CN111454352B - 一种活性蛋白hmei-a、活性蛋白hmei-a的编码基因及应用 - Google Patents

一种活性蛋白hmei-a、活性蛋白hmei-a的编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种活性蛋白HMEI‑A、活性蛋白HMEI‑A的编码基因及应用，属于生物医学技术领域，所述活性蛋白HMEI‑A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的活性蛋白HMEI‑A具有中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性，能够抑制中性粒细胞诱捕网形成，进而发挥抗炎作用。本发明的活性蛋白HMEI‑A能够用于制备抗炎药物，用于治疗炎症性疾病。

Description

一种活性蛋白HMEI-A、活性蛋白HMEI-A的编码基因及应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种活性蛋白HMEI-A、活性蛋白HMEI-A的编码基因及应用。
背景技术
菲牛蛭在广西俗称金边蚂蟥，是广西特色的药用动物资源。菲牛蛭在吸食宿主血液时，唾液腺会分泌大量活性成分，这些成分里包含抗炎因子、蛋白酶抑制剂、抗凝血因子及镇痛因子等。菲牛蛭来源的活性蛋白HMEI-A具有抗炎作用在现有技术中还没有报道过。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性蛋白HMEI-A、活性蛋白HMEI-A的编码基因及应用，本发明的活性蛋白HMEI-A具有中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性，具有抗炎作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种活性蛋白HMEI-A，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
优选的，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比具有1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列。
优选的，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比具有至少80％同一性的氨基酸序列。
本发明还提供了上述方案所述活性蛋白HMEI-A的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述方案所述的活性蛋白HMEI-A或者所述的编码基因在制备中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的活性蛋白HMEI-A或者所述的编码基因在制备抑制中性粒细胞诱捕网形成的药物中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的活性蛋白HMEI-A或者所述的编码基因在制备抗炎药物中的应用。
优选的，所述抗炎药物治疗的疾病包括急性肺炎或关节炎。
本发明的有益效果：本发明提供了一种活性蛋白HMEI-A，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。中性粒细胞在机体免疫应答中发挥非常重要的作用，其作为人体免疫系统的重要防线。当机体出现损伤或病原菌侵染时，中性粒细胞会迅速招募到损伤组织，并通过脱颗粒和吞噬发挥组织修复和清除病原菌作用。招募活化的中性粒细胞还通过释放诱捕网(Neutrophil extracellulartraps，NETs)杀伤病原菌和参加组织修复，且在该过程中，中性粒细胞弹性(Neutrophil elastase)蛋白酶发挥关键作用。在抑制其酶活性情况下诱捕网形成过程将会被完全抑制。本发明的活性蛋白HMEI-A具有中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性，能够抑制中性粒细胞诱捕网形成，进而发挥抗炎作用。本发明的活性蛋白HMEI-A能够用于制备抗炎药物，用于治疗炎症性疾病。
附图说明
图1为HMEI-A开放阅读框，图中所示HMEI-A基因(SEQ ID NO.1)编码的HMEI-A蛋白(SEQ ID NO.2)，灰色背景标出部分为HMEI-A信号肽，其余部分为HMEI-A成熟蛋白即本发明中所述中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂HMEI-A；
图2为HMEI-A的体外抗炎活性分析结果，图2中的a、b、c和d分别为PBS阴性对照组、100ng/ml PMA诱导组、100ng/ml PMA诱导且添加10μg/ml HMEI-A组和100ng/ml PMA诱导且添加50μg/ml分离纯化前粗蛋白组中中性粒细胞诱捕形成情况；
图3为图2中a～d组中性粒细胞诱捕形成百分比统计结果；
图4天然HMEI-A分离纯化，图4中的A为菲牛蛭头部酸性蛋白(蛋白等电点低于6.0)Sephadex G75凝胶过滤层析进行纯化，得到三个组分峰(I峰、II峰和III峰)，II峰为HMEI-A所在峰；图4中的B为A中II号峰蛋白通过高压反相C8分离纯化，得到纯的HMEI-A(图中箭头所示)。
具体实施方式
