CN104480176A

CN104480176A - 鲢鱼dpp-iv抑制多肽及其应用

Info

Publication number: CN104480176A
Application number: CN201410546577.2A
Authority: CN
Inventors: 陈尚武; 张颖
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-10-15
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2034-10-15
Also published as: CN104480176B

Abstract

本发明涉及一种鲢鱼DPP-Ⅳ抑制多肽及其应用，所述鲢鱼抑制多肽为淡水鱼鲢鱼鱼肉蛋白经蛋白酶精细水解所得的天然产物，即鲢鱼蛋白酶解功能多肽。鲢鱼蛋白经胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解后制备得到的DPP-Ⅳ抑制多肽不仅具有良好的DPP-Ⅳ抑制活性，抑制率高达51.59％(多肽浓度5mg/mL)，并且拥有良好的耐受胃肠消化稳定性。所述DPP-Ⅳ抑制多肽具有天然，安全，高效，成本低特点，是非常有前景的针对糖尿病预防或治疗的食品功能基料，可用于制备预防或辅助治疗受益于DPP-IV抑制的疾病的药物或功能食品。

Description

鲢鱼DPP-IV抑制多肽及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的淡水鱼鲢鱼多肽及其应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是目前世界范围内增长速度最快和发病率最为广泛的疾病之一，已经成为仅次于肿瘤和心血管疾病的“第三号杀手"。糖尿病作为由多种遗传和环境因素相互作用而引起的一组慢性代谢异常综合症，是由于胰岛素相对或绝对缺乏，以及周围靶组织不同程度对胰岛素抵抗引起的碳水化合物、蛋白质，脂肪代谢紊乱引发的，它可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变、肢体坏疽以致截肢、昏迷等多种并发症的发生，严重危害人类健康。其中2型糖尿病(T2DM)占患者总数的90-95％。

目前Ⅱ型糖尿病的治疗以小分子口服药为主，磺脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮类和α-糖苷酶抑制剂是常用的Ⅱ型糖尿病治疗药物，但随着时间的推移它们的疗效逐渐降低，并且存在着较多的不良反应。目前，基于肠促胰素的治疗包括胰升血糖素样肽1(GLP-1,glucagon-like peptide-1)类似物及二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂成为糖尿病新药研究的热点。而相对于GLP-1类似物，DPP-IV抑制剂具有可口服使用，更少的胃肠道不良反应及更好的耐受性，及其它可能的更多益处。

自从2006年8月默克公司研制的DPP-Ⅳ抑制剂西他列汀在墨西哥上市后，国外越来越多的人致力于化学合成的DPP-IV抑制剂，目前有很多已进入待批和II、Ⅲ期临床阶段。这些化学合成药物虽然在临床前和临床实验中并未表现出严重的副作用，只是出现一些诸如恶心、瘙痒和鼻咽炎等的不良反应，但因为DPP-IV本身也担负着许多生理学功能，比如和CD45一起发挥共刺激作用可促进T细胞激活、增殖，也可以使一些趋化因子、神经肽和小肽类激素失活等，长期服用是否会产生副作用的争议一直都存在。因此，如果能从天然药物或天然食物中获得具有DPP-IV抑制活性的功能物质，将对人类健康产生重大的影响。

近两年来从食物来源中寻找具有DPP-Ⅳ抑制活性的小分子活性肽已成为研究热点。DPP-Ⅳ抑制活性肽指的是一类具有抑制DPP-Ⅳ活性的、相对分子量较小的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各不相同，但都具有类似的功能。目前发现从食物蛋白经酶解或发酵产生的DPP-Ⅳ活性肽，一般链长含2-14个氨基酸残基。分子量低于1000Da，并且认为，肽N末端氨基酸为Pro，Phe，Tyr或序列中含有疏水氨基酸的肽段具有较高的DPP-Ⅳ抑制活性。

