KR20110022472A - 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 자연산 미역 엽상체, 양식산 미역 엽상체, 다시마, 미역귀 또는 구멍쇠 미역의 추출물은 안지오텐신 전환효소(ACE)를 저해함으로써, 안지오텐신 전환효소의 작용으로 발생하는 혈압상승을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 인체에 대한 안전성이 높으므로, 이를 함유하는 조성물은 고혈압의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

해조류, 미역 엽상체, 다시마, 미역귀, 구멍쇠 미역, 안지오텐신 전환효소(ACE), 고혈압

Description

해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the extract of sea algae for preventing and treating hypertension}

본 발명은 자연산 미역 엽상체, 양식산 미역 엽상체, 다시마, 미역귀 또는 구멍쇠 미역의 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

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우리나라는 예부터 해조를 식용, 호료(糊料), 약용, 사료, 비료, 해조 공업의 원료 등으로 이용하여 왔다. 최근에는 해조류에서 특정 성분을 추출하여 이용하는 이른바 건강식품, 생리활성물질 원료로서도 각광을 받고 있다. 그런데 실제로 이와 같은 용도로 이용되는 해조의 종류는 그리 많지 않으며, 약 60~70종류 정도에 불과하다(林浩 외 2, 水産加工利用學, 螢雪出版社, pp.277-278, 1994).

해조류는 정미성분을 다량 함유하고 있어 천연 조미소재로서의 이용가치가 높지만 해조류 탄수화물의 대부분이 비소화성 복합 다당류로서 산이나 알칼리에 비교적 안정하고 특수한 세균효소에 의하지 않고서는 분해되기가 어려워 이용에 제한이 있다(이중화, 조한옥, 해조류의 산업적 이용(제1보) 해조류의 일반성분 및 무기질, 수도여사대 논문집, 6, p.325, 1972).

해조류 중 가장 흔한 미역과 다시마를 보면, 미역의 탄수화물은 매니트(mannit)나 알긴산 등이며, 단백질은 12~13% 정도 포함되어있고, 요오드는 다시마가 0.34%인데 반해 0.03%에 불과하다. 다시마와 미역은 성분의 약 절반이 탄수화물이고, 그 중 20%가 섬유질이며 나머지가 알긴산과 푸코이단(fucoidan)이다(장현기, 남궁석, 식품학개론, 유림문화사, pp.118-119, 1991).

양식미역과 자연산미역을 구분하여 성분 차이를 연구하였는데, 양식미역이 자연산미역에 비해 클로로필과 카로티노이드(carotenoid)의 함량이 훨씬 적은 것으로 나타났으며, 유리아미노산 함량은 자연산미역에 비해 일률적으로 낮은 것으로 나타났다. 또한 양식산, 자연산 미역 모두 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine) 및 글루탐산(glutamic acid)의 함량이 높고, 세린(serine)과 프롤린(proline)은 거의 함유되어 있지 않으며, 히스티딘(histidine)과 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine) 및 페닐알라닌(phenylalanine)은 그 함량이 극히 낮은 것으로 나타났으며, 글루탐산(glutamic acid)과 아스파르트산(aspartic acid)은 자연산, 양식산 미역의 차이가 현저했으며, 필수 아미노산과 가용성 무기질(약12%)은 우수하게 함유되어 있다. Blanching 처리 후 미역 중에 마니톨(mannitol)과 가용성 무기질이 감소하는데, 클로로필과 카로티노이드는 유지되었다고 알려졌다(변재형 외 2, 養殖미역의 品質要因과 그 加工 韓國水産學會志, 10(2), pp.125-135, 1977).

최근 들어 식품 성분의 생체 기능 조절을 해명하기 위한 생리 활성 물질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는데, 이중 해조 성분 중의 생리 활성 작용에 대한 연구를 살펴보면, 참김에서 추출된 포르피신(porphysin)은 쉐이(shay) 궤양을 rat(체중 200g) 실험에서 5mg의 투여로서 완전히 저지하였으며, 꼬시레기에서 추출된 베르코신(vercosin)은 쉐이(shay) 궤양에 대해서는 12.5%의 저지율을 나타내고, 스트레스성 궤양에 대해서 37.5%의 저지율을 나타내었다고 알려졌다(坂上良男, 海藻の生化學と利用(日本水産學會 編), 恒星社厚生閣，東京，pp.95-100, 1983).

손 등은 실험동물인 스프라그-도울리(Sprague- Dawley)종의 흰쥐를 대상으로 혈압 변화를 특정한 결과, 귤 껍질의 주요 바이오플라보노이드(bioflavonoid) 성분인 헤스페리딘(hesperidin)이 약물 투여 후 유의성있게(p<0.001) 혈압 저하 효과가 있음을 관찰하였다고 보고하였으며(손홍수 외 3, 감귤의 Bioflavonoids 분리, 정제 및 혈압강하효과, 한국영양식량학회지, 21(2), p.136, 1992),

金 등은 쥐에게 10주동안 green laver(Enteromorpha compessa), tangle(Laminaria japonica), purple laver (Pophyra tenera)를 건조 및 분말화시켜 콜레스테롤과 섞어 각각 5% 비율로 먹인 결과, green laver와 purple laver는 확실하게 쥐의 혈장 콜레스테롤을 감소시켰는데, tangle은 효과가 없었으며, 이 해조류는 쥐의 간 콜레스테롤을 낮추는 데는 효과가 없다고 보고되었다(金田志, 德田節子, 荒井君枝, 水産物のコレステロホ―ル代謝にああほす影響に關する究-I. 食用海藻の效果, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 29(11), pp.1020-1023, 1963).

또한, Porphyra tenera를 먹인 쥐의 혈장 콜레스테롤이 현저히 낮아지는 효과에 대한 대사를 알아보기 위하여 purple laver를 먹인 쥐와 먹이지 않은 쥐의 배설물에서 콜레스테롤의 양을 비교해 본 결과, Purple laver를 먹인 쥐의 배설물에서 많은 콜레스테롤의 증가를 확인했다는 보고가 있다(阿部重信, 武田芙美, 金田志 水産物のツロネスミコレステロ― ル代謝におよほす影響に關する究-Ⅶ. コレステロ―ルの體分布とその排泄量におよぼすアクの影響, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 33(11), pp.1050-1055, 1967).