本发明提供了一种活性蛋白HMEI-A，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，具体为：ESDAECPPCPSGFTKDGNKCYRAYSTKLNWEAAHETCSKQNAHLVVVKDAATNDPLYKAVEPLKATCSENQDKTPGFWTAGKRDCDTNNFVWVTSHGTKWPMSYTNWNVGEPNNAKGNENCVHVIASDSKVGWNDTPCTFNYCFVCEVDL。本发明中，所述活性蛋白HMEI-A来源于菲牛蛭。
中性粒细胞在机体免疫应答中发挥非常重要的作用，其作为人体免疫系统的重要防线。当机体出现损伤或病原菌侵染时，中性粒细胞会迅速招募到损伤组织，并通过脱颗粒和吞噬发挥组织修复和清除病原菌作用。招募活化的中性粒细胞还通过释放诱捕网(Neutrophil extracellulartraps，NETs)杀伤病原菌和参加组织修复，且在该过程中，中性粒细胞弹性(Neutrophil elastase)蛋白酶发挥关键作用。在抑制其酶活性情况下诱捕网形成过程将会被完全抑制。本发明的活性蛋白HMEI-A具有高效抑制中性粒细胞弹性蛋白酶和抑制中性粒细胞诱捕网形成活性，能够作为强效的抗炎药物或者用于制备抗炎药物。
本发明中，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比具有1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列，优选的还包括与SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明中，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比具有至少80％同一性的氨基酸序列，包括优选为至少85％同一性的氨基酸序列、至少90％同一性的氨基酸序列、至少91％同一性的氨基酸序列、至少92％同一性的氨基酸序列、至少93％同一性的氨基酸序列、至少94％同一性的氨基酸序列、至少95％同一性的氨基酸序列、至少96％同一性的氨基酸序列、至少97％同一性的氨基酸序列、至少98％同一性的氨基酸序列、至少99％同一性的氨基酸序列。
本发明对所述活性蛋白HMEI-A的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，所述活性蛋白HMEI-A从菲牛蛭中直接分离纯化得到或者通过重组表达获得。
本发明还提供了上述方案所述活性蛋白HMEI-A的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GAAAGTGATGCAGAATGCCCACCTTGTCCTAGCGGTTTTACTAAAGACGGTAACAAGTGTTACAGGGCATATTCTACCAAATTGAATTGGGAGGCTGCTCACGAAACTTGCAGCAAACAGAACGCACATCTTGTTGTTGTAAAGGATGCTGCTACCAATGACCCTCTTTACAAGGCAGTCGAACCATTAAAAGCAACCTGCTCGGAAAACCAGGACAAAACCCCGGGCTTTTGGACTGCCGGAAAGAGAGATTGTGATACCAACAACTTTGTGTGGGTGACCAGCCATGGTACAAAATGGCCAATGTCTTACACCAACTGGAACGTAGGAGAGCCAAACAATGCTAAAGGAAACGAAAATTGTGTCCATGTCATTGCTTCTGACAGCAAGGTCGGCTGGAACGATACTCCCTGCACTTTCAATTACTGCTTTGTGTGTGAGGTTGACCTCTAA。
本发明具体实施过程中，通过使用离子交换(SephadexA-50)、反向高效液相色谱(RPHPLC)、蛋白测序技术和RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)，获得菲牛蛭中中性粒细胞弹性蛋白酶抑制活性蛋白HMEI-A的编码基因和氨基酸序列。
本发明还提供了上述方案所述的活性蛋白HMEI-A或者所述的编码基因在制备中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂中的应用。本发明菲牛蛭中性粒细胞弹性蛋白酶具有抑制作用，对人或其他哺乳动物的中性粒细胞弹性蛋白酶也具有抑制作用。
本发明还提供了上述方案所述的活性蛋白HMEI-A或者所述的编码基因在制备抑制中性粒细胞诱捕网形成的药物中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的活性蛋白HMEI-A或者所述的编码基因在制备抗炎药物中的应用；所述抗炎药物治疗的疾病优选的包括急性肺炎或关节炎。
本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，本领域常规剂型均可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1天然HMEI-A制备
用刀片把菲牛蛭的头从活体菲牛蛭切下，迅速放入液氮中冷冻。收集到足够量后用组织匀浆机研磨所有菲牛蛭头，12000g离心并收集上清；上清通过阴离子交换凝胶(SephadexA-50)富集菲牛蛭头部酸性蛋白(蛋白等电点低于6.0)；经过Sephadex G75凝胶过滤层析和高压反相C8分离纯化进一步纯化，最终得到一个纯度大98％HMEI-A蛋白，参见图4，其中图4中的A为菲牛蛭头部酸性蛋白(蛋白等电点低于6.0)Sephadex G75凝胶过滤层析进行纯化，得到三个组分峰(I峰、II峰和III峰)，II峰为HMEI-A所在峰；图4中的B为A中II号峰蛋白通过高压反相C8分离纯化，得到纯的HMEI-A(图中箭头所示)。