在我国，鲢鱼属大宗淡水养殖鱼类，因其肉薄、刺多，泥土味与鱼腥味不易去除，使得销售价格很低。作为一种高产、低值的淡水鱼，具有较高的开发价值。另外，目前以鲢鱼为原料加工的产品主要以初级加工产品为主，主要包括鱼糜、软罐头、风味鱼干、肉肠、鱼糕等，存在加工产品品种少，规模小，附加值低等问题。近些年来国内外已有一些采用酶解的方法对鱼蛋白进行深加工利用的研究报道。鱼蛋白被酶解后为肽段及氨基酸，具有相比全蛋白更高的生物活性，利用蛋白酶解制备鱼生物活性肽，是提高其附加值的有效途径之一。

因此，通过对鲢鱼发展精深加工，实现鲢鱼加工增值，使淡水鱼加工向加工多样化和高附加值方向发展，成为鲢鱼加工利用的一个重要研究方向，为促进淡水养殖业的发展具有积极的作用。

目前关于采用蛋白酶酶解食源性蛋白制备活性肽的研究很多，以鲢鱼为原料开发功能肽的研究也有所报道，如：尤娟等在“酶法制备鲢鱼蛋白抗氧化肽研究”(见《渔业现代化》，2010年第37卷第3期， 42-47)提供了5种蛋白酶水解鲢鱼鱼肉蛋白制备抗氧化肽的研究结果。

但目前以鲢鱼为原料经酶解反应制备DPP-IV抑制活性肽未见相关研究。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供具有耐胃肠消化能力的淡水鱼鲢鱼DPP-Ⅳ抑制活性多肽及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了具有DPP-Ⅳ抑制活性且耐胃肠消化的鲢鱼多肽。

本发明提供的一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的鲢鱼多肽，其由以下方法制备：鲢鱼鱼肉蛋白经胃蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶三段式酶解后制得的酶解物，经脱盐，即得。

所述鲢鱼鱼肉蛋白由以下方法制备：以鲢鱼为原料，经去鳞、去内脏，洗净，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜，再经灭除鱼肉内源性蛋白酶得到的。

优选地，所述鲢鱼鱼肉蛋白由以下方法制备：将鲢鱼杀死后，去鳞、去内脏，洗净后进行采肉，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜，然后鲢鱼肉糜与去离子水混合，调整蛋白质浓度为5％，将调整好蛋白质浓度的鱼肉浑浊液在95℃水浴锅内放置10min灭酶，冷却后进行均质处理，即得鲢鱼鱼肉蛋白。

所述经胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解具体包括以下步骤：

1)第一步酶解反应，胃蛋白酶：pH2.0、底物浓度5.0％、温度37℃、酶与底物比1％、水解时间为1h；

2)第二步酶解反应：将胃蛋白酶酶解物用下面的方法继续酶解胰酶：pH7.5、温度37℃、酶与底物比2％、水解时间为2h；

3)第三步酶解反应：将胰酶酶解物用下面的方法继续酶解：中性蛋白酶：pH7.5、温度45℃、酶与底物比3％、水解时间为6h。

4)灭活除杂：将中性蛋白酶酶解后的水解液经沸水浴10min灭活中最终水解液中的蛋白酶后，迅速冷却，酶解物离心，取上清。

上述方法中：

所述pH调节剂为盐酸、氢氧化钠或碳酸氢钠；

所述脱盐是指将三段式酶解得到的上清液以一定流速通过阳离子交换树脂进行脱盐，浓缩获得多肽液、或进一步冷冻或喷雾干燥后得到多肽粉。

本发明还提供了一种制备上述淡水鱼鲢鱼多肽的方法，该方法包括以下步骤：

1)将鲢鱼杀死后，去鳞、去内脏，洗净后进行采肉，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜，然后鲢鱼肉糜与去离子水混合，调整蛋白质浓度为5％，将调整好蛋白质浓度的鱼肉浑浊液在95℃水浴锅内放置10min灭酶，冷却后进行均质处理，即得鲢鱼鱼肉蛋白。

