 ㎕를 넣어 희석하고, 희석된 시료 500 ㎕에 10% 질산알루미늄(w/v) 100 ㎕와 1M 아세트산칼륨(w/v) 100 ㎕를 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합물에 80% 에탄올 4.3 ㎖를 넣고 40분간 실온에서 안정화 시켜주고 415 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 퀘르세틴을 사용해 검량선을 작성하여 결과를 나타냈다.
5) 미백활성 검정
시험관에 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 180 ㎕와 1.5 mM 티로신액 80 ㎕, 인공광원별 시료 40 ㎕, 그리고 1,250 U/㎖ 머쉬룸 티로신액 40 ㎕를 넣은 다음 수조에서 37℃로 15분 동안 반응시키고, 519 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군은 시료 대신 완충액을 넣은 것으로 하였으며 비교를 위해 양성 대조군으로 코직산(kojic acid)을 사용하였다.
티로시나아제 활성저해율(%) = 100 - (b-b')/(a-a') × 100
a: 대조군의 흡광도
b: 시험군의 흡광도
a': 추출물을 첨가하지 않은 공시험군의 흡광도
b': 추출물이 첨가된 공시험군의 흡광도
4. 인공광원별 유효성분 분석
1) 플라보노이드계 성분 분석
황기의 플라보노이드계 주요 성분인 칼리코신(calycosin), 포르모노네틴(formononetin)의 정량분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)법을 수행하였다. 시료는 분석 시 1,000 ppm으로 희석하여 시린지 필터(0.20 ㎛ syringe-driven filter unit, Minisart RC 15)로 여과시킨 후 분석하였다. 분석에는 YMC-Pack ODS-AMA-303(5, 4.6×250 ㎜, I.D) 컬럼이 장착된 HPLC(Shimadzu Instrument Co. LTD, Japan)를 사용하였으며 이동상은 용액 A(0.1% 빙초산을 함유하는 물)와 B(0.1% 빙초산을 함유하는 아세토니트릴)로 구성하여 용액 B를 0분 15%, 50분 35%, 60분 35%, 80분 15%, 90분 15% 조건으로 농도구배적으로 분석을 실행하였다. 시료의 주입 용량은 20 ㎕, 유속은 분당 1 ㎖로 조정하고, 오븐온도는 40℃이며 검출기의 파장은 280 ㎚에서 고정하여 사용하였다. 분석에 이용된 표준물질로 포르모노네틴은 5, 10, 25, 50, 75 ㎍/㎖, 칼리코신은 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 ㎍/㎖를 측정하여 검량선을 작성한 후 시료의 성분을 정량분석하였다.
2) 폴리페놀계 성분 분석
황기의 페놀 화합물 정량분석은 UHPLC(Ultra high performance liquid chromatography)를 이용하였다. 시료는 분석시 10,000 ppm으로 희석하여 시린지 필터(0.20 ㎛ syringe-driven filter unit, Minisart RC 15)로 여과시킨 후 분석하였다. 페놀 성분 분석에는 Thermo Accucore C18(2.1×100 ㎜ I.D., 2.6 ㎛ particle size) 컬럼이 장착된 UHPLC(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 사용하였으며, 이동상은 용액 A(0.1% 빙초산을 함유하는 물)와 B(0.1% 빙초산을 함유하는 아세토니트릴)로 구성하여 용액 B를 0분 2%, 0.5분 5%, 2.2분 10%, 5분 15%, 7.5분 15.7%, 8분 16.6%, 9분 17.8%, 9.5분 23.9%, 14분 45%, 15분 100%, 15.5분 100%, 16분 2%, 25분 2% 조건으로 분석을 실행하였다. 시료의 주입 용량은 4 ㎕, 유속은 분당 0.5 ㎖로 조정하고, 검출기의 파장은 280 nm에서 고정하여 사용하였다. 분석에 이용된 표준물질로는 23종의 페놀 화합물을 사용하여 검량선을 작성한 후 시료의 성분을 정량분석하였다.