고혈압은 1차성 고혈압과 2차성 고혈압으로 분류가 된다. 다시 1차성 고혈압은 그 증상의 정도에 따라 경증, 중등도, 중증으로 나누어질 수 있는데, 경증인 경우, 식염 섭취를 감소시키고, 체중 조절, 스트레스, 운동부족을 해소함으로써 치료 가능하지만 중등도 이상인 경우, 식이요법과 동시에 혈압 강하제를 투여하여야 한 다. 한편, 유전적 요인이 큰 1차성 고혈압의 경우, 단백질을 제한하는 것으로 알고 있었다. 그러나 질소평형을 유지시키기 위해서 신장의 기능이 정상으로 단백질의 분해물인 질소를 배설할 수 있는 한 양질의 단백질을 충분히 공급하여야 한다. 이에 혈압 강하제로 이용하는데 있어서 식품 단백질로부터 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting Enzyme; kinase Ⅱ, Peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1, 이하 ACE 라 약함) 저해 펩티드를 분리하는 것이 깊은 연관성이 있는 것으로 사료된다.

혈압 상승 요인의 하나인 안지오텐신(Angiotensin) -1 전환 효소(ACE)는 혈압 강하작용을 가지는 브래디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화시키고 불활성 상태의 안지오텐신 -1 C 말단 디펩티드(dipepetide; His - leu)를 절단하여 강한 혈압상승작용을 나타내는 안지오텐신-Ⅱ로 활성화시켜 고혈압의 원인이 되는데, 젤라틴의 가수분해물로부터 그 식품 단백질 유래의 안지오텐신 전환 효소(ACE)저해 펩티드가 발견되었다(Oshima, G. et al., Peptide inhibitors of angiotensin-I converting enzyme in digests of gelatin by bacterial cillagenase. Biochim . Biophys . Acta, 566, p.128, 1979). 주로 식품 단백질의 가수 분해물에 많이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 유효성분 가수 분해물로는 카제인(casein)(Maruyama, S. et al., Angiotensin-I converting enzyme inhibitory activity of the C-terminal hexapeptide of αs1-casein. Agric. Biol. Chem., 51, pp.2557-2567, 1987), 옥수수 단백질인 제인(zein)(Miyoshi, S. et al., Structures and activity of angiotensin-converting enzyme inhibitors in an α- zein hydrolysate. Agric. Biol. Chem., 55, pp.1313-1318, 1991) 등, 새우의 유래 펩티드(池田克己, 奈良安雄, 家森幸男, 高血壓自然發症學會抄錄, p.101, 1987), 메밀분(최면 외 4, 메밀 보충 급여가 백서의 혈당 및 혈압에 미치는 영향. 한국영양식량학회지, 20(4), p.300, 1991), 영지의 에탄올 가용 분획물(박준희 외 4, 한국산 영지의 혈압 강하 성분에 관한 연구, 식품위생학회지, 2(2), p.57, 1987), 청주(淸酒)(齊藤義幸, 中村圭子, 川戶章嗣, 今安 聰, 酒, およぴ副物中のアンギオテソツソ變換酵素沮害物質. Nippon NKaishi, 66(7), pp.1081-1087, 1992)가 있으며, 도 등은 전통 기호 음료 원료에서 추출한 수용성 획분의 ACE 저해 작용은 생강 > 오갈피 > 오미자 > 들깨 > 결명자 > 모과 > 대추 순으로 나타났다고 보고하였으며(도정룡 외 3, 기호음료 성분의 Angiotensin - I 전환 효소 저해작용, 한국식품과학회지, 25(5), pp.456-460, 1993), 그 외 여러 식품에서 ACE저해 펩티드를 찾으려는 연구가 이루어졌다(Maruyama, S. et al., Angiotensin - I converting enzyme inhibitors derived from Ficus Carica. Agric. Biol. Chem., 53(10), p.2763, 1989).

해조 중의 유용물질에 대한 효과적인 추출 방법에 관한 연구 보고를 살펴보면, 유 등은 해조의 수용성 및 식염 가용성, 알콜 가용성, NaOH 가용성 단백질의 추출에 관하여 보고하였으며(유흥수, 이강호, 해조 단백질 추출에 관한 연구 1. 수용성 단백질의 추출, 한국수산학회지, 10, p.151, 1977; 유흥수 외 2, 해조 단백질 추출에 관한 연구 2. 식염가용성 및 알콜 가용성 단백질의 추출, 한국수산학회지, 10, p.189, 1977; 유흥수 외 2, 해조 단백질 추출에 관한 연구 3. NaOH 가용성 단 백질의 추출, 한국수산학회지, 11, p.85, 1978), 김 등은 다시마의 효과적 추출을 위한 종합적인 추출 방법의 개발에 대해 다시마를 다당류 분해효소인 viscozyme, celluclast, ultrazyme을 사용하여 분해할 경우, viscozyme과 celluclast를 1:1로 혼합한 후 분해하는 것이 고형분 및 단백질 수율 그리고 상등액율 면에서 가장 적절하다고 보고하였는데, 다시마 열수 추출(60~100℃)시 온도가 증가할수록 가용성 고형분과 단백질 수율이 높았고, 추출 1시간 이후부터는 완만한 증가를 보였다고 보고하였다(김우정 외 2, 다시마의 효과적 추출을 위한 종합적인 추출 방법의 개발, KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL, 26(1), pp.51-56, 1994; 이정근 외 3, 다시마 추출액의 특성에 미치는 추출온도의 영향, 한국영양식량학회지, 22(6), pp.771-776, 1993). 또한, 구 등은 한국산 다시마 및 미역으로부터 fucoidan의 추출 및 정제에서 추출 수율이 다시마 2.71%, 미역 포자엽 6.65%, 미역 엽상체 0.40%로 나타나 부위에 따른 차이가 크다고 보고하였다(구재근 외 3, 한국산 다시마 및 미역으로부터 Fucoidan의 추출 및 정제, J. Korean Fish. Soc. 28(2), pp.227-236, 1995).

또한, 김(金)은 비식용 해조 중 구멍갈파래에 19%, 개말에 17%들어 있는 단백물질을 추출하였는데, 조단백질의 추출 조건은 Tris buffer보다 물로 추출한 것이 좋으며, 단백질의 분리 회수도 비등점에서 하는 것이 가장 수율이 좋다고 보고하였다(김준평, 비식용 해조에서 단백질의 개발연구 1. 비식용해조에서 단백질의 추출조건 및 분리된 조단백질의 아미노산 조성, KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL, 6(1), 1974).

