CN100586961C

CN100586961C - 对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100586961C
Application number: CN 200710103722
Authority: CN
Inventors: 吕茂民; 章金刚; 姚站馨
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: CN101062955A

Abstract

本发明公开了一种对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白及其编码基因与构建该融合基因的方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。该融合蛋白具有下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1；2)序列表中的SEQ ID NO：2；3)序列表中的SEQ ID NO：3；4)将序列表中SEQ ID NO：1-3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对肿瘤具有抑制作用的的蛋白质。本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域，尤其是肿瘤治疗性药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

Description

对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白及其编码基因与构建该融合基因的方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。

背景技术

肿瘤的生成是细胞增殖和凋亡失衡的结果。据世界卫生组织的最新统计，肿瘤的发病率和死亡率继心血管疾病、感染性疾病之后位居第三。肿瘤的临床治疗目前包括：手术治疗、放疗、化疗。但治疗效果并不乐观，手术虽然能够切除肿瘤组织，但常常不能彻底清除肿瘤细胞，同时施以放、化疗可以清除残存的部分肿瘤细胞。但在放、化疗杀伤肿瘤细胞的同时，正常组织和细胞也同样受到损伤，导致出现并发症，产生较强的毒副作用。此外，大多数肿瘤细胞p53缺失或突变，Bcl-2过表达，均导致肿瘤细胞产生耐药性，从而进一步影响治疗效果。因此，寻找、建立肿瘤的特异性治疗方法现已成为肿瘤治疗的研究方向之一。

凋亡素(Apoptin)是一种来源于传染性鸡贫血病病毒的VP3结构蛋白，由121个氨基酸组成，分子量约为13.6千道尔顿。该蛋白能诱导雏鸡造血母细胞和T淋巴细胞前体细胞凋亡，导致雏鸡严重的贫血及免疫机能低下。进一步研究表明，Apoptin还能诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，但对正常的人二倍体细胞无凋亡诱导作用。因此，凋亡素被认为是第一个真正意义上可选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。Apoptin的发现对于研究肿瘤细胞特异的凋亡机制，建立肿瘤细胞特异性治疗方法具有重要意义。

1979年，在日本首先发现了传染性鸡贫血病病毒。该病毒为二十面体，无囊膜的单链DNA病毒，直径20nm，属于圆环病毒科。其基因组由环状单股负链DNA组成，编码3个结构蛋白，即VP1、VP2、VP3。其中，VP3能够诱导感染雏鸡骨髓中造血母细胞及胸腺中T细胞的前体细胞凋亡，导致雏鸡出现严重的贫血、出血及免疫抑制。因此，VP3被重新命名为apoptin，意为凋亡诱导者(apoptosis inducer)。

Apoptin是一个由121个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为13.6kDa，它包含两段富含脯氨酸的序列和两个带正电的区域。Apoptin含有两个核定位序列(NLS)，和一个核输出序列(NES)。apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚不清楚。已有实验结果表明，Apoptin诱导凋亡的细胞类型选择性的原因可能与Apoptin在细胞中的定位有关：在正常细胞中，Apoptin定位于细胞质；在肿瘤及转化细胞中，Apoptin定位于细胞核。有人对Apoptin在不同种类细胞中定位不同的机制做如下推测：在肿瘤或转化细胞中，Apoptin凭借其两个NLS进入细胞核，进入核内后，其部分序列与染色质结构结合，这部分序列中包含NES位点，使得Apoptin聚集在核内不再从核输出；在正常细胞中Apoptin与细胞骨架部分或其他细胞结构因子结合，使Apoptin滞留在细胞质中，无法进入细胞核。所以，正常细胞和肿瘤/转化细胞中所含的结构因子或细胞骨架体系的不同导致Apoptin的定位不同。

Apoptin不依赖于p53发挥作用，并且其作用不被Bcl-2过量表达所抑制，这使它优于一些通过诱导凋亡来发挥作用的化疗和放疗手段。因为一些化疗药物是通过激活p53途径来诱导凋亡的，但大约50％肿瘤细胞中p53基因发生突变，使这些药物无法发挥作用；Apoptin诱导凋亡是独立于p53的，所以p53发生突变的细胞中仍可诱导凋亡。在一些肿瘤细胞中，Bcl-2、BCR-ABL等原癌基因过量表达，抑制细胞凋亡的发生，使很多药物及放疗手段失效，但Apoptin不受影响，照常发挥其诱导细胞凋亡的作用。

血管生成为实体肿瘤生长与转移的必要条件，丰富的新生血管为不断增殖的恶性细胞提供所需要的营养原料。抑制肿瘤的血管生成，“切断”肿瘤的营养供应从而达到限制肿瘤细胞的生长和繁殖，最终消除肿瘤，为治疗肿瘤提供了一个全新思路。