5. 인공광원별 플라보노이드 생합성 유전자 발현 양상 검정
실험에 쓰인 식물재료는 대조구(fluorescent lamp), LED 청색광, LED 적색광, LED 녹색광, LED 백색광, LEP의 6가지 광조건에서 자란 황기의 지상부와 지하부를 사용하였다. 시료는 액체질소를 이용하여 분쇄하고 이를 500 ㎕ 트리졸(trizol)에 첨가하여, 상온에서 5분간 혼합되도록 정치시킨 후, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 새 튜브에 옮겼다. 클로로폼을 100 ㎕을 넣고 강하게 섞은 후, 10분간 상온에서 배양하였고, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 옮겨 동량의 이소프로판올을 첨가하여 인버팅(inverting)하고, 13,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전된 RNA는 70% 에탄올로 세척한 후, DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 첨가된 멸균수에 녹여 발현 분석에 사용하였다.
cDNA는 M-MLV RT(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)를 사용하여 합성하였다. 4 ㎕의 RNA를 1 ㎕의 oligo(dT) 프라이머, 1 ㎕의 dNTP, 6 ㎕의 DEPC가 첨가된 멸균수와 혼합하여 65℃에서 5분간 반응시킨 후, 4 ㎕의 5×first-strand buffer, 2 ㎕의 0.1M DTT, 1 ㎕의 RNaseOUTTM 재조합 리보뉴클레아제 저해제(recombinant ribonuclease inhibitor)와 1 ㎕(200 unit) M-MLV RT를 첨가하여 37℃에서 60분간 배양하였다. 총 20 ㎕의 반응액에 60 ㎕의 멸균수로 희석하여 1 ㎕를 PCR에 사용하였다.
총 RNA로부터 합성된 cDNA는 액틴 프라이머(actin primer)를 사용하여 정량하였고, RT-PCR 조건은 94℃에서 변성시킨 후, 94℃, 55℃, 72℃에서 각각 1분씩 30 사이클로 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 post-elongation하여 반응을 종결하였다. PCR을 이용한 유전자 증폭은 94℃에서 5분간 predenaturation을 하였으며, 94℃에서 1분간 변성(denaturation)을 하고 55℃에서 1분간 어닐링(annealing)을 시킨 후 72℃에서 1분간 신장(elongation)을 하여 28 사이클을 돌린 후 마지막으로 72℃에서 10분간 신장(elongation)을 시켜주었다.
실시예 1: 인공광원 처리별 황기의 DPPH 활성 검정
인공광원 처리가 황기의 항산화 활성에 미치는 영향을 검정하기 위하여, DPPH 활성 검정을 실시하였다. 그 결과, LED 녹색광 처리구에서 가장 낮은 활성을 보였으며, LED 녹색광 처리구를 제외한 모든 처리구에서 대조구보다 다소 높은 활성을 보였다(도 2). 각 처리구별 추출물의 1 ㎍/㎕ 농도를 기준으로 LEP, LED 청색광, LED 적색광, LED 백색광, 대조구(형광등), LED 녹색광의 순으로 항산화능이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 2: 인공광원 처리별 황기의 총 페놀 함량 검정
폴리페놀은 우리 몸에 있는 활성산소를 해가 없는 물질로 바꿔주는 항산화 물질로 비교적 널리 알려진 것은 녹차에 든 카테킨, 포도주의 레스베라트롤, 양파의 퀘르세틴 그리고 콩과에 많은 이소플라본 등이 있다. 또한 페놀성 화합물에 존재하는 페놀 하이드록실(OH)기는 여러 화합물과 결합하는 성질을 가지며 항산화, 항암 및 항균 효과 등의 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.