2)第一步酶解反应，胃蛋白酶：pH2.0、底物浓度5.0％、温度37℃、酶与底物比1％、水解时间为1h；

3)第二步酶解反应：将胃蛋白酶酶解物用下面的方法继续酶解胰酶：pH7.5、温度37℃、酶与底物比2％、水解时间为2h；

4)第三步酶解反应：将胰酶酶解物用下面的方法继续酶解：中性蛋白酶：pH7.5、温度45℃、酶与底物比3％、水解时间为6h。

5)灭活除杂：将中性蛋白酶酶解后的水解液经沸水浴10min灭活中最终水解液中的蛋白酶后，迅速冷却，酶解物离心，取上清；

6)脱盐：指将三段式酶解得到的上清液通过离子交换树脂进行脱盐，以1-2BV/h流速通过离子交换树脂，收集流出液，浓缩，即得。

上述方法中：

所述步骤5)中离心的速度和时间为1500-2500×g，10-20min，优选为1800×g，20min。

本发明还提供了含上述淡水鱼鲢鱼多肽的制剂，所述制剂中鲢鱼多肽占总重量的1-90％。本发明还提供了淡水鱼鲢鱼多肽在制备预防和治疗2型糖尿病或者慢性代谢综合紊乱症的药物或保健品中的应用，所述慢性代谢综合紊乱症有肥胖、免疫低下、心脑血管等病症。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的是以淡水鱼鲢鱼经三段式酶解方法制备的具有DPP-IV抑制活性的多肽。对于功能多肽产品制备来说，原料蛋白种类、酶解方式、酶解条件和制备目标决定着最终产品中的肽段组成，本发明所述制备得到的鲢鱼DPP-IV抑制活性多肽，与以往公开的所有类似产物都有所不同。

2、本发明提供的鲢鱼多肽，是鲢鱼鱼肉蛋白经胃蛋白酶+胰酶+中性蛋白酶三段式酶解后的水解物，具有良好的DPP-Ⅳ抑制活性，其抑制率可达到51.59％(多肽浓度5mg/mL)。

相比其它已公开的海水鱼而言，本发明提供的淡水鱼鲢鱼鱼肉蛋白经蛋白酶酶解后制得的多肽物，具有更高的DPP-Ⅳ抑制活性。且由于本发明是采用三段式蛋白酶酶解程序，前两步分别使用的胃肠消化酶胃蛋白酶和胰酶，所以最终得到的多肽产品可以耐受人体胃肠道蛋白酶的降解，从而顺利达到肠道更加有利人体利用。

3、本发明提供的鲢鱼多肽，可直接加工成药剂形式、或者制成膳食补充剂，直接面对糖尿病患者等特定消费群体，另外也可作为保健食品的功能成分，针对食品加工企业这个市场领域，用于加工成具有抗糖尿病保健作用的食品，尤其适合加入到水产加工制品中，以鱼肉蛋白制备的DPP-IV抑制多肽加入到水产品中再进一步加工成各种产品，无论从营养特性还是消费心理方面，都更容易为消费者和市场所接受。国内外还没有与此相同的产品。

本发明所述的鲢鱼DPP-Ⅳ抑制多肽，是从天然食物中获得具有 DPP-IV抑制活性的功能物质，以我国大宗淡水鱼鲢鱼为原料开发此类产品，相比现有技术具有安全、高效、成本低等特点。同时也加大了对鲢鱼资源的开发力度，提高了鲢鱼产品附加值，有助于我国淡水鱼产业的健康方向发展。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶的来源，其中：胃蛋白酶的生物来源为猪胃；胰酶的生物来源为牛胰腺，购自Sigma；中性蛋白酶的来源Bacillus amyloliquefaciens，购自山东信得利。

实施例1:鲢鱼鱼肉蛋白溶液的制备

将鲢鱼杀死后，去鳞、去内脏，洗净后进行采肉，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜；然后鲢鱼肉糜与去离子水混合，调整蛋白质浓度为5％，将调整好蛋白质浓度的鱼肉浑浊液在95℃水浴锅内放置10min灭酶，以灭除鱼肉中的内源性蛋白酶；冷却后进行均质处理，即得鲢鱼鱼肉蛋白溶液，冷冻干燥备用或直接进行下步酶解反应。