内皮抑素(Endostatin)是近年来发现的具有上述特异抗肿瘤作用的最有效血管生成抑制因子之一。该蛋白是胶原X VIII羧基端的一部分，由183个氨基酸残基组成，分子量约为20千道尔顿。人内皮抑素能特异性抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制新生血管的生成。Endostatin作用的突出特点是：疗效显著，特异性强；无明显毒副作用，对人正常成熟状态下静止的内皮细胞或其它细胞无影响；反复用药，不产生耐药性。

1997年，美国哈佛大学医学院O’Reilly和Folkman等(O’Reilly M S，BoehmT，Folkman J et al.Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis andtumor growth.Cell，1997，88(2)：277～285)首先从鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)培养液中分离纯化到Endostatin。Endostatin为胶原蛋白X VIII的C末端片段，编码184个氨基酸，分子量为20kDa。Endostatin是目前发现的所有血管抑制素中最有效的、最有应用价值的细胞因子。目前，采用基因工程方法表达生产Endostatin已经成为国内外研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白，命名为Append，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：2；

3)序列表中的SEQ ID NO：3；

4)将序列表中SEQ ID NO：1-3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对肿瘤具有抑制作用的蛋白质。

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

序列表中的SEQ ID NO：1由318个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-120位为凋亡素的氨基酸残基序列，自氨基端第136-318位为人内皮抑素的氨基酸残基序列，自氨基端第121-135位为连接肽(Gly4Ser)₃序列；序列表中的SEQ ID NO：2由313个氨基酸残基组成，自氨基端第1-120位为凋亡素的氨基酸残基序列，自氨基端第131-313位为人内皮抑素的氨基酸残基序列，自氨基端第121-130位为连接肽(Gly4Ser)₂序列；序列表中的SEQ ID NO：3由308个氨基酸残基组成，自氨基端第1-120位为凋亡素的氨基酸残基序列，自氨基端第126-308位为人内皮抑素的氨基酸残基序列，自氨基端第121-125位为连接肽(Gly4Ser)序列。

编码上述对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白的基因(Append)也属于本发明的保护范围，它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

4)编码序列表中SEQ ID NO：1-3的DNA序列；

5)与序列表中SEQ ID NO：4-6限定的DNA序列具有90％以上同源性且对肿瘤具有抑制作用的核苷酸序列；

6)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：4-6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：4由954个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-954位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-360位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第406-954位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第361-405位碱基为连接肽(Gly4Ser)₃的编码序列；序列表中的SEQ ID NO：5由939个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-939位碱基，编码具有序列表中SEQID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-360位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第391-939位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第361-390位碱基为连接肽(Gly4Ser)₂的编码序列；序列表中的SEQ ID NO：6由924个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-924位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-360位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第376-924位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第361-375位碱基为连接肽(Gly4Ser)的编码序列。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种构建融合基因Append的方法。

本发明所提供的融合基因Append的构建方法，可包括以下步骤：

1)以含有人内皮抑素基因的质粒为模板，在由序列表中SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8组成的引物对的引导下，PCR扩增人内皮抑素基因；

2)以含有凋亡素基因的质粒为模板，在由序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的引物对的引导下，PCR扩增凋亡素基因；

3)以步骤1)扩增的人内皮抑素基因和步骤2)扩增的凋亡素基因为模板，在由序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10组成的引物对的引导下，进行重叠PCR扩增，得到融合基因Append。

在上述融合基因Append的构建方法中，步骤1)中的SEQ ID NO：7由50个碱基组成，SEQ ID NO：8由31个碱基组成，其中，SEQ ID NO：8中自5’端第4-9位碱基为限制性内切酶Nhe I识别位点；含有人内皮抑素基因的质粒可为pT-hES(吕茂民等.生物技术通报，2003，164：37～39)。

步骤2)中的SEQ ID NO：9由34个碱基组成，SEQ ID NO：10由50个碱基组成，其中，SEQ ID NO：9中自5’端第4-9位碱基为限制性内切酶BamH I识别位点；含有凋亡素基因的质粒可为pUC-Ap。

本发明还提供了一种表达上述对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白方法，是将含有上述对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白。

所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。

所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)。

所述大肠杆菌可为E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10等。

用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体为任意一种可在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K等。

以pPIC9为出发载体构建的重组酵母表达载体为Append/pPIC9。

当所述宿主为巴氏毕赤酵母时，需用甲醇进行诱导表达，甲醇的终浓度可为0.3-0.7％(体积/体积百分比浓度，V/V)，优选为0.5％。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

培养含有本发明的对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种肿瘤的治疗性药物。

本发明所提供的肿瘤的治疗性药物，它的活性成分为上述对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊或口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为1-50μg对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白/kg体重，每隔7-14天给药一次，疗程一般为3至12个月。