총 페놀 함량은 갈산을 표준물질로 이용하여 검량선(R2=0.9991)을 작성해서 결과를 나타내었다(도 3). 인공광원별 황기의 총 페놀 함량 측정 결과 LEP 처리구에서 36.05 ㎎/㎖로 가장 높은 함량을 나타냈으며, LED 백색광 처리구에서 8.76 ㎎/㎖로 가장 낮았다. LED 조건에서는 청색광 처리구에서 12.27 ㎎/㎖으로 가장 높은 함량을 나타냈으나 대체로 비슷한 값을 나타내었다.
실시예 3: 인공광원 처리별 황기의 총 플라보노이드 함량 검정
플라보노이드는 활성산소종을 효과적으로 제거하여 항산화능이 높다고 알려져 있으며 폴리페놀과 마찬가지로 항바이러스, 항염증, 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
총 플라보노이드 함량은 퀘르세틴을 표준물질로 이용하여 검량선(R2=0.9975)을 작성해서 결과를 나타내었다(도 4). 인공광원별 황기의 총 플라보노이드 함량 측정 결과 LEP 처리구에서 5.94 ㎎/㎖로 가장 높은 함량을 나타냈으며, LED 적색광 처리구에서 2.46 ㎎/㎖, LED 백색광 처리구에서 2.44 ㎎/㎖으로 가장 낮았다.
실시예 4: 인공광원 처리별 황기의 미백활성 검정
보통 색소의 침착, 주근깨 등을 유발하는 멜라닌 색소는 티로신으로부터 티로시나아제의 효소작용에 의해서 생성되는 도파퀴논(dopaquinone) 등의 유도체를 경유하여 아미노산 및 단백질과의 중합반응으로 생성되며, 이에 티로시나아제 활성저해 효과가 높은 것은 미백효과가 높음을 의미한다.
인공광원별 황기의 미백활성 검정은 L-티로신을 기질로 사용하여 머쉬룸 티로시나아제에 의한 L-도파퀴논이 저해하는 정도를 분광광도계를 이용하여 측정하였다(도 5). 양성대조군인 코직산은 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖ 농도별로 처리한 결과, 47.44%, 94.57%, 98.87%의 저해도를 나타내었다. 인공광원별 황기 시료에 의한 티로시나아제 저해활성은 LEP 조건에서 1,000 ㎍/㎖일 때 65.49%로 다른 처리구들에 비해 약 2배 이상 높은 저해활성을 나타내었다. LED 처리구에서는 처리농도가 증가함에 따라 티로시나아제 저해활성도 일정하게 증가하는 것을 확인하였으나 그 수준은 미비하였으며, LEP 최저농도인 100 ㎍/㎖ 처리구보다 저해활성도가 낮았다.
실시예 5: 인공광원 처리별 황기의 유효성분 분석
1) 주요 플라보노이드 성분 분석
황기의 주요 플라보노이드 성분으로는 칼리코신(calycosin), 포르모노네틴(formononetin)이 대표적이며, 1년근 황기에는 포르모노네틴보다 칼리코신이 많이 함유되어 있는 것으로 확인된 바 있다. 본 실험에서는 형광등을 처리한 대조구의 경우, 포르모노네틴이 칼리코신보다 10배 이상 많이 함유하게 되는 것을 확인할 수 있고, 이러한 양상은 LED 처리구에서도 보여졌다. 반면, LEP 처리구에서 포르모노네틴 함량은 24.55 ㎎/g으로 다른 인공광원 처리 황기의 약 1.7배 높은 수준으로 검출되었고, 칼리코신은 66.62 ㎎/g으로 다른 인공광원 처리 황기에 비해 약 27.3배의 함량이 검출되었고, LEP 처리구에서는 1년근 황기와 비슷한 양상으로 포르모노네틴보다 칼리코신이 많이 함유하는 것을 확인할 수 있었다(표 1).
