CN112646018B

CN112646018B - 一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的生物活性肽及其应用

Info

Publication number: CN112646018B
Application number: CN202110099166.3A
Authority: CN
Inventors: 朱立成; 罗辉; 殷帅文
Original assignee: Jinggangshan University
Current assignee: Jinggangshan University
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-01-25
Also published as: CN112646018A

Abstract

本发明公开了一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的生物活性肽及其应用，属于医学生物技术领域。所述生物活性肽具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，含有“精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸（RGD）”模体，具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的双功能。应用于临床，可有效治疗肿瘤或减慢肿瘤进程，具有重要的临床应用价值。

Description

一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的生物活性肽及其应用

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，具体地，涉及一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的生物活性肽及其应用。

背景技术

目前临床上肿瘤治疗存在两大突出问题，一是临床上使用的放、化疗和抗癌药物具有明显的细胞毒性，也就是在杀死癌细胞的同时也对正常细胞产生严重的毒副作用，不良反应大；且化学合成的抗肿瘤药物容易产生耐药性。二是无法有效控制肿瘤转移。肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征，大多数癌症患者并非死于原发性癌而是死于转移性癌，是引起癌症患者死亡的首要因素。因此研究开发高效、低毒、靶向性的以及有抗恶性肿瘤转移功能的抗肿瘤药物，是抗肿瘤药物研发的重点。

蛋白质和多肽药物作为一类新型、发展潜力巨大的抗癌候选药物，它们可以针对肿瘤细胞生长、发展的不同环节，特异性地杀伤和抑制肿瘤细胞。近年来，国内外学者通过从动植物中提取、噬菌体肽库筛选以及化学合成等方法，得到一些具有抗肿瘤活性的小分子多肽。抗肿瘤小分子多肽分子量小、活性高，对多药抗性的肿瘤细胞系也有良好的抑制活性。同时，小分子多肽可以以多种方式给药，不易引起免疫反应，结构易于改造，且人工合成的生产成本较低，这些都预示着小分子生物活性肽在临床方面将有良好的应用前景。现已成功开发了几种药物，如Didemin B与Kahalalide已进入或结束Ⅱ临床期试验，它们主要用于人体实体瘤、淋巴瘤等多种恶性肿瘤的治疗，临床上取得了良好的疗效。

植物防御素是从植物组织中分离纯化的阳离子肽，具有多种功能。据报道，已有多种植物防御素能抑制癌细胞的生长。如来自田豆（Ground beans）的类植物防御素Sesquin对白血病细胞株L1210和M1细胞株的繁殖抑制率分别为35%和80%，对乳腺癌细胞株MCF-7抑制率为80%；来自 C. chinense御素对人Hela癌细胞株抑制率为80%；来自利马豆中的防御素Limyin对人肝癌细胞株Bel-7402和人胶质细胞瘤SHSY5Y的IC50浓度分别是43μM和28μM。植物防御素抑制癌细胞生长的机制虽然尚不清楚，但来自豌豆中的防御素PsD1能和细胞周期蛋白（Cyclin）发生相互作用，而在许多种癌细胞中都过量表达Cyclin，这可能是植物防御素能抑制癌细胞生长的原因之一。另外，肿瘤细胞表面异常表达带负电荷的唾液酸和磷脂酰丝氨酸，可能吸附带正电荷的植物防御素，从而使其发挥抑制肿瘤细胞增殖的毒性作用。

然而，目前有效应用于临床的植物防御素仍然不多，无法满足临床需求。

发明内容

为了解决以上技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种生物活性肽，具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述生物活性肽由SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列组成。该生物活性肽含有“RGD”模体，具有明显抑制肿瘤扩散、转移的功能。其作用机制主要体现在三个方面：（1）RGD肽具有显著抑制细胞黏附的作用。肿瘤转移是一个相当复杂的过程，涉及肿瘤细胞、血管内皮细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的相互作用和血小板瘤栓的形成。恶性肿瘤侵袭转移分为三步：第一步细胞与细胞外基质ECM发生粘附和附着，第二步是肿瘤细胞本身或诱导宿主细胞分泌蛋白水解酶降解基质，最后一步即趋化或趋触介导的细胞运动。现已明确，细胞与ECM的作用是由于细胞表面的整合素等分子能特异地识别ECM分子的某些氨基酸序列，并与之结合。RGD肽可以与ECM竞争结合肿瘤细胞表面的整合素分子，抑制整合素与ECM主要成分纤维粘连蛋白结合，干扰肿瘤细胞—ECM的相互作用，起到抑制癌细胞粘附的作用。（2）RGD还可以阻断血管内皮细胞表面αvβ3整合素与ECM的联系，促进血管内皮细胞凋亡，从而抑制血管生成和肿瘤转移灶形成。（3）含RGD的合成多肽能抑制骨髓瘤（Sao-2）细胞对血小板的聚集，降低癌细胞凝集性以抗肿瘤转移，并可通过抑制肿瘤细胞在微血管中的运行速度，减少瘤细胞被捕获形成转移灶的机会。

