CN107540739A

CN107540739A - 一种肿瘤靶向性多肽

Info

Publication number: CN107540739A
Application number: CN201710960927.3A
Authority: CN
Inventors: 劳兴珍; 郑珩; 吴扬生
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2037-10-17
Also published as: CN107540739B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤靶向性多肽(p46‑3)，肽46(人细胞肿瘤抗原p53的361～382片段)的羧基端通过连接肽与肿瘤靶向性多肽片段精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸连接。本发明通过大肠杆菌诱导表达，经过金属鳌合亲和层析和凝胶层析制备得到p46‑3。体外实验表明p46‑3具有比肽46更显著的抗肿瘤细胞生长的作用。

Description

一种肿瘤靶向性多肽

技术领域

本发明涉及生物工程制药技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向性多肽。

背景技术

研究表明，p53基因具有阻滞细胞周期、维持基因组稳定、促进细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等作用(李文娟，潘庆杰，李美玉.p53基因及其功能研究进展.生物技术通讯，2014,25(2):282-285.)。肽46，人细胞肿瘤抗原p53的361～382片段，氨基酸序列GSRAHSSHLK SKKGQSTSRHKK(SEQ ID No：3),是一种富含赖氨酸的22肽，相应于p53的单股DNA末端结合位点。在体外它能活化野生型p53的特异性DNA结合作用，并诱导表达p53的肿瘤细胞凋亡(G.Selivanova et al.Nature Med.1997,3,632)。

整合素α_vβ₃在肿瘤细胞的黏附、转移和肿瘤血管新生中发挥了重要作用(Pasqualini R,Arap W,McDonald DM.Probing the structural and moleculardiversit y of tumor vasculature[J].Trends Mol Med,2002,8(12):563-571)。在一些肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞整合素α_vβ₃受体常特异性地高表达,而在正常组织血管中不表达或表达量很少(Zetter BR.On target with tumor blood vessel markers[J].Nat Biot echnol,1997,15(12):1243-1244)，RGD肽与肿瘤血管内皮细胞上的整合素结合,阻止或延缓肿瘤迁移和肿瘤血管生成。整合素α_vβ₃受体由于可与RGD肽结合、介导多种病理生理过程而成为整合素家族中占重要地位。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的小分子多肽，广泛存在于生物体内各种组织的细胞外基质以及血液的多种成分中,人体中最常见的含RGD序列的蛋白，包括纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原等(Temming K,Schiffelers RM,Molema G,et al.Kok RJ.RGD-based strategies forselective delivery of therapeutics and imaging agents to the tumourvasculature[J].Drug Resist Updat,2005,8(6):381-402.)。含RGD序列蛋白与受体整合素结合，参与细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用，激活多条信号传导通路,在多种生理和病理过程中发挥重要作用。含RGD序列的多肽可与肿瘤细胞表面的α_vβ₃特异性结合,在肿瘤细胞的黏附、转移和肿瘤新生血管生成中发挥重要作用。

发明内容

本发明利用的Arg-Gly-Asp序列具有肿瘤靶向的优势，将肽46(p46)和RGD肽在C端进行连接，构建一个具有与αν类整合素的特异结合的特性的新型抗肿瘤药物，具有肿瘤细胞靶向性。

本发明具体技术方案如下：

一种肿瘤靶向性多肽，肽46的羧基端通过连接肽与含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽(RGD肽)连接。现有技术下，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序的线性多肽、环状多肽都在本发明所述的RGD肽的范畴。本发明的一个优选的方案，RGD肽的序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明所述的连接肽为1～50个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽。优选的，所述连接肽氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的一个优选的方案，所述的肿瘤靶向性多肽具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供如上述肿瘤靶向性多肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计合成并克隆得到本发明所述肿瘤靶向性多肽的编码基因；

(2)构建表达载体后转化宿主菌或宿主细胞中进行表达；

(3)分离纯化表达产物。

本发明所述的一个优选方案，利用基因合成的方法获得SEQ ID NO:4所相应的核苷酸序列及其互补序列；将合成的基因与原核表达载体连接，转化大肠杆菌，以乳糖进行诱导表达；将表达产物进行分离，金属鳌合亲和层析，凝胶层析分离纯化产物，收集并冻干，即得本发明所述肿瘤靶向性多肽。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，含有本发明所述的肿瘤靶向性多肽及药学上可接受的载体。

本发明的另一目的在于提供本发明所述肿瘤靶向性多肽在制备治疗癌症的药物中的用途。优选的，所述癌症为腺癌及其转移癌。所述癌症为肝癌，黑色素瘤，乳腺癌。

本发明利用重组DNA技术制备了含有目的基因的原核载体，并在大肠杆菌中表达，并进行分离纯化。药理实验表明本发明所述的肿瘤靶向性多肽与原型肽46相比，具有较高的肿瘤抑制效果。

附图说明

图1是SDS-PAGE分析纯化重组的p46-3(其中1：分子量标记，2：诱导表达的重组p46-3,3、4:被洗脱的杂蛋白，5：纯化的重组p46-3)。

图2是p46-3、p46体外抑制肝癌细胞HepG2的结果。

图3是p46-3、p46体外抑制乳腺癌细胞4T1的结果。

图4是p46-3、p46体外抑制黑色素瘤细胞B16F10的结果。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1