| 광원 종류 | 포르모노네틴(㎎/g) | 칼리코신(㎎/g) |
| 대조구(형광등) | 14.21 | 1.41 |
| 적색광 | 14.12 | 3.55 |
| 청색광 | 15.11 | 4.10 |
| 녹색광 | 14.66 | 0.74 |
| 백색광 | 14.81 | 2.40 |
| LEP | 24.55 | 66.62 |
2) 폴리페놀계 성분 분석
인공광원별 황기에 대한 23종의 페놀화합물 함량을 UHPLC로 정량 분석하였다(표 2). 갈산에서는 LEP 조건에서 19.96 ㎍/g으로 가장 높은 값을 나타내었고, 프로토카테큐산(Protocatchuic acid)에서는 LED 녹색광(3.73 ㎍/g), 백색광(2.69 ㎍/g)을 제외한 다른 처리구에서는 검출되지 않았다. 겐티신산(Gentisic acid)은 LEP 처리구(376.64 ㎍/g)에서 가장 높았고, 다른 LED 처리구 조건에서는 청색광(20.71 ㎍/g), 백색광(20.21 ㎍/g)이 다른 LED 조건에 비해 높은 함량을 나타내었다. p-하이드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)에서는 LEP(43.58 ㎍/g)를 제외한 다른 광원에서는 비슷한 함량을 나타내었고, 클로로겐산(chlorogenic acid)과 카테킨(catechin)은 다른 LED 처리구에 비해 LEP 처리구가 약 5배, 30배의 함량이 증가한 것을 확인하였다.
시린직산(Syringic acid)에서는 백색광(23.59 ㎍/g)과 LEP 처리구(35.50 ㎍/g)가 높은 함량을 나타내었고, 바닐린(vanillin)은 LEP 처리구(128.74 ㎍/g)가 다른 광원 처리구에 비해 약 9배 정도 높게 검출되었다. p-쿠마린산(p-coumaric acid)에서도 LEP 처리구(1435.52 ㎍/g)에서 가장 많이 검출되었고, LED 처리구 중에서는 청색광(850.56 ㎍/g)과 백색광(968.57 ㎍/g)에서 다른 LED 광원에 비해 많이 검출되었다. 페룰산(Ferulic acid)은 LEP 처리구(164.00 ㎍/g)에서 함량이 높았으며, 청색광(63.53 ㎍/g)이 다른 LED 처리구들에 비하여 함량이 높았다. m-쿠마린산(m-coumaric acid)에서는 LEP 처리구(328.37 ㎍/g)가 다른 광원보다 약 3배 높은 함량이 검출되었고, 루틴은 LEP 처리구(13,198.35 ㎍/g)가 다른 광원 처리구들에 비해 264배로 모든 성분들 중에서 가장 많은 함량 차이를 나타내었다. o-쿠마린산(o-coumaric acid)은 LEP 처리구(1,055.58 ㎍/g)가 높았고, LED 적색광(214.82 ㎍/g)이 다른 LED 처리구들에 비해 높았다.
나린진(Naringin)은 LEP 처리구(337.80 ㎍/g)에서 가장 높았고, 미리세틴(myricetin)도 LEP 처리구(9,121.18 ㎍/g)이 가장 많은 함량이 검출되었고, 대조구(2,164.80 ㎍/g)가 LED 광원 처리구보다 10배 정도 많은 함량이 검출되었다. 레스베라트롤(Resveratrol)은 LEP 처리구(274.76 ㎍/g)가 가장 높고 대조구(4.95 ㎍/g)에서 가장 낮은 함량이 검출되었고, t-신남산(t-cinnamic acid)도 LEP 처리구(2,129.28 ㎍/g)가 높고, LED 청색광 처리구(540.22 ㎍/g)가 LED 광원 처리구 중에서 가장 함량이 높았다. 또한, 퀘르세틴과 나린게닌은 LEP 처리구에서 함량이 높게 검출되었으나 캠퍼롤에서는 LED 백색광 처리구(2,141.26 ㎍/g)가 모든 광원 처리구 중에서 가장 높게 검출되었다. 헤스페리틴은 LEP 처리구(262.46 ㎍/g)에서 다른 광원 처리구들보다 약간 높았고, 황기의 주요 플라보노이드 성분인 포르모노네틴도 LEP 처리구(296.28 ㎍/g)가 가장 높은 함량이 검출되었고, 나머지 광원 처리구에서는 비슷한 함량이 검출되었다. 바이오카닌 A에서는 LEP 처리구(245.04 ㎍/g)가 가장 높은 함량이 검출되었다.