한편, 해조의 생리활성에 대한 연구 대상이 미식용 해조에서는 곤란한 점이 많다. 왜냐하면 까다롭고 번거로우며 비경제적인 독성시험으로 안전성 시험을 해야만 이용 가능한 것으로 인정받을 수 있기 때문이다. 의외로 자주 식용하고 있는 해조에 대해서조차 항고혈압성분의 대량 분리 정제에 관한 연구가 잘 되어있지 않다.

따라서, 미역, 다시마 등 오랫동안 일상적으로 식용해오면서 전혀 독성 문제가 관찰되지 않은 식용 해조들을 대상으로 하여 분리 동정을 시도해봄으로써 성인병의 하나인 고혈압의 예방과 해조 중의 약용 물질 추출이라는 해조의 색다른 고부가가치적 이용을 모색하고자 한다.

이에 본 발명자들은 일상적으로 식용하여 독성에 대해 안전하고, 동해안에서 다량 채취가 가능한 해조류의 추출물에 의한 고혈압 예방 및 치료 효과에 대해 지속적으로 연구한 결과, 자연산 미역 엽상체, 양식산 미역 엽상체, 다시마, 미역귀 또는 구멍쇠 미역의 추출물이 안지오텐신 전환효소(ACE)를 저해함으로써, 안지오텐신 전환효소의 작용으로 발생하는 혈압상승을 효과적으로 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 해조류는 자연산 미역 엽상체(Natural Undaria pinnatifida), 양식산 미역 엽상체(Cultural Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria japonica), 미역귀(Sporophyll of Undaria pinnatifida) 또는 구멍쇠 미역(Agarum cribrosum), 바람직하게는 다시마(Laminaria japonica)를 포함함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 등의 극성 용매 또는 이들의 혼합용매에 가용한 극성 용매 가용 추출물, 바람직하게는 물 또는 메탄올 등의 극성 용매 가용 추출물, 보다 바람직하게는 상온에서 물로 추출한 상온수 추출물 또는 고온에서 물로 추출한 열수 추출물, 보다 더 바람직하게는, 분자량 20000 달톤 이상의 고분자 물질을 다량 함유한 고분자 다량 함유 상온수 추출물, 구체적으로는 글루코스 0 mg/ml, 질소 0.01∼0.02 mg%, 단백질 0.105∼0.2 mg%, NH₂-N 10∼20 mg% 성분 분석범위를 갖는 고분자 다량 함유 상온수 추출 분획물 또는 분자량 20000 달톤 이하의 저분자 물질을 다량 함유한 저분자 다량 함유 열수 추출물, 구체적으로는 글루코스 0∼0.0005 mg/ml, 질소 0.01∼0.05 mg%, 단백질 0.1∼0.2 mg%, NH₂-N 10∼20 mg% 성분 분석 범위를 갖는 고분자 다량 함유 상온수 추출 분획물을 포함하며; 또한 상기 극성 용매 가용 추출물을 제거하고 남은 잔사를 에테르, 아세톤 등의 비극성 용매, 바람직하게는 에테르, 아세톤 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 아세톤 등의 비극성 용매로 추출하여 수득되는 비극성 용매 가용 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물은 자연산 미역 엽상체(Natural Undaria pinnatifida), 양식산 미역 엽상체(Cultural Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria japonica), 미역 포자엽(미역귀; Sporophyll of Undaria pinnatifida) 또는 구멍쇠 미역(Agarum cribrosum) 건조물을 세절 및 분쇄하는 제 1단계; 분쇄물 각각에 약 1 내지 1000배(v/w), 바람직하게는 약 50 내지 200배(v/w)의 물 등의 추출용매를 가하여 균질화한 다음, 상온에서 30분 내지 3시간, 바람직하게는 1시간동안 추출한 후, 원심분리하여 얻은 상등액을 진공동결건조하여 상온수 추출물(RWF-1)을 수득하는 제 2단계; 제 2단계의 상등액을 제거한 잔사에 증류수를 각각 가하여 50 내지 150℃, 바람직하게는 100℃에서 30분 내지 3시간, 바람직하게는 1시간동안 추출한 후, 원심분리하여 얻은 상등액을 진공동결 건조하여 열수 추출물(HWF-1)을 수득하는 제 3단계; 제 3단계의 상등액을 제거한 잔사에 아세톤, 메탄올 순으로 추출 및 여과하고, 농축하여 아세톤추출물(AF-1) 및 메탄올추출물(MF-1)을 수득하는 제 4단계의 추출방법(1)을 통하여 본 발명의 해조류 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 자연산 미역 엽상체(Natural Undaria pinnatifida), 양식산 미역 엽상체(Cultural Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria japonica), 미역 포자엽(미역귀; Sporophyll of Undaria pinnatifida) 또는 구멍쇠 미역(Agarum cribrosum) 건조물을 세절 및 분쇄하는 제 1단계; 분쇄물 각각에 약 1 내지 1000배(v/w), 바람직하게는 약 50 내지 200배(v/w)의 증류수를 가하여 상온에서 30분 내지 3시간, 바람직하게는 1시간동안 추출한 후, 여과하여 얻은 여과액을 진공 동결건조하여 상온 수추출물(RWF-2)을 수득하는 제 2단계; 제 2단계의 여과액을 제거한 잔사를 에테르, 아세톤 및 메탄올 순으로 추출 및 여과하고, 농축하여 각각 에테르추출물(EF-2), 아세톤추출물(AF-2) 및 메탄올추출물(MF-2)을 수득하는 제 3단계; 제 3단계의 여과액을 제거한 잔사에 증류수를 각각 가하여 50 내지 150℃, 바람직하게는 100℃에서 30분 내지 3시간, 바람직하게는 1시간동안 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액을 진공동결건조하여 열수추출물(HWF-2)을 수득하는 제 4단계의 추출방법(2)을 통하여 본 발명의 해조류 추출물을 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 고분자 다량 함유 상온수 추출물 또는 저분자 다량 함유 열수 추출물은 상기한 상온수 추출물 또는 열수 추출물을 대상으로 당업계에 통상적인 한외 여과법 등의 분자량 차이에 의한 여과법으로 추출 및 분리 정제가 가능하다.

