CN101519655B

CN101519655B - 鲍鱼hint基因、蛋白质及其在制备抗癌药物中的应用

Info

Publication number: CN101519655B
Application number: CN2009100974332A
Authority: CN
Inventors: 吴信忠; 吴刘记
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2009-04-02
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2029-04-02
Also published as: CN101519655A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供鲍鱼体内的鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗癌药物中的应用。该鲍鱼HINT基因编码的蛋白质，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。编码前述蛋白质的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还提供了前述蛋白质在制备抗癌药物中的应用。本发明获得了鲍鱼HINT的基因核苷酸全序列，并通过构建原核表达载体，表达了可溶性的HINT蛋白质产品。该蛋白质具有促肝癌细胞凋亡作用，可以作为诱导细胞凋亡的组份而在制备抗癌药物中应用。

Description

鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鲍鱼体内的鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

组氨酸三聚体核苷结合蛋白质(Histidine triad nucleotide binding protein，HINT)是组氨酸三聚体蛋白超家族的成员，是一个具有核苷酸转移酶和水解酶活性的家族，晶体结构研究结果表明，HINT是其它四种组氨酸三聚体蛋白质超家族成员的祖先。自从HINT在牛中被分离出来并被证明具有生物学功能后，许多HINT的同源物也依次从兔、人、甚至植物中被克隆出来。研究表明该蛋白质在低等动物和高等动物中具有很高的结构和功能相似性，而结构和功能的保守性，预示了HINT发挥着重要的生物学功能。研究报道表明，HINT蛋白质参与了重要的生物学功能，包括物质代谢、转录调控、细胞生长、细胞凋亡等。目前，有研究报道哺乳动物HINT在肿瘤细胞凋亡、肿瘤发生、发展中发挥了重要作用，而在无脊椎动物中，HINT的研究只是停留在序列分析上，尚没有报道证实无脊椎动物HINT的存在，功能研究也有待于进一步探讨。

鲍鱼是一种重要的经济贝类，素称“海味之冠”，自古以来就是海产“八珍”之一。其味道鲜美，营养丰富，含有较多的钙、铁、碘和维生素A等营养元素。除了具有较高的营养价值外，鲍鱼还具有较高的医药价值：鲍鱼能养阴、平肝、固肾，可调整肾上腺分泌，具有双向性调节血压的作用。另外，鲍鱼体内还存在一些能抑制癌细胞细胞代谢的物质。但是，由于对其相应的功能因子的研究并不深入，尤其是对一些人类肿瘤治疗有益的基因研究较少，从而限制了其进一步的发展利用。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗癌药物中的应用。

为达到以上目的，本发明是通过这样的技术方案来实现的：提供一种鲍鱼HINT基因编码的蛋白质，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码前述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了前述蛋白质在制备抗癌药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明获得了鲍鱼HINT的基因核苷酸全序列，并通过构建原核表达载体，表达了可溶性的HINT蛋白质产品。该蛋白质具有促肝癌细胞凋亡作用，可以作为诱导细胞凋亡的组份而在制备抗癌药物中应用。

具体实施方式

本发明的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。

本发明的实现步骤包括：

1、以鲍鱼血淋巴细胞总RNA为模板，构建鲍鱼cDNA文库，获得HINT的基因核苷酸全序列。

2、利用DNA重组技术将HINT基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD18-T载体(购自Takara公司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28(a)原核表达载体(购自Novagen公司，美国)连接，获得重组表达质粒pET-28(a)-HINT。

3、将阳性重组质粒PET-28(a)-HINT转化到表达宿主菌BL21(购自Tiangen公司，德国)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(购自Sangon公司，加拿大)诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。

4、将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质，并进一步利用质谱技术鉴定纯化蛋白质。

5、培养肝癌细胞株Bel-7402(人肝癌细胞系Bel7402购自中国科学院上海细胞生物研究所)，并用纯化的蛋白质HINT进行温浴反应、处理。

6、选择不同的时间点收集处理过的细胞，分别用扫描电镜、流式细胞仪及免疫印迹检测肿瘤细胞的凋亡情况。

具体的操作步骤如下：

1、鲍鱼血淋巴细胞cDNA文库的构建及筛选

提取鲍鱼血淋巴细胞总RNA，根据SMART^TMcDNA library construction kit(BD Clotech公司)构建cDNA文库。利用引物PTriplEx2-F，5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’和PTriplEx2-R，5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’对文库阳性质粒进行PCR扩增并测序。