결과적으로, 인공광원별 황기의 총 페놀 함량을 살펴본 결과, LEP 처리구에서 거의 모든 성분이 높게 검출되었으며, 특히 가장 많이 분포하는 물질은 루틴(13,198.35 ㎍/g), 퀘르세틴(8,984.92 ㎍/g), 나린게닌(14,608.65 ㎍/g)이였다.
| 광원 종류 | 대조구 | 적색광 | 청색광 | 녹색광 | 백색광 | LEP |
| GA | 2.88 ±0.33 |
5.59 ±3.24 |
3.20 ±1.32 |
2.75 ±0.65 |
1.30 ±0.22 |
19.96 ±6.12 |
| PA | - | - | - | 3.73 ±0.28 |
2.69 ±0.43 |
- |
| GT | 6.75 ±0.49 |
6.30 ±5.26 |
20.71 ±6.51 |
1.10 ±15.50 |
20.21 ±9.13 |
376.64 ±17.19 |
| pH | 14.05 ±0.20 |
12.96 ±1.41 |
13.39 ±0.73 |
10.68 ±0.16 |
12.06 ±1.36 |
43.58 ±15.08 |
| CA | 195.13 ±4.83 |
197.84 ±9.69 |
224.34 ±0.74 |
165.56 ±8.01 |
267.84 ±0.57 |
1,104.49 ±137.55 |
| CN | 48.80 ±1.70 |
71.43 ±21.41 |
74.36 ±8.54 |
59.78 ±0.03 |
74.66 ±13.69 |
2527.32 ±25.01 |
| SA | 2.66 ±0.78 |
11.93 ±0.61 |
15.64 ±0.21 |
5.16 ±0.74 |
23.59 ±3.49 |
35.50 ±21.36 |
| VN | 21.50 ±1.45 |
17.22 ±1.72 |
16.30 ±0.41 |
17.68 ±1.18 |
14.92 ±0.30 |
128.74 ±24.76 |
| pC | 393.61 ±9.95 |
561.90 ±34.56 |
850.56 ±17.64 |
395.14 ±11.47 |
968.57 ±109.09 |
1,435.52 ±26.44 |
| FA | 24.66 ±0.70 |
30.00 ±0.62 |
63.53 ±7.06 |
18.68 ±0.78 |
28.35 ±0.31 |
164.00 ±55.48 |
| mC | 125.65 ±2.51 |
112.26 ±0.45 |
105.39 ±2.65 |
104.09 ±0.75 |
138.71 ±0.46 |
328.37 ±39.07 |
| RN | 59.19 ±3.99 |
46.16 ±2.65 |
53.29 ±0.19 |
32.53 ±3.73 |
64.82 ±0.13 |
13,198.35 ±377.05 |
| oC | 99.92 ±1.48 |
214.82 ±1.10 |
84.97 ±3.86 |
53.10 ±5.43 |
80.90 ±2.59 |
1,055.58 ±33.10 |
| NA | 20.41 ±4.80 |
32.20 ±0.07 |
21.51 ±1.23 |
28.58 ±0.32 |
40.49 ±1.40 |
337.80 ±9.94 |
| MY | 2,164.80 ±1934.80 |
256.74 ±205.31 |
300.89 ±260.54 |
446.91 ±78.04 |
254.20 ±18.01 |
9,121.18 ±4011.28 |
| RE | 4.95 ±0.82 |
9.71 ±2.18 |
4.31 ±1.79 |
11.09 ±2.19 |
11.75 ±2.64 |
274.76 ±20.04 |
| tC | 260.28 ±1.04 |
449.57 ±8.87 |
540.22 ±6.95 |
284.04 ±2.30 |
437.37 ±2.35 |
2,129.28 ±36.34 |
| QN | 284.41 ±30.59 |
408.07 ±5.67 |
749.43 ±14.93 |
247.83 ±27.99 |
316.94 ±25.39 |
8,984.92 ±244.14 |
| NG | 195.07 ±4.77 |
361.36 ±8.82 |
314.59 ±5.11 |
382.50 ±3.68 |
456.19 ±18.62 |
14,608.65 ±6.91 |
| KA | 1319.25 ±1.93 |
1,860.25 ±95.40 |
1,852.29 ±14.45 |
1,806.27 ±19.19 |