본 발명은 상기의 추출방법으로 얻어진 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물은 일반에 식용하는 식품으로서, 독성 및 부작용 등의 문제가 없는 안전한 식품으로서 의약품 또는 건강식품으로서의 개발 가능성이 높다고 판단된다.

또한, 본 발명의 추출물은 안지오텐신 전환효소(ACE)를 효과적으로 저해함으로써 안지오텐신 전환효소의 작용으로 발생하는 혈압상승을 효과적으로 억제함으로써 고혈압 치료에 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네 슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 추출방법으로 얻어진 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 고혈압의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물은 고혈압의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성 물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 자연산 미역 엽상체, 양식산 미역 엽상체, 다시마, 미역귀 또는 구멍쇠 미역의 추출물은 안지오텐신 전환효소(ACE)를 저해함으로써, 안지오텐신 전환효소의 작용으로 발생하는 혈압상승을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 인체에 대한 안전성이 높으므로, 이를 함유하는 조성물은 고혈압의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명 의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 해조류 추출물의 제조

자연산 미역 엽상체(줄기포함, Natural Undaria pinnatifida, 이하 “NUP”라 함)는 동해 정동에서 6월에 채취 및 건조한 것을 구입하였고, 양식산 미역 엽상체(Cultural Undaria pinnatifida, 이하 “CUP”라 함)는 울진에서 3월에 채취 및 건조한 것을, 다시마(Laminaria japonica, 이하 “LJ”라 함) 및 미역 포자엽(미역귀; Sporophyll of Undaria pinnatifida, 이하 “SUP”라 함)은 주문진에서 6월에 채취 및 건조한 것을, 구멍쇠 미역(Agarum cribrosum, 이하 “AC”라 함)은 고성에서 6월에 채취 및 건조한 것을 구입하여 정방 1cm 크기로 세절한 후 믹서로 1분간 3번 분쇄하여 저온실에 보관하면서 사용하였다.

1-1. 추출방법(1)에 의한 추출물의 제조

도 1에 나타낸 추출방법(1)으로, 상기에서 준비한 자연산 미역 엽상체(NUP), 양식산 미역 엽상체(CUP), 다시마(LJ), 미역귀(SUP) 및 구멍쇠 미역(AC) 분쇄물 각각 10g에 증류수 1000ml을 각각 가하고 1분동안 균질화(Homegenize)한 다음, 상온에서 1시간동안 교반 추출한 후, 원심분리(HITACHI, 6000rpm, 15℃, 10min)하여 상등액과 잔사를 얻었다. 상등액을 진공동결건조하여 상온수추출물(이하, “RWF-1”라 함)을 수득하였으며, 잔사에 증류수 1000ml을 각각 가하여 수조(KMC-1205 SW1, 100℃)에서 1시간동안 추출하고 원심분리(HITACHI, 6000rpm, 15℃, 10min)하여 상 등액을 진공동결건조하여 열수추출물(이하, “HWF-1”라 함)을 수득하였고, 잔사는 아세톤 1000ml, 메탄올 1000ml 순으로 추출 및 여과(Toyo fiter No.4)하고, 회전식 진공증발기(Japan, A-3S)로 농축하여 각각 아세톤추출물(이하, “AF-1”라 함) 및 메탄올추출물(이하, “MF-1”라 함)을 수득하였다.

1-2. 추출방법(2)에 의한 추출물의 제조

도 2에 나타낸 추출방법(2)으로, 상기에서 준비한 자연산 미역 엽상체(NUP), 양식산 미역 엽상체(CUP), 다시마(LJ), 미역귀(SUP) 또는 구멍쇠 미역(AC) 분쇄물 각각 10g에 증류수 1000ml을 각각 가하고 상온에서 1시간동안 교반 추출한 후, 여과(Toyo fiter No.4)하여 여과액과 잔사를 얻었다. 여과액을 진공동결건조하여 상온수추출물(이하, “RWF-2”라 함)을 수득하였으며, 잔사는 에테르 1000ml, 아세톤 1000ml, 메탄올 1000ml 순으로 추출 및 여과하고, 회전식 진공증발기(Japan, A-3S)로 농축하여 각각 에테르추출물(이하, “EF-2”라 함), 아세톤추출물(이하, “AF-2”라 함) 및 메탄올추출물(이하, “MF-2”라 함)을 수득하였고, 잔사에 증류수 1000ml을 각각 가하여 water bath(KMC-1205 SW1, 100℃)에서 1시간동안 추출하고 원심분리(HITACHI, 6000rpm, 15℃, 10min)하여 상등액을 진공동결건조하여 열수추출물(이하, “HWF-2”라 함)을 수득하였다.

상온수추출물(RWF-1 및 RWF-2) 및 열수추출물(HWF-1 및 HWF-2)은 증류수에 녹여 시료액으로 사용하였고, 아세톤추출물(AF-1 및 AF-2) 및 에테르추출물(EF-2) 은 아세톤(HPLC Grade, UV Cutoff 330nm)에 녹여 시료액으로 사용하였으며, 메탄올추출물(MF-1 및 MF-2)은 DMSO(Dimethyl Solfoxide, C₂H₆SO)에 녹여 모두 냉장 온도에 보관하여 사용하였다.

참고예 1. 시약의 준비

항고혈압성 측정용 시약인 Lung acetone powder(Rabbit 유래) 및 Hippuryl-His-Leu(Acetate Salt)는 Sigma*(미국)에서 구입하였으며, Trinitrobenzene Sulfonate(TNBS)는 東京化成*(일본)에서 구입하였고, 이외에는 분석용 일급 시약을 구입하여 사용하였다.

실험예 1. 추출 수율 측정

상기 실시예에서 수득한 추출물의 수율은 추출에 사용한 시료의 건조물에 대한 추출물의 총 Soluble Solid 함량의 백분비로 하여 하기 수학식 1로 산출하여 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다.