实施例2：淡水鱼鲢鱼多肽的制备

第一步酶解反应：称取一定量鱼肉蛋白粉，溶于蒸馏水中(5％，w/w)。将溶液置于37℃的恒温水浴内，当溶液温度升至37℃时，用1mol/L HCl将其pH值调至2.0，向溶液中添加胃蛋白酶启动第一步酶解反应，酶和底物的重量比即E:S为1％，37℃水解1h后，得到胃蛋白酶的酶解物；

第二步酶解反应：用0.9mol/L NaHCO₃调节胃蛋白酶的酶解物的pH值至5.3，随后用1mol/L NaOH调节其pH值至7.5，然后加入胰酶，酶和底物的重量比即E:S为2％，启动第二步酶解反应，37℃反应2h后，得到胰酶的酶解物；

第三步酶解反应：将胰酶的酶解物升至45℃，加入中性蛋白酶，酶和底物的重量比即E:S为3％，启动第三步酶解反应，并在45℃下维持6h，得到中性蛋白酶的酶解物；上述三步酶解反应进程中保持搅拌，并不断的添加1M NaOH或1M HCl维持各自反应体系pH值，使其处于最佳酶解状态。

灭活：三段式酶解反应结束后，水解液经沸水浴10min灭酶，迅速冷却，酶解物离心(1800×g，20min)，取上清，滤过液以2BV/h的流速过阳离子交换树脂脱盐，收集流出液，浓缩、得到鲢鱼DPP-IV多肽液，或进一步冷冻或喷雾干燥后得到多肽粉。

实验例3：酶解反应条件的优选

采用实施例2的方法，对酶解反应的酶解物及反应条件进行优选，并检测其最终产物中DPP-Ⅳ抑制活性，其结果见表1：

表1：酶解反应条件及酶解过程中的水解度和DPP-Ⅳ抑制活性

蛋白酶种类

底物浓度

pH

温度

酶/底物比

酶解时间

水解度

DPP-Ⅳ抑制率

酶解前

/

0h

0

7.74％

胃蛋白酶

5％

2.0

37℃

1％

1h

7.88％

40.57％

胰酶

5％

8.0

37℃

2％

3h

20.26％

47.98％

中性蛋白酶

5％

7.5

45℃

3％

3.5h

22.71％

49.34％

中性蛋白酶

5％

7.5

45℃

3％

4h

26.75％

49.56％

中性蛋白酶

5％

7.5

45℃

3％

6h

27.70％

50.66％

中性蛋白酶

5％

7.5

45℃

3％

9h

28.37％

51.59％

注：DPP-IV抑制率是在多肽浓度5mg/ml下测定

鲢鱼三段式蛋白酶解反应条件及酶解过程中的水解度和DPP-Ⅳ抑制活性的变化见表1。

由表1可以得知，鲢鱼鱼肉蛋白在三段式酶解过程中水解度一直在持续升高，鲢鱼蛋白序列中的DPP-IV抑制肽也在不断地被释放出来，且在最终第三段中性蛋白酶酶解6h后的水解物具备最高的DPP-Ⅳ抑制活性，抑制率达到51.59％(多肽浓度5mg/mL)。

因此，结合实际应用，确定三段式酶解的酶解条件为：第一步酶解反应，胃蛋白酶：pH2.0、底物浓度5.0％、温度37℃、酶与底物比1％、水解时间为1h；第二步酶解反应，胰酶：pH7.5、温度37℃、酶与底物比2％、水解时间为2h；第三步酶解反应，中性蛋白酶：pH7.5、温度45℃、酶与底物比3％、水解时间为6h。

酶解液经灭活除杂后再经离子交换树脂脱盐，其多肽脱盐率可达80％，并且其DPP-IV抑制活性没有明显变化，因此后续脱盐精制过程不会造成DPP-IV抑制活性肽的损失。

实施例3含有淡水鱼鲢鱼多肽饮料的制备

每100g产品配方中包含奶粉4g，白砂糖5.5g、AK糖0.015g、阿斯巴甜0.015g、复合稳定剂(Danisco，型号TSC-9188)0.5g、柠檬酸0.64g、柠檬酸钠0.37g、淡水鱼鲢鱼多肽0.06g(实施例2制备)、食用香精适量，加纯水至100g。