2,141.26 ±80.73 |
547.82 ±37.17 |
| HN | 94.52 ±1.27 |
144.17 ±23.49 |
162.67 ±16.58 |
104.75 ±10.91 |
131.71 ±19.45 |
262.46 ±0.60 |
| FN | 13.49 ±1.82 |
18.20 ±1.12 |
15.09 ±1.30 |
13.41 ±1.38 |
11.69 ±3.44 |
296.28 ±17.50 |
| BA | 41.72 ±1.51 |
29.54 ±7.20 |
23.25 ±3.24 |
32.14 ±2.77 |
20.65 ±3.85 |
245.04 ±5.43 |
GA: 갈산(Gallic acid), PA: 프로토카테큐산(Protocatechuic acid), GT: 겐티신산(Gentisic acid), pH: p-하이드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), CA: 클로로겐산(Cholrogenic acid), CN: 카테킨(Catechin), SA: 시린직산(Syringic acid), VN: 바닐린(Vanillin), pC: p-쿠마린산(p-coumaric acid), FA: 페룰산(Ferulic acid), mC: m-쿠마린산(m-coumaric acid), RN: 루틴(Rutin), oC: o-쿠마린산(o-coumaric acid), NA: 나린진(Naringin), MY: 미리세틴(Myricetin), RE: 레스베라트롤(Resveratrol), tC: t-신남산(t-cinnamic acid), QN: 퀘르세틴(Quercetin), NG: 나린게닌(Naringenin), KA: 캠퍼롤(Kaempferol), HN: 헤스페리틴(Hesperetin), FN: 포르모노네틴(Formononetin), BA: 바이오카닌 A(Biochanin A)
실시예 6: 인공광원별 황기의 플라보노이드 생합성 유전자 발현 양상 검정
황기의 인공광원별 플라보노이드 생합성 관련 유전자 발현 양상을 검정한 결과, 최종산물인 칼리코신 합성에 관여하는 유전자인 I3H가 LED 적색광, 청색광, LEP 처리구에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 플라보노이드 생합성 경로의 가장 업스트림(upstream)에 관여하는 PAL 유전자의 경우 다른 광원들에 비해 LEP 처리구에서 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. CHS와 CHI 유전자에서는 LED 녹색광을 제외하고 모든 광에서 발현되었으며, IFS 유전자에서는 LED 적색광 처리구에서 발현이 증가하였다(도 6).
Claims (9)
- 삭제
- 삭제
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- (a) 황기 종자를 23~27℃의 배양실에서 상토가 담긴 포트에 심는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 심은 황기 종자에 LEP(Light emitting plasma)를 하루에 16시간 동안 조사하여 재배하는 단계를 포함하는 총 페놀 화합물 함량 또는 총 플라보노이드 화합물 함량 증가로 인한 항산화 활성 증진 및 미백 활성이 증진되는 것을 특징으로 하는 황기의 재배방법. - 제4항의 방법으로 재배된 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기.
- 제5항의 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 함유하는 가공식품.
- 제5항의 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
- 제5항의 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강식품 조성물.
- 제5항의 항산화 및 미백 활성이 증진된 황기를 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학 조성물.
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