수율(%) =

5종의 시료를 각 용매별로 순차 추출하여 얻은 추출 구간별 수율을 측정한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 추출방법(1)에서 시료 용매 추출 구간별 수율을 살펴보면, 상온수추출물(RWF-1)에서는 최소 양식산 미역 엽상체(CUP)가 12.5%이고, 최대 자연산 미역 엽상체(NUP)이 42.1%까지 나타나, 평균 수율 34%로 비교적 높은 수율을 보였으나, 열수추출물(HWF-1), 아세톤추출물(AF-1) 및 메탄올추출물(MF-1)에서는 평균 수율이 각각 10.5%, 3.1%, 2.8% 순으로 나타나, 상온수추출물(RWF-1)에 비하여 매우 낮은 수율을 확인할 수 있었다.

또한, 표 2에 나타난 바와 같이, 추출방법(2)에서 시료 용매 추출 구간별 수율을 살펴보면, 상온수추출물(RWF-2)에서는 최소 양식산 미역 엽상체(CUP)가 13.5%이고, 최대 미역귀(SUP)가 42.9%까지 나타나, 평균 수율 28.6%로 추출방법(1)과 마찬가지로 비교적 높게 나타났는데, 에테르추출물(EF-1), 아세톤추출물(AF-2), 메탄올추출물(MF-2) 및 열수추출물(HWF-2)에서는 평균 수율이 각각 7.0%, 2.0%, 1.5%, 9.2%로 나타나, 상온수추출물(RWF-2)에 비하여 역시 낮은 수율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

Yield(%)	RWF-1	HWF-1	AF-1	MF-1
자연산 미역 엽상체(NUP)	42.1	9.0	2.66	0.3
양식산 미역 엽상체(CUP)	12.2	11.7	3.6	0.5
다시마(LJ)	37.7	12.3	1.0	10.4
미역귀(SUP)	40.1	8.7	5.4	1.3
구멍쇠 미역(AC)	38.2	10.8	2.8	1.6

Yield(%)	RWF-2	EF-2	AF-2	MF-2	HWF-2
자연산 미역 엽상체(NUP)	33.4	7.8	0.6	0.9	10.5
양식산 미역 엽상체(CUP)	13.5	6.7	0.3	0.1	10.2
다시마(LJ)	30.3	4.3	1.0	1.2	5.6
미역귀(SUP)	42.9	11.5	7.7	3.1	13.4
구멍쇠 미역(AC)	23.0	4.5	0.6	2.3	6.1

실험예 2. 항고혈압성 검사

상기 실시예에서 수득한 시료의 안지오텐신(Angiotensin) -Ⅰ 전환 효소(Convertiong enzyme)에 대한 활성 저해능을 문헌에 개시된 방법을 응용하여 항고혈압 활성을 하기와 같이 확인하였다.

2-1. Angiotensin - Ⅰ convertiong enzyme(ACE) 조효소액 조제

ACE 조효소액 조제는 Cushman and Cheung의 방법(Cushman, D. W. and Cheumg, H. S., Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin converting enzyme of rabbit lung, Biochem. Pharm., 20, p.1637, 1971)에 따라 도 3에 나타낸 방법으로 조제하였다.

즉, Lung acetone powder(rabbit, sigma Co.) 1g에 Sodium borate buffer(PH 8.5) 10ml를 넣어 5℃, 24시간 교반 후, 원심분리(10000rpm, 30min)하고, 상등액을 조효소액으로서 취하여 4℃에 보관하여 사용하였다.

2-2. Angiotensin - Ⅰ converting enzyme(ACE) 저해 활성 측정

ACE 저해 활성 측정은 TNBS(Trinitrobenzene Sulfonate)를 이용한 색도계 측정의 방법(Toshiro Matsui, et al., Colorimetric Measurement of Angiotensin -I Converting Enzyme Inhibitory Activity with Trinitrobenzene Sulfonate Biosci, Biotech. Biochem., 56(3), pp.517-518, 1992)에 따라 하기 표 3의 조성으로 사용하였다.

즉, 시료액 25μl에 50μl의 Hip-His-Leu(2.5mM in borate buffer containing 200mM NaCl, pH 8.3)을 넣은 다음, 상기 실험예 2-1에서 조제한 ACE 조효소액을 5배 희석하여 50μl을 넣어 37℃에서 1시간 배양(incubation)하였다. 반응 정지액으로 0.5N HCl 250μl을 첨가하였고, pH는 Kolthoff buffer(0.1M Na₂HPO₄-1.0N NaOH (1:2)) 250μl로 조절하였고, 이어 TNBS Solution 25μl 넣어 20분간 배양(incubation)한 후, Sulfite(4mM Na₂SO₃ in 0.2M NaH₂PO₄)를 넣어 가시광선 분광광도계(ultraviolet-visible Spectrophotometer; Beckman England)로 416nm에서의 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2를 사용하여 ACE 저해율을 산출하였으며, 효소 활성을 50% 저해하는 데 필요한 ACE 저해제의 양을 IC₅₀로 하여, 이 활성 측정 양상은 도 4와 같이 나타내었다.

AS : 시료 첨가구의 흡광도

AB : 시료 무첨가구의 흡광도

AC : 대조구의 흡광도

	Vol (μl)
	Blank	Control	Sample
저해제(Inhibitor)	-	-	25
H2O	25	25	-
ACE solution	50	50	50
0.5N HCl	400	-	-
12.5mM Hip-His-Leu	150	150	150
Incubated at 37℃ for 90min
0.5N HCl	-	400	400
Kolthoff buffer *1	250	250	250
0.1M TNBS solution	25	25	25
Incubated at 37℃ for 20min
Sulfite *2	4500	4500	4500
Measured at 416nm
*1 0.1M Na2HPO4 . 1.0N NaOH (1:2) *2 4mM Na2SO3 in 0.2M NaH2PO4

실험결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 추출방법(1)에서 다시마(LJ)의 열수추출물(HWF-1)에서 IC₅₀(μg/ml)가 12.4(μg/ml)로, 가장 낮은 농도에서 ACE 저해 효과가 있었으며, 자연산 미역 엽상체(NUP), 양식산 미역 엽상체(CUP), 다시마(LJ), 구멍 쇠미역(AC)의 상온수추출물(RWF-1)에서 각각 15.9(μg/ml), 14.9(μg/ml), 15.5(μg/ml), 13.3(μg/ml)로 높게 나타났으며, 자연산 미역 엽상체(NUP), 구멍 쇠미역(AC)의 열수추출물(HWF-1)에서도 각각 14.4(μg/ml), 13.3(μg/ml)로 높게 나타났다. 아세톤추출물(AF-1)에서는 양식산 미역 엽상체(CUP)의 ACE 저해 효과가 20.3(μg/ml)로 높게 나타났다. 메탄올추출물(MF-1)에서는 다시마(LJ)에서만 272.7(μg/ml)로 ACE 저해 효과를 나타내었다.