运用同样的方法也可以从菲牛蛭全虫中提取到HMEI-A蛋白。
实施例2大肠杆菌重组表达制备HMEI-A
首先对HMEI-A【(其开发阅读框见图1，图中所示HMEI-A基因(SEQ ID NO.1)编码的HMEI-A蛋白(SEQ ID NO.2)，灰色背景标出部分为HMEI-A信号肽，其余部分为HMEI-A成熟蛋白即本发明中所述中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂HMEI-A)】的密码子进行优化(且在其N端添加肠激酶酶切位点)和合成，把合成好的HMEI-A编码基因连接到pET-32a载体上并测序验证序列的正确性。转入大肠杆菌BL21中，摸索诱导剂IPTG的浓度，诱导温度以及诱导时间对HMEI-A表达水平的影响，摸索出表达量较高并且活性强的表达条件。
其次，HMEI-A表达产物分离纯化。由于HMEI-A表达产物为融合蛋白且带有HIS标签和肠激酶酶切位点，因此首先采用镍亲和层析进行初步分离纯化；纯化物透析脱盐后加入2倍体积肠激酶酶切缓冲液，加入适量肠激酶，25℃酶切24h；酶切产物通过阴离子交换柱进行分离纯化，目的蛋白进过透析或高压液相脱盐，得到纯的无盐高纯度HMEI-A蛋白，即HMEI-A。
实施例3酵母重组表达制备HMEI-A
首先对HMEI-A的密码子进行优化(且在其N端添加起始密码子和肠激酶酶切位点)和合成，把合成好的HMEI-A编码基因链接到pPICZaA载体上并测序验证序列的正确性。转入毕赤酵母GS115中，摸索诱导剂甲醇的浓度，诱导温度以及诱导时间对HMEI-A表达水平的影响，摸索出表达量较高并且活性强的表达条件。
其次，HMEI-A表达产物分离纯化。由于HMEI-A表达产物为融合蛋白且带有HIS标签和肠激酶酶切位点，因此首先采用镍亲和层析进行初步分离纯化；纯化物透析脱盐后加入2倍体积肠激酶酶切缓冲液，加入适量肠激酶，25℃酶切24h；酶切产物通过阴离子交换柱进行分离纯化，目的蛋白进过透析或高压液相脱盐，得到纯的无盐高纯度HMEI-A蛋白，即HMEI-A。
实施例4 Hela细胞系重组表达制备HMEI-A
首先合成HMEI-A编码基因(即SEQ ID NO.1)，其中在其N端加入肠激酶酶切位点，把合成好的HMEI-A编码基因链接到pCMV3-SP-N-His载体上并测序验证序列的正确性。转入Hela细胞中，加入野生型hela细胞最低全部致死浓度的潮霉素(hygromycin)，通过48h筛选获得HMEI-A表达阳性细胞株。通过用抗his标签抗体进一步验证HMEI-A表达情况。
其次，HMEI-A表达产物分离纯化。由于HMEI-A表达产物带有HIS标签和肠激酶酶切位点，因此首先采用镍亲和层析进行初步分离纯化；纯化物透析脱盐后加入2倍体积肠激酶酶切缓冲液，加入适量肠激酶，25℃酶切24h；酶切产物通过离子层析柱进行分离纯化，目的蛋白进过高压液相色谱进一步进行分离纯化及脱盐，得到纯的无盐HMEI-A蛋白，即HMEI-A。
实施例5 HMEI-A活性检测
1)弹性蛋白酶抑制实验
在96孔板中加入不同浓度的HMEI-A、10μl弹性蛋白酶(终浓度为400nM)，加入适当体积缓冲液使其最终体积为60μl缓冲液，37℃孵育5min；随即加入40μL缓冲液稀释后的发色底物，终浓度为10或20μg/ml，整个酶反应体积为100μl。反应的动力学使用Epoch(Bio-Tek)酶标仪监测OD405nm吸收值，监测时间30min，间隔30s测一次。
最终通过Dixonplot曲线绘制，并得出HMEI-A对弹性蛋白酶的抑制常数(Ki)为(1.69±0.15)×10-8M。
2)诱捕网形成抑制实验
健康人外周静脉血取自昆明血液中心，在取血后两h内完成中性粒细胞的纯化，具体方法按PolymorphprepTM(Axis-Shield,1001971)说明书中操作进行。中性粒细胞分别方法大致如下：将降至室温的Polymorphprep 4ml加入15ml的离心管，紧靠着管壁缓慢加入1ml lymorphprep，紧靠管壁缓慢加入4ml EDTA抗凝血，室温(20～22℃)500g离心30min。丢弃lymorphprep及单核细胞，提取中性粒细胞置新的15ml离心管，加入BPS至10ml混匀室温200g离心5min。丢弃上清，1ml裂红液重悬细胞，再加入裂红液至10ml，冰上裂红5～10min，4℃，200g离心5min。弃上清，加入1ml PBS重悬细胞，再加入PBS至10ml混匀，4℃，200g离心5min，弃上清，1ml 0.5％FBS培养液重悬细胞，放置冰上待用。
将所提取的健康人来源的中性粒细胞用含0.5％胎牛血清的PRMI 1640细胞培养液重悬后接种于铺有多聚赖氨酸处理过的圆形盖玻片的24孔板中，浓度为1×106/ml，体系为400μl；相应孔板中加入终浓度10μg/ml HMEI-A，终浓度50μg/ml粗样，对照组给予等体积PBS，37℃，5％CO2孵箱中孵育30min；相应孔中用100μl 600nmol/L(终浓度100nM)的PMA作为刺激物刺激,对照孔加等体积的培养基；37℃，5％CO2孵箱中刺激3h后，每孔中加入300μL4％多聚甲醛固定细胞爬片10min；细胞爬片固定后，用PBS 500μL浸洗3次，每次5min，注意反转玻片使细胞面朝下；用吸水纸将细胞爬片上残余的水轻轻吸干后，滴加0.5％trition300μL通透1min，依旧细胞面朝下；将trition弃去，10μl DAPI染液避光封膜，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察，拍照。