2、鲍鱼HINT核苷酸全长序列的获得

通过对文库筛选，我们得到一个和哺乳动物HINT有较高同源性的基因，我们将其命名为ab-HINT(ab代表鲍鱼)。该基因的核苷酸全长序列为SEQ ID NO：1。

3、PET-28(a)-HINT表达载体的构建

以鲍鱼cDNA为模板扩增目的片段，PCR扩增ab-HINT的反应条件为：95℃ 2分钟；94℃1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35个循环；72℃ 5分钟。PCR产物分别连入PMD-18T载体，转化大肠杆菌TG I(购自Invitrogen公司，美国)，涂布LBA筛选平板，挑若干个克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，将PCR阳性克隆产物用EcoRI，XhoI限制性内切酶(购自Takara公司，日本)双酶切，连入经过同样双酶切的PET-28a载体的相应位点上，转化大肠杆菌TG I。PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体PET-28(a)-HINT。

4、重组蛋白质的表达

将阳性重组质粒PET-28(a)-HINT转化表达宿主菌BL21感受态，涂布LBA平板，37℃培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LBA培养液，37℃振摇培养过夜。取适量菌液，按1∶100扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入IPTG，使其终浓度在0-1.0mmol/L，继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后(300W，20分钟，超声3秒钟，间隔2秒钟)离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳。

5、重组蛋白质的纯化及鉴定

将阳性表达质粒扩大培养，利用Ni-NTA亲和层析柱(购自Novagen公司，美国)对表达产物进行分离纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳并进一步利用质谱技术鉴定纯化的蛋白质产物。包括以下步骤：

(1)用干净的刀片将SDS-PAGE分离后的纯化蛋白质样品切下，制成胶粒，并用含50％的乙腈的NH₄HCO₃脱色完全，微加热使之干燥。

(2)将干燥的胶粒进行酶切前的处理(洗涤，再干燥)，然后加入胰蛋白酶和NH₄HCO₃ 37℃进行酶解反应。

(3)充分酶解后稍微离心收集上清液，进一步处理后采用高效液相色谱一质谱联用的方法(HPLC-MS/MS)鉴定分析。

(4)将质谱所得的肽段的质量数及其MS/MS图谱(碎片离子质量数)同时送入NCBInr数据库，使用质谱数据搜索功能(MS/MS long search)与数据库中相应肽段的理论质量数及其MS/MS裂解图谱进行相关性比较检索鉴定。

蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

6、蛋白质定量

将纯化鉴定过的蛋白质按Brad-ford法进行定量(Bradford MM.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding.Anal Biochem.1976，72：248-254)。

7、肝癌细胞株Bel-7402的培养和处理

人肝癌细胞株BEL-740来源于中国科学院上海细胞生物学研究所。

将Bel-7402细胞培养在含10％小牛血清的DMEM培养液(DMEM培养基和胎牛血清购自美国Life Technology公司)中，加入青霉素100U/mL、链霉素100mg/L，置37℃饱和湿度5％的CO2细胞培养箱内传代培养。将5×10⁵对数生长期细胞接种于培养瓶。24小时换液1次。最后将细胞随机分为：对照组、重组蛋白质HINT处理组(处理时间分别为6、12、18、24小时)。

8、重组蛋白质对肝癌细胞凋亡的作用。

用扫描电镜检测重组蛋白质HINT处理后肝癌细胞的凋亡现象，用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(MultiSciences Biotech公司)检测肝癌细胞凋亡率。同时，用免疫印迹(westernblot)的方法检测了凋亡相关蛋白质P53(P53抗体购自英国Abcam公司)的表达变化。