또한, 표 5에 나타난 바와 같이, 추출방법(2)에서의 ACE저해 효과를 살펴보면, 추출방법(1)과 마찬가지로 다시마(LJ)의 상온수추출물(RWF-2) 및 열수추출물(HWF-2)에서 각각 10.4(μg/ml)로 높은 효과를 보였으며, 상온수추출물(RWF-2)에서는 자연산 미역 엽상체(NUP), 양식산 미역 엽상체(CUP), 구멍 쇠미역(AC)이 각각 21.4(μg/ml), 14.4(μg/ml), 24(μg/ml)로 비교적 높게 나타났으며, 에테르추출물(EF-2)에서는 자연산 미역 엽상체(NUP), 양식산 미역 엽상체(CUP)가 30.2(μg/ml), 68.7(μg/ml)로 비교적 높은 효과를 보인 반면, 다시마(LJ), 구멍쇠 미역(AC)은 103.9(μg/ml), 150.1(μg/ml)로 미역보다 낮은 효과를 나타내었다. 아세톤추출물(AF-2)에서는 양식산 미역 엽상체(CUP)가 31.4(μg/ml)로 가장 높은 반면, 자연산 미역 엽상체(NUP), 다시마(LJ), 구멍 쇠미역(AC)이 각각 288.5(μg/ml), 184.0(μg/ml), 336.8(μg/ml)로 양식산 미역 엽상체(CUP)보다 낮았다. 메탄올추출물(MF-2)에서는 다시마(LJ)만 169.4(μg/ml)를 나타내었다. 열수추출물(HWF-2)에서는 자연산 미역 엽상체(NUP), 양식산 미역 엽상체(CUP)가 각각 16.3(μg/ml), 40.8(μg/ml)로 비교적 높게나왔다. 미역귀(SUP)는 추출방법(1)과 마찬가지로 모든 추출물에서 ACE저해 효과가 미약하게 나타남을 확인할 수 있었다.

한편 鈴木 등은 식품 중에 존재하는 ACE 저해 인자는 가열 처리에 안정하며, 체내에서 흡수가 용이한 저분자 물질로서 그 저해능은 혈압 강하제보다 활성이 낮지만 상시 섭취하는 식품 중에 존재한다는 점에서 그 유용성이 기대된다고 보고하였는데(鈴木建夫, 石川宣子, 目黑 熙, 食品中のアソゾオテソシソI轉換 酵素 沮害能につぃて. 日本農藝化學會志, 57(11), pp.1143-1146, 1983), 본 실험에서도 시료별로 최대 항고혈압성을 가지는 용매 추출 추출물은 전체적으로 극성이 강한 물 추출물인 상온수추출물(RWF-1 및 RWF-2), 열수추출물(HWF-1 및 HWF-2)에서 높은 효과를 보이며, 대체로 해조에서의 항고혈압성분 물질은 비극성 용매 보다는 극성 용매에서 추출되는 물질임을 확인할 수 있었다.

IC50 *1(μg/ml)	RWF-1	HWF-1	AF-1	MF-1
자연산 미역 엽상체(NUP)	15.9	14.4	177.0	N.D.*2
양식산 미역 엽상체(CUP)	14.9	9.1	20.3	N.D.
다시마(LJ)	15.5	12.4	110.1	272.7
미역귀(SUP)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
구멍쇠 미역(AC)	13.3	13.3	317.7	N.D.
*1IC50 means the sample concentration to inhibit 50% of ACE inhibitory ratio *2N.D. : not detected

IC50 *1(μg/ml)	RWF-2	EF-2	AF-2	MF-2	HWF-2
자연산 미역 엽상체(NUP)	21.4	30.2	288.5	N.D.*2	16.3
양식산 미역 엽상체(CUP)	14.4	68.7	31.4	N.D.	40.8
다시마(LJ)	10.4	103.9	184.0	169.4	10.4
미역귀(SUP)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
구멍쇠 미역(AC)	24	150.1	336.8	N.D.	N.D.
*1IC50 means the sample concentration to inhibit 50% of ACE inhibitory ratio *2N.D. : not detected

실험예 3. 한외 여과에 의한 생리 활성 물질의 분리 및 회수율 측정

상기 실험예 2에서 항고혈압성 활성이 전반적으로 높았던 추출물에 대한 활성물질의 대량 분리정제를 위하여 한외 여과법을 실시하였다. 한외 여과 장치는 plate and frame type의 모듈(module)을 갖는 system(DDS, japan; KSA/ISO 9001 SAM YEON)으로서, 막 면적은 0.0336m²이며, 사용된 막은 FS 61 PP로서 분획 분자량은 20,000이다. 공급액은 실험이 진행되는 동안 계속하여 교반을 실시하였으며, 항온 순환기(circulator)를 열교환기와 연결시켜서 module로 들어가기 전에 온도를 일정하게 유지하였다. 실험이 완료된 후에는 여과막(filter membrane)을 초기 물 유입(water flux)이 회복될 때까지 충분히 물로 세정하였다.

투과액으로 회수되는 각 성분의 회수율(Recovery yield)은 하기 수학식 3으로 계산하였다.

C_p : 투과액의 고형분 함량

C_F : 처리액의 고형분 함량

ACE 저해 효과를 IC₅₀(㎍/ml)로 비교해 본 결과, 대체로 추출방법(1) 및 추출방법(2)의 순차 용매 추출 모두 강한 항고혈압 활성을 나타낸 다시마(LJ)의 상온수추출물, 열수추출물에 대하여 일상 식이에 가까운 추출방법(1)에서 얻어진 자연산 다시마(LJ)의 상온수추출물(RWF-1) 및 열수추출물(HWF-1)을 여과막 제한치(filter membrane Cut off)가 20000인 한외 여과 장치를 이용하여 분리한 후, 자연산 다시마(LJ)의 상온수추출물(RWF-1) 및 열수추출물(HWF-1)을 원액, 고분자물질(분자량이 20000 달톤 이상) 및 저분자물질(분자량이 20000 달톤 이하)로 각각 나누어 회수율 및 ACE 저해 효과를 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.