结果显示，相对于没有PMA处理组，PMA处理组形成大量诱捕网，且添加HMEI-A组和粗样组能明显抑制PMA诱导的诱捕网形成(见图2和图3，其中图2为HMEI-A的体外抗炎活性分析，图2中的a、b、c和d分别为PBS阴性对照组、100ng/ml PMA诱导组、100ng/ml PMA诱导且添加10μg/ml HMEI-A组和100ng/ml PMA诱导且添加50μg/ml分离纯化前粗蛋白组中中性粒细胞诱捕形成情况；图3为图2中a～d组中性粒细胞诱捕形成百分比统计结果)。结果说明HMEI-A为菲牛蛭中主要的诱捕网形成抑制剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种活性蛋白HMEI-A、活性蛋白HMEI-A的编码基因及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaagtgatg cagaatgccc accttgtcct agcggtttta ctaaagacgg taacaagtgt 60
tacagggcat attctaccaa attgaattgg gaggctgctc acgaaacttg cagcaaacag 120
aacgcacatc ttgttgttgt aaaggatgct gctaccaatg accctcttta caaggcagtc 180
gaaccattaa aagcaacctg ctcggaaaac caggacaaaa ccccgggctt ttggactgcc 240
ggaaagagag attgtgatac caacaacttt gtgtgggtga ccagccatgg tacaaaatgg 300
ccaatgtctt acaccaactg gaacgtagga gagccaaaca atgctaaagg aaacgaaaat 360
tgtgtccatg tcattgcttc tgacagcaag gtcggctgga acgatactcc ctgcactttc 420
aattactgct ttgtgtgtga ggttgacctc taa 453
<210> 2
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ser Asp Ala Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ser Gly Phe Thr Lys Asp
1 5 10 15
Gly Asn Lys Cys Tyr Arg Ala Tyr Ser Thr Lys Leu Asn Trp Glu Ala
20 25 30
Ala His Glu Thr Cys Ser Lys Gln Asn Ala His Leu Val Val Val Lys
35 40 45
Asp Ala Ala Thr Asn Asp Pro Leu Tyr Lys Ala Val Glu Pro Leu Lys
50 55 60
Ala Thr Cys Ser Glu Asn Gln Asp Lys Thr Pro Gly Phe Trp Thr Ala
65 70 75 80
Gly Lys Arg Asp Cys Asp Thr Asn Asn Phe Val Trp Val Thr Ser His
85 90 95
Gly Thr Lys Trp Pro Met Ser Tyr Thr Asn Trp Asn Val Gly Glu Pro
100 105 110
Asn Asn Ala Lys Gly Asn Glu Asn Cys Val His Val Ile Ala Ser Asp
115 120 125
Ser Lys Val Gly Trp Asn Asp Thr Pro Cys Thr Phe Asn Tyr Cys Phe
130 135 140
Val Cys Glu Val Asp Leu
145 150

Claims (5)

1.一种活性蛋白HMEI-A，所述活性蛋白HMEI-A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述活性蛋白HMEI-A的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.权利要求1所述的活性蛋白HMEI-A或者权利要求2所述的编码基因在制备中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述的活性蛋白HMEI-A或者权利要求2所述的编码基因在制备抑制中性粒细胞诱捕网形成的药物中的应用。
5.权利要求1所述的活性蛋白HMEI-A或者权利要求2所述的编码基因在制备抗炎药物中的应用。
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"Purification and characterization of a novel anti-coagulant from the leech Hirudinaria manillensis";Ruo-Mei Cheng等;《Zool Res》;20190518;第40卷(第3期);第205-210页 *
"不同品种水蛭抗凝抗血栓作用的比较";关世侠等;《中国医院药学杂志》;20120730;第32卷(第14期);第1093-1096页 *

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