具体的实施例子：

1、鲍鱼血淋巴细胞cDNA文库的构建和筛选

提取鲍鱼血淋巴细胞总RNA，根据SMART^TMcDNA library construction kit(BD Clotech公司)构建cDNA文库。利用引物PTriplEx2-F，5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’和PTriplEx2-R，5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’对文库阳性质粒进行PCR扩增并测序。筛选出鲍鱼组氨酸核苷结合蛋白质HINT。

2、HINT的原核表达、纯化和鉴定

将阳性重组质粒PET-28(a)-HINT转化到表达宿主菌BL21感受态，涂布LBA平板，37℃培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LBA培养液，37℃振摇培养过夜。取适量菌液，按1∶100扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入IPTG，使其终浓度在0-1.0mmol/L，继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后(300W，20分钟，超声3秒钟，间隔2秒钟)离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳。将阳性表达质粒扩大培养，利用Ni-NTA亲和层析柱对表达产物进行分离纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳并进一步利用高效液相色谱-质谱联用技术鉴定纯化的蛋白质产物。

3、HITN重组蛋白质促肝癌细胞凋亡作用

将Bel-7402细胞培养在含10％小牛血清的DMEM培养基中，加入青霉素100U/mL、链霉素100mg/L，置37℃饱和湿度5％的二氧化碳(CO2)细胞培养箱内传代培养。将5×10⁵对数生长期细胞接种于培养瓶。24小时换液1次。最后将细胞随机分为：对照组、重组蛋白质HINT处理组(处理时间分别为6、12、18、24小时)。用扫描电镜检测重组蛋白质HINT处理后肝癌细胞的凋亡现象，用Annexin V/PI方法检测肝癌细胞凋亡率。同时，用免疫印迹的方法检测了凋亡相关蛋白质P53的表达变化。结果表明：重组的鲍鱼HINT蛋白质能够有效促进肝癌细胞凋亡(处理24小时后，凋亡率达到34％)，在制备肿瘤治疗药物中具有很好的应用前景。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干具体实施例框架。显然，本发明不限于以上实施例，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

actacaagcg tgtgtattga accggggagg gcgcatgcga gtcgaggctg catgtgaatc 60

gtaatgtcgg aaacagataa agcccagacc gcgacaccag gtggtgacac catctttggc 120

aagatcatac gagaggagat tccgaccaag tttctataca aggatgaagt gtgtgttgtg 180

tttaatgaca tcaatgcaca ggcaccagtg cacttccttg ttgtgccagt gaagcccatc 240

gtgcgacttg ccgatgctga agatgcagac aaagagattc ttggacactt gctgctggtg 300

gccaagaaga tggctgcaga gttaggttta tctgaagggt atcgggtggt catcaatgac 360

ggtccagatg gagggcagtc tgtgtaccac ctgcatgtgc acgtgttggg aaaacgccag 420

ttggagtggc cacctggcta aatggctgca ctgacacaga ccagggttgt atctgtagac 480

accaccttat cttcataccg ttgtgttcct tttgtctctg tgagtttgac agttcccaga 540

tgatgtaatt gcattacaga ctccttggct aaataaaatg tgagcaacaa aaaaaaaaaa 600

aaaaaaaaaa aaaaaa 616

SEQ ID NO：2

15 Met Ser Glu Thr Asp Lys Ala Gln Thr Ala Thr Pro Gly Gly Asp

30 Thr Ile Phe Gly Lys Ile Ile Arg Glu Glu Ile Pro Thr Lys Phe

45 Leu Tyr Lys Asp Glu Val Cys Val Val Phe Asn Asp Ile Asn Ala

60 Gln Ala Pro Val His Phe Leu Val Val Pro Val Lys Pro Ile Val

75 Arg Leu Ala Asp Ala Glu Asp Ala Asp Lys Glu Ile Leu Gly His

90 Leu Leu Leu Val Ala Lys Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Leu Ser

105 Glu Gly Tyr Arg Val Val Ile Asn Asp Gly Pro Asp Gly Gly Gln

120 Ser Val Tyr His Leu His Val His Val Leu Gly Lys Arg Gln Leu

125 Glu Trp Pro Pro Gly

Claims

1.一种鲍鱼HINT基因编码的蛋白质，其特征在于，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，该基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的蛋白质在制备抗肝癌药物中的应用。