실험결과, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 회수율은 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 중 분자량이 20000 달톤 이상인 것은 9%, 분자량이 20000 달톤 이하인 것은 78.8%로 회수되었으며, 다시마 열수추출물(LJ-HWF-1) 중 분자량이 20000 달톤 이상인 것은 64%, 분자량이 20000 달톤 이하인 것은 28.7%로 비교적 높게 회수되었다. 또한, ACE 저해 효과를 살펴보면, IC₅₀(㎍/ml)가 다시마 열수추출물(LJ-HWF-1) 중 분자량 20000 달톤 이하인 것이 24.9(㎍/ml)로 그 활성이 가장 높았으며, 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 중 분자량 20000 달톤 이상인 것에서 25.1(㎍ /ml)로 활성이 높았다. 한편, 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 중 분자량 20000 달톤 이하인 것은 297.6(㎍/ml)로, 활성은 다른 추출물에 비해 다소 낮았으나 절대값으로 볼 때, 강한 활성을 확인할 수 있었다.

그 외 해조 중에 존재하는 알긴산(alginate) 및 셀룰로오스(cellulose)에 대해 그 항고혈압 활성을 측정해 본 결과, 알긴산나트륨(sodium alginate) 300과 알긴산나트륨 900 및 셀룰로오스의 IC₅₀(㎍/ml)의 농도가 각각 134.6(㎍/ml), 111.1(㎍/ml) 및 53.1(㎍/ml)로 확인할 수 있었다.

		weight(회수율%)	IC50(㎍/ml)
다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1)	(원액)	0.2g	316.5
	고분자(20000 Da 이상)	0.018g (0.9%)	25.1
	저분자(20000 Da 이하)	0.1575g (78.8%)	297.6
다시마 열수추출물(LJ-HWF-1)	(원액)	0.06g	93.9
	고분자(20000 Da 이상)	0.0384g (64.0%)	42.4
	저분자(20000 Da 이하)	0.0172g (28.7%)	24.9
Sodium alginate 300			134.6
Sodium alginate 900			111.1
Cellulose			53.1

실험예 4. 해조류 추출물의 정성적 성분 검출

20% 탄산나트륨(sodium carbonate)용액을 시료액이 spotting되어 있는 여지 위에 분무하고, ciluted Folin-ciocalteau reagent-H₂O(50:50, v/v) 용액을 추가로 분무하여, 청색으로 발색된 spot으로 페놀성분을 검출하였다.

또한, 닌하이드린 시약(ninhydrin(triketohydridene) reagent) 0.25g을 에탄올 100ml에 섞어 시료액이 spotting되어 있는 여지 위에 분무한 다음, 120~150℃로 10~15분간 가열하여 아미노산, 아미노당류은 청색으로 발색된 아미노산 및 아미노당류를, 적자색으로 발색된 지질을, 보랏빛으로 발색된 vitamin류를 검출하였다.

질산은 포화 수용액(AgNO₃-H₂O≒22:10, w/w) 1ml를 아세톤 253ml에 녹인 용액 및 2% NaOH 용액에 시료액이 spotting되어 있는 여지를 각각 침지시켰다가 풍건한 후, 발색하면 5% Na₂S₂O₃(sodium thiosulfate)에 씻어 흑갈색의 spot으로 발색된 당류를 검출한 후 수세하여 건조, 보존하였다. 당류는 환원력의 세기에 따라 흑갈색의 spot으로 나타나며, 검출 감도는 글루코오스(glucose) 1μg으로도 발색할 정도로 높다.

실험결과, 하기 표 7에 나타난 바와 같이, 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 및 열수추출물(LJ-HWF-1)에 대한 고분자물질 및 저분자물질의 정성 반응을 살펴보면, Phenol 성분 검출 지시약인 Folin's 시약에서는 4가지 시료액 모두 반응이 없음을 확인할 수 있었으며, ACE 저해 요인인 peptide 여부는 amino acid와 peptide성분의 검출 지시약인 ninhydrin 시약으로 검출해 본 결과, 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 저분자물질에서 강하게 검출된 것으로 보아, 다시마의 저분자 물질인 ACE 저해 peptide가 상온수 추출로 많이 회수된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 항고혈압성을 당 성분으로 나타낼 수도 있는데, 당 성분 검출은 질산은(AgNO₃) 포화 수용액을 지시약으로 검출해 본 결과, 역시 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 저분자물질에서 강하게 검출되었으며, 다시마 열수추출물(LJ-HWF-1) 저분자물질에서도 약하게 검출되었음을 확인할 수 있었다.

	다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1)		다시마 열수추출물(LJ-HWF-1)
	고분자 (20000 Da 이상)	저분자 (20000 Da 이하)	고분자 (20000 Da 이상)	저분자 (20000 Da 이하)
Folin's 지시약	-	-	-	-
Ninhydrin 시약	-	+++	-	-
AgNO3 수용액	-	+++	-	+
+++ : dark color, + : light color

실험예 5. 해조류 추출물의 정량적 성분 분석

5-1. 환원당 정량

Somogyi 변법(조현규 외 5, 식품 분석법(1), p.246, 1993)을 이용하여 당량을 정량하였다. 즉, 시료액 5ml에 A액(Na₂CO₃ : C₄H₄O_{6 ·}K·Na·5H₂O = 25g : 25g 을 물 500ml에 넣은 후, 10% CuSO₄ 용액 75ml, NaHCO₃ 20g, KI 5g, N/10 KIO₃ 용액 200ml을 넣어 11로 정용) 5ml를 넣어 15분간 수조(water bath)에서 가열하고, 3분간 냉각한 후, 5H H₂SO₄ 1ml를 넣어 2분간 냉각시키고 전분 지시약을 0.1ml 가한 후, B액(N/10 Na₂S₂O₃을 20배 희석)으로 적정하여 하기 수학식 4를 이용하여 당량을 정량하였다.

B : blank 적정치(ml)

A : Sample액 적정치(ml)

f : 0.005N - Na₂S₂O₃의 역가(factor)

D : 희석 배수

S : sample 채취량(g)

5-2. 단백질 정량

Kjeldahl 질소 정량법(조현규 외 5, 식품 분석법(1), p.246, 1993)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 즉, 시료액 5ml에 분해 촉진제와 25ml H₂SO₄로 수상치환하여 0.1N NaOH로 적정하여 하기 수학식 5 내지 수학식 7을 이용하여 단백질을 정량하였다.