具体工艺为：奶粉按10％复原，降温至30℃以下；另将白砂糖和复合稳定剂混合均匀，在高速搅拌下加入70℃以上的热水中，搅拌至完全溶解，同样降温至30℃以下和复原乳混合，加入AK糖，阿斯巴甜和鲢鱼多肽粉，搅拌直至溶解，用柠檬酸和柠檬酸钠配成的水溶液调pH至4.0，调香，再经150-180bar压力均质，UHT杀菌(137℃，4s)后，冷却、灌装制成成品。

实施例4含有DPP-IV抑制链鱼蛋白水解活性肽-膳食纤维胶囊

取蘑菇粉(香菇粉、杏鲍菇粉、金针菇粉、黑木耳粉等食用真菌粉)、魔芋粉、菊糖粉、燕麦膳食纤维、小麦糊粉层粉等与鲢鱼蛋白活性肽粉混合，按常规工艺制成软、硬胶囊成品。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种具有DPP-Ⅳ抑制活性的淡水鱼鲢鱼多肽，其特征在于，其由以下方法制备：鲢鱼鱼肉蛋白经胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解后制得的酶解物，经脱盐，即得。

2.根据权利要求1所述的淡水鱼鲢鱼多肽，其特征在于，所述经胃蛋白酶、胰酶和中性蛋白酶三段式酶解包括以下步骤：

3)第三步酶解反应：将胰酶酶解物用下面的方法继续酶解：中性蛋白酶：pH7.5、温度45℃、酶与底物比3％、水解时间为6h；

4)灭活除杂：将中性蛋白酶酶解后的水解液经沸水浴10min灭活最终水解液中的蛋白酶后，迅速冷却，酶解物离心，取上清。

3.根据权利要求1所述的淡水鱼鲢鱼多肽，其特征在于，所述鲢鱼鱼肉蛋白由以下方法制备：以鲢鱼为原料，经去鳞、去内脏，洗净，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜，再经灭除鱼肉内源性蛋白酶得到的。

4.根据权利要求3所述的淡水鱼鲢鱼多肽，其特征在于，所述鲢鱼鱼肉蛋白由以下方法制备：将鲢鱼杀死后，去鳞、去内脏，洗净后进行采肉，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜，然后鲢鱼肉糜与去离子水混合，调整蛋白质浓度为5％，将调整好蛋白质浓度的鱼肉浑浊液在95℃水浴锅内放置10min灭酶，冷却后进行均质处理，即得鲢鱼鱼肉蛋白。

5.根据权利要求1所述的淡水鱼鲢鱼多肽，其特征在于，所述脱盐是指将三段式酶解得到的上清液通过离子交换树脂进行脱盐。

6.根据权利要求5所述的淡水鱼鲢鱼多肽，其特征在于，所述脱盐方法包括以下步骤：将三段式酶解得到的上清液以1-2BV/h流速通过离子交换树脂，收集流出液。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述的淡水鱼鲢鱼多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将鲢鱼杀死后，去鳞、去内脏，洗净后进行采肉，选取鲢鱼背部白肉，切成小块后用搅碎机搅成肉糜，然后鲢鱼肉糜与去离子水混合，调整蛋白质浓度为5％，将调整好蛋白质浓度的鱼肉浑浊液在95℃水浴锅内放置10min灭酶，冷却后进行均质处理，即得鲢鱼鱼肉蛋白；

4)第三步酶解反应：将胰酶酶解物用下面的方法继续酶解：中性蛋白酶：pH7.5、温度45℃、酶与底物比3％、水解时间为6h；

6)脱盐：指将三段式酶解得到的上清液通过离子交换树脂进行脱盐，以一定流速通过离子交换树脂，收集流出液，浓缩，即得。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)中离心的速度和时间分别为1500-2500×g，10-20min。

9.权利要求1-6任一项所述的DPP-Ⅳ抑制多肽粉在制备预防或辅助治疗受益于DPP-IV抑制的疾病的药物或食品中的应用。