本发明的第二方面提供一种本发明第一方面所述生物活性肽的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1，研磨紫藤种子，65℃处理30min；

S2，阳离子交换层析纯化，G-50凝胶过滤层析，取各峰HPLC纯化；

S3，针对每一个分离纯化得到的峰，测定其抗真菌活性，具有活性的峰进行进一步分离纯化，即得到所述生物活性肽。

本发明第三方面提供一种编码本发明第一方面所述生物活性肽的基因，具有SEQID NO. 1所示核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述基因由SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列组成。

本发明的第四方面提供一种表达载体，包括本发明第三方面所述的基因。

进一步地，所述表达载体为原核表达载体。

本发明的第五方面提供一种宿主细胞，包括本发明第四方面所述的表达载体。

进一步地，所述宿主细胞为原核细胞。

本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的生物活性肽在制备用于抑制肿瘤增殖和/或转移的、或者抑制微生物生长、或者协助植物抗逆的制剂中的应用。

在本发明中，所述肿瘤为乳腺癌肿瘤。

本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的生物活性肽的衍生物，所述衍生物是以所述生物活性肽为模板，利用化学修饰、基因工程和蛋白质工程等遗传工程技术对所述的生物活性肽进行修饰和改造得到的。

相对于现有技术，本发明具有以下有效效果：

本发明提供一种全新的具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的双功能天然生物活性肽，为肿瘤治疗手段提供了更多选择。

本发明的生物活性肽对肿瘤细胞增殖具有强烈的抑制作用，对乳腺癌MCF-7株细胞增殖的抑制率约为78%，对其抑制率IC₅₀浓度约为40μM。并且能够显著降低乳腺癌MCF-7株细胞在基质表面的粘附，在Matrigel和Fn基质上的粘附率仅为6%和25.2%，粘附抑制率分别达到82%和70%。进一步，生物活性肽抑制乳腺癌MCF-7细胞在Matrigel及Fn上迁移抑制率为38%和40%。

SEQUENCE LISTING

<110> 井冈山大学

<120> 一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的生活性肽及其应用

<130> JIA-2020-1-W-044

<140> 2021100991663

<141> 2021-04-13

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 138

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene

<400> 1

tgtgagaagc ctagaggagt attcagtggt ccatgcattg ggacaactgg caaccaacaa 60

tgtgcctatg tttgcaggag aggagaccat ttacttaatg gttcctgcaa aggtctgaag 120

tgtatttgtg cctgttga 138

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> protein

<400> 2

Cys Glu Lys Pro Arg Gly Val Phe Ser Gly Pro Cys Ile Gly Thr Thr

1 5 10 15

Gly Asn Gln Gln Cys Ala Tyr Val Cys Arg Arg Gly Asp His Leu Leu

20 25 30

Asn Gly Ser Cys Lys Gly Leu Lys Cys Ile Cys Ala Cys

35 40 45

附图说明

图1示出了从紫藤种子分离生物活性肽的峰图。

图2示出了生物活性肽处理后，乳腺癌MCF-7株细胞增殖的抑制率。

图3示出了生物活性肽处理后，乳腺癌MCF-7株细胞在Matrigel和Fn基质上的粘附率。

图4示出了生物活性肽处理后，对乳腺癌MCF-7株细胞在Matrigel和Fn基质上的粘附抑制率。

实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例 1 生物活性肽的分离纯化鉴定

取一定量的紫藤种子浸泡过夜后研磨，纱布过滤后除去滤渣，滤液65℃水浴30分钟后12000 rpm离心30 min，弃去沉淀取上清，上清经过阳离子交换层析，收集各峰（如图1所示）后测活，取活性峰冻干后备用。

活性峰冻干粉用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解后经凝胶过滤层析法纯化，收集的活性峰再用高效液相色谱法分离纯化，收集各峰后测活。