1、基因的克隆及原核表达载体的构建

合成本发明所述的肿瘤靶向性多肽p46-3的基因序列，如SEQ ID No：5所示。

进行kpn I和Hind III酶切，克隆到原核表达载体pET32a，转化至大肠杆菌，PCR法筛选阳性转化子，核苷酸序列测定分析。

2、重组菌的诱导表达

将重组菌接种，过夜摇育，以1％的接种量接种至LB培养基，待OD600达到0.6时，加入5mM乳糖诱导4小时。收集细菌，加入10倍菌体重量的缓冲液(20mmol/L pH7.4的磷酸钠，0.5mol/L NaCl)悬浮细胞，冰浴超声破碎菌体，4℃13000转/分，离心10分钟，取上清，保存于-20度冰箱。

3、重组蛋白的分离纯化

将蛋白粗品上样于镍柱，用10倍柱体积的40mM咪唑洗涤镍柱，用5倍柱体积的100mM咪唑进行洗脱。收集洗脱液，用Sephadex G–25脱盐，流动相为0.1mmol/LNH₄HCO₃(pH8.6)溶液,所得蛋白溶液冻干，得到本发明所述肿瘤靶向性多肽p46-3，氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。SDS-PAGE电泳结果如图1所示。

4、体外抗肿瘤实验

本发明同时克隆表达了p46作为对比，研究本发明所述的肿瘤靶向性多肽p46-3的活性。p46的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示：GSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKK。

分别取对数生长期的肿瘤细胞：肝癌细胞HepG2,乳腺癌细胞4T1和黑色素瘤细胞B16F10,37℃用0.25％胰蛋白酶消化细胞,以每孔5000个细胞接种于96微孔板中,每孔体积100μl,37℃,5％CO2孵箱中培养6-7h。分别取一管肽46或p46-3多肽母液，加入800μl不含血清的RPMI 1640培养基至1ml，使药物浓度为64μM,每孔加入100μl，孔中药物终浓度为32μM,依次稀释至相应浓度：16、8、4、2μM，不加药组为阴性对照组，6μM紫衫醇为阳性对照组(每个药物浓度设5个复孔)100μl。37℃,5％CO2条件下处理48h。取出微孔板，每孔加入20μl，5g/L的MTT，继续培养4h，离心后弃上清，加每孔加入150μl DMSO溶解MTT甲瓒沉淀，用微型震荡器低速振荡约10分钟(500转/分×10min)，结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪测570nm波长处的吸光度(A)值。按以下公式可计算肿瘤细胞生长抑制率：肿瘤细胞的生长抑制率(％)＝[(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]×100％。

结果如图2所示，用多肽处理肿瘤细胞48h后，在2μM至32μM的浓度区间，p46-3抑制肝癌细胞HepG2增殖的效果均优于p46。如在多肽浓度为32μM时，p46-3对肝癌细胞HepG2的抑制率为58.4％，p46的抑制率为41.1％；在多肽浓度为16μM时，p46-3对肝癌细胞HepG2的抑制率为50.4％，p46的抑制率为33.9％。

结果如图3所示，用多肽处理肿瘤细胞48h后，在8μM至32μM的浓度区间，p46-3抑制乳腺癌细胞4T1增殖的效果均优于p46。如在多肽浓度为32μM时，p46-3对乳腺癌细胞4T1的抑制率为56.2％，p46的抑制率为42.5％；在多肽浓度为16μM时，p46-3对乳腺癌细胞4T1的抑制率为52.7％，p46的抑制率为37.2％。

结果如图4所示，用多肽处理肿瘤细胞48h后，在2μM至32μM的浓度区间，p46-3抑制黑色素瘤细胞B16F10增殖的效果均优于p46。如在多肽浓度为32μM时，p46-3对黑色素瘤细胞B16F10的抑制率为47.3％，p46对B16F10肿瘤细胞的抑制率为32.3％；在多肽浓度为16μM时，p46-3对黑色素瘤细胞B16F10的抑制率为44.6％，p46的抑制率为29.1％。

实验结果说明本发明设计的p46-3确实能在体外抑制肿瘤细胞的生长，并且比原型p46具有更好的抗肿瘤效果。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种肿瘤靶向性多肽

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Gly Asp

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser

1 5 10 15

Thr Ser Arg His Lys Lys

20

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser

1 5 10 15

Thr Ser Arg His Lys Lys Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp

20 25

<210> 5

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaccgacg acgacgacaa aggctcgcgc gcgcattcgt cgcatctgaa atcgaaaaaa 60

ggccagtcgc attcgcgcca taaaaaaggc ggtggcggcc gtggcgatta aaagctt 117

Claims

1.一种肿瘤靶向性多肽，其特征在于肽46通过连接肽与含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽连接。

2.如权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽，其特征在于所述含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽为线性多肽或环状多肽。

3.如权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽，其特征在于所述连接肽为1～50个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽。

4.如权利要求3所述的肿瘤靶向性多肽，其特征在于所述连接肽氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

5.如权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽，其特征在于具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5任一项所述的肿瘤靶向性多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计合成并克隆得到根据权利要求1-5任一项所述肿瘤靶向性多肽的编码基因；

(2)构建表达载体后转化宿主菌中进行表达；

(3)分离纯化表达产物。

7.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1-5任一项所述的肿瘤靶向性多肽及药学上可接受的载体。

8.如权利要求1-5任一项所述肿瘤靶向性多肽在制备治疗癌症的药物中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于所述癌症为腺癌及其转移癌。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于所述癌症为肝癌，黑色素瘤，乳腺癌。