V₀ : blank test의 0.1N NaOH 소비 ml수

V₁ : 본 실험에 필요한 0.1N NaOH 소비 ml수

f : 0.1N - NaOH 표준 용액 factor

S : Sample 채취량

N : 질소 환산 계수

5-3. 아미노테질소 ( NH ₂ -N) 정량

동염법(銅鹽法)(小原 哲二郞, 식품분석 Hand book, Kenpakusha, Tokyo, pp.53-60, 1969)으로 아미노산(amino acid) 및 펩티드(peptide)가 Cu와 반응하여 청색의 착염을 형성하고 알라닌(alanine)의 Cu-복합염으로 치환하여 각 아미노산간의 흡삭 생도의 차를 없애고 620nm의 흡광도를 측정하였다.

즉, 시료액 5ml에 물 70ml를 넣어 20분간 수조(water bath)에서 가열하고 10분간 냉각한 후, 원심분리를 거쳐 상등액을 5ml 취하여 인산동 현탁액 5ml를 가하여 다시 원심분리한 후, 상등액을 620nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 8을 이용하여 아미노테질소를 정량하였다.

1260/13 : 검량 곡선상의 기울기

D : 희석배수

실험결과, 하기 표 8에 나타난 바와 같이, 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 및 열수추출물(LJ-HWF-1)을 한외 여과로 분리한 고분자물질 및 저분자물질의 당, 단백질 및 아미노테질소(NH₂-N) 함량비율이 두 분자량 그룹 사이에 비슷한 수준을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

즉, 아직 한외 여과만으로 확실한 분리 정제가 이루어졌다고는 할 수 없지만, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 추출물에 대한 항고혈압 활성 측정결과, 다시 마 상온수추출물(LJ-RWF-1)의 경우는 한외 여과만으로도 확연한 고활성 분획을 얻어낼 수가 있었으므로, 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 및 열수추출물(LJ-HWF-1)은 점성이 높아 일반 column법에 의한 분리정제는 매우 힘들기 때문에 한외 여과에 의한 활성물질 분리정제도 큰 의미가 있다고 볼 수 있다.

		글루코오스 (mg/ml)	질소 (mg%)	단백질 (%)	NH2-N (mg%)
다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1)	고분자(20000 Da 이상)	0	0.0168	0.105	13.956
	저분자(20000 Da 이하)	0.001	0.0182	0.1138	13.375
다시마 열수추출물(LJ-HWF-1)	고분자(20000 Da 이상)	0.0005	0.0238	0.1488	8.14
	저분자(20000 Da 이하)	0.0002	0.0238	0.1488	14.538

하기에 본 발명의 해조류 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

다시마 열수추출물(LJ-HWF-1) 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

다시마 열수추출물(LJ-HWF-1) 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

다시마 열수추출물(LJ-HWF-1) 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

F20815508H220000110

[부처명]

한국해양수산기술진흥원

[연구사업명]

수산특정연구개발산업

[연구과제명]

해조정유(essence oil)의 수산가공품 고품질화 첨가제로서의 응용 및 기능성 소재 제품화

[주관기관]

강릉원주대학교

[연구기간]

2008년 12월 01일 ~ 2011년 11월 30일

도 1은 추출방법(1)에 의한 추출물의 제조과정을 나타낸 도이고,

도 2는 추출방법(2)에 의한 추출물의 제조과정을 나타낸 도이며,

도 3은 Angiotensin - Ⅰ convertiong enzyme(ACE) 조효소액을 조제하는 과정을 나타낸 도이고,

도 4는 TNMS(-, blank) 및 TNP-HIs-Leu(--, control)의 흡광도(against borate buffer at 416nm)를 나타낸 도이며,

도 5는 추출방법(1)에 의한 상온수추출물(RWF-1)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이고,

도 6은 추출방법(1)에 의한 열수추출물(HWF-1)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이며,

도 7은 추출방법(1)에 의한 아세톤추출물(AF-1)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이고,

도 8은 추출방법(2)에 의한 상온수추출물(RWF-2)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이며,

도 9는 추출방법(2)에 의한 에테르추출물(EF-2)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이고,

도 10은 추출방법(2)에 의한 아세톤추출물(AF-2)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이며,

도 11은 추출방법(2)에 의한 열수추출물(HWF-2)의 Angiotensin-Ⅰconverting enzyme(ACE) 저해 활성을 나타낸 도이고,

도 12는 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 및 열수추출물(LJ-HWF-1)을 한외 여과로 분리한 고분자물질 및 저분자물질의 아미노산 및 펩티드의 검출 결과(R-1: 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1)의 고분자물질/ R-2: 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1)의 저분자물질/ H-1: 다시마 열수추출물(LJ-HWF-1)의 고분자물질/ H-2: 다시마 열수추출물(LJ-HWF-1)의 저분자물질)를 나타낸 도이며,

도 13은 다시마 상온수추출물(LJ-RWF-1) 및 열수추출물(LJ-HWF-1)을 한외 여과로 분리한 고분자물질 및 저분자물질의 당 성분의 검출 결과를 나타낸 도이다.

Claims (7)

1. 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 해조류는 자연산 미역 엽상체(Natural Undaria pinnatifida), 양식산 미역 엽상체(Cultural Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria japonica), 미역귀(Sporophyll of Undaria pinnatifida) 또는 구멍쇠 미역(Agarum cribrosum)을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 등의 극성 용매 또는 이들의 혼합용매에 가용한 극성 용매 가용 추출물; 또는 상기 극성 용매 가용 추출물을 제거하고 남은 잔사를 에테르, 아세톤 등의 비극성 용매로 추출하여 수득되는 비극성 용매 가용 추출물을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 추출물은 상온수 추출물 또는 열수 추출물을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 추출물은 분자량 20000 달톤 이상의 고분자 물질을 다량 함유한 고분자 다량 함유 상온수 추출물 또는 분자량 20000 달톤 이하의 저분자 물질을 다량 함유한 저분자 다량 함유 열수 추출물을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
6. 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품.
7. 제 6항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.

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