利用上述方法获得了一种具有抑制肿瘤细胞增殖活性的峰，冻干后获得纯的生物活性肽，用质谱法鉴定该生物活性肽的分子量为4748.56 Da，通过多肽N末端测序、3' RACE和5' RACE等技术获得了其cDNA序列，其核苷酸序列如下（5'→3'，SEQ ID NO. 1）：

TGTGAGAAGCCTAGAGGAGTATTCAGTGGTCCATGCATTGGGACAACTGGCAACCAACAATGTGCCTATGTTTGCAGGAGAGGAGACCATTTACTTAATGGTTCCTGCAAAGGTCTGAAGTGTATTTGTGCCTGTTGA

进一步推导出了其氨基酸序列如下（N-C，SEQ ID NO. 2）：

CEKPRGVFSGPCIGTTGNQQCAYVCRRGDHLLNGSCKGLKCICAC

共含有45个氨基酸，通过NCBI的Blast P程序比对，只在数据库中找到2条有相似性的多肽序列，而且同源性低于40%。该肽基本骨架和植物防御素类似，其一级结构含有8个保守的Cys，并形成4对链内二硫键，它的N末端和C末端都是Cys(C)，它们之间可形成一对二硫键，这样该生物活性肽的结构形成了非常紧凑、稳定的环状肽结构。此外，该肽还含有Csαβ模体中形成α螺旋的特征序列C-X-X-X-C和β折叠片的特征序列C-X-C（其中X表示任意氨基酸），它的二级结构形成了一个在动物毒素等生物活性肽中常见的Csαβ模体结构。

实施例 2 生物活性肽对乳腺癌MCF-7株细胞增殖的抑制率和IC₅₀

发明人测定了生物活性肽对乳腺癌MCF-7株细胞增殖的抑制率和IC₅₀。对肿瘤细胞增殖抑制率的检测主要采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法。100μL乳腺癌MCF-7株细胞（约1×10⁵个细胞）依次加入到96孔板中，生物活性肽用培养基溶解稀释后不同浓度加入到各孔中，其中浓度最大的为80μmol/L，每孔加100μL，37℃、5%的CO₂培养24小时后加入20μL MTT，混匀继续培养3-4小时，倒去各孔中液体，加入DMSO 200μL，振荡10 min，在570 nm波长下测定各孔OD值。同时以未加生物活性肽的孔为对照，计算抑制率。

测得生物活性肽对乳腺癌MCF-7株细胞增殖的抑制率约为78%，对其抑制率IC₅₀浓度约为40μM（实验结果如图2所示）。

细胞粘附采用MTT法测定，测定波长570 nm。分别计算细胞在人工基底膜Matrigel和Fn上的粘附率和粘附抑制率。

粘附率(%)=[(Matrigel或Fn组细胞OD值/BSA组细胞OD值)-1]×100%

粘附抑制率(%)=[1-(用药组细胞粘附率/未用药组细胞粘附率)]×100%

用不同浓度的生物活性肽处理乳腺癌MCF-7株细胞与对照组乳腺癌MCF-7株细胞比较，两者在包被Matrigel或Fn基质表面上的粘附存在明显差异。Matrigel和Fn基质具有促进肿瘤细胞粘附的作用，WS1处理后则显著降低乳腺癌MCF-7株细胞在基质表面的粘附。其中当生物活性肽的浓度为150μg/mL时，在Matrigel和Fn基质上的粘附率仅为6%和25.2%（如图3所示），粘附抑制率分别达到82%和70%（如图4所示）。

常规培养直至形成细胞单层，用移液器滴头沿培养板底部呈“—”字形划痕单层培养细胞，镜下记录划痕区相对距离。继续培养24h后观察。倒置显微镜下测量细胞向致伤区迁移的相对距离，根据原始细胞致伤区距离计算出细胞实际迁移距离。以未处理细胞为对照，按公式计算实验组细胞迁移抑制率。

迁移抑制率(%)=[1-(实验组迁移距离/对照组迁移距离)]×100%

测得生物活性肽抑制乳腺癌MCF-7细胞在Matrigel及Fn上迁移抑制率为38%和40%。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种生物活性肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.编码权利要求1所述生物活性肽的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述表达载体能够在原核细胞或真核细胞中表达所述生物活性肽。

7.权利要求1所述的生物活性肽在制备用于抑制肿瘤增殖和/或转移的制剂中的应用，所述肿瘤为乳腺癌肿瘤。