本发明提供了一种对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白Append及其编码基因与应用。该融合蛋白是以柔性肽Gly4Ser、(Gly4Ser)₂或(Gly4Ser)₃作为连接肽(linker)，将凋亡素(Apoptin)与人内皮抑素(Endostatin)融合在一起得到的融合蛋白。柔性肽易于弯曲，因而可使表达蛋白正确折叠，且不影响融合蛋白各自的活性结合区域。实验表明，该融合蛋白兼具凋亡素与人内皮抑素的生物功能，既能特异地抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制新生血管地生成，又能特异性诱导肿瘤细胞凋亡；此外，该融合蛋白还具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，制备成本低的优点。基于上述优点，本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域，尤其是肿瘤治疗性药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为PCR扩增的Endostatin的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为PCR扩增的Apoptin的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为重叠PCR扩增的Append的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4为转化有Append的不同单克隆的PCR检测结果

图5为经PCR检测获得的转化有Append的阳性克隆的双酶切鉴定结果

图6为经分离纯化Append融合蛋白的SDS-PAGE检测结果

图7为融合蛋白Append活性的MTT法检测结果

图8为检测融合蛋白Append活性的鸡胚绒毛尿囊膜实验结果

图9为融合蛋白Append体外诱导肿瘤细胞凋亡的实验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有引物合成和测序工作均由上海生工完成。

实施例1、对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白基因Append的构建

一、人内皮抑素基因(Endostatin)片段的获得

1、引物设计

根据人内皮抑素基因的mRNA序列(GenBank号：AJ494837)设计PCR扩增该基因的引物，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’-GGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCACAGCCACCGCGACTTCCA-3’(序列表中SEQ ID NO：7)；

P2(下游引物)：5’-CGCGCTAGCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nhe I识别位点)(序列表中SEQ ID NO：8)。

2、Endostatin片段的PCR扩增及纯化

以质粒pT-hES(吕茂民等.生物技术通报，2003，164：37～39)为模板，在引物P1和P2的引导下，进行PCR扩增。PCR反应体系为：质粒pT-hES 1μl，10×PCR反应缓冲液5μl；引物P1、P2各25pmol，2.5mmol/L dNTPs 4μl，Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司)2.5U，用去离子水补充总反应体系至50μl。PCR反应条件为：先94℃预变性4min；然后94℃30sec，58℃45sec，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图1所示(泳道a为DL2000分子量标准，泳道b为PCR扩增的Endostatin)，扩增出了约550bp的条带，与预期的Endostatin的大小一致。将PCR扩增产生的目的DNA片段应用Promega公司的DNA片段纯化试剂盒并参照试剂盒说明书进行纯化，具体过程包括以下步骤：

a.切取含目的DNA片段的凝胶块，大小约300ng，将凝胶块放入1.5mL Ep管中，70℃温育至凝胶完全融化；

b.加入1mL纯化树脂，充分混匀20sec(不能用旋涡器混匀)；

d.将3mL一次性注射器活塞拔出，微柱与注射器相连；

e.将制备好的树脂凝胶/DNA混合物移入注射器桶，插入活塞，轻轻推样品入微柱；

f.移入2mL 80％异丙醇于注射器中，用异丙醇洗微柱一次；

g.将微柱置于1.5mL Ep管中，10000g室温离心2min，以干燥树脂；

h.移微柱到一新的无菌Ep管中，加50ul去离子水或TE缓冲液于微柱中，室温放置1min后，10000g离心20sec，以洗脱DNA片段。洗脱后的DNA于4℃(或-20℃)贮存。

对纯化的DNA片段进行测序，测序结果表明PCR扩增的Endostatin片段具有序列表中SEQ ID NO：11的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：11由591个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-579位碱基。

二、凋亡素基因(Apoptin)片段的获得

1、引物设计

根据凋亡素基因的mRNA序列(GenBank号：NC001427)设计PCR扩增该基因的引物，引物序列如下：

P3(上游引物)：5’-CCGGGATCCATGAACGCTCTCCAAGAAGATACTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)(序列表中SEQ ID NO：9)；

P4(下游引物)：5’-CCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCAGTCTTATACGCCTTCTT-3’(序列表中SEQ ID NO：10)。

2、Apoptin片段的PCR扩增及纯化

以人胎肝总RNA经反转录合成的cDNA为模板，在引物P3和P4的引导下，进行PCR扩增。除模板和引物外，PCR反应体系和反应条件与步骤一相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图2所示(泳道A为DL2000分子量标准，泳道B为PCR扩增的Apoptin)，扩增出了约400bp的条带，与预期的Apoptin的大小一致。用与步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。

对纯化的DNA片段进行测序，测序结果表明PCR扩增的Apoptin片段具有序列表中SEQ ID NO：12的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：12由403个碱基组成，其编码序列为自5’端第13-403位碱基。

三、凋亡素基因与人内皮抑素基因融合基因(Append)的PCR扩增及纯化

取步骤一和步骤二回收的目的DNA片段各1ul，混匀，将其作为重叠PCR反应的模板，然后在引物P1和P4的引导下，进行重叠PCR扩增。PCR反应体系和反应条件与步骤一相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图3所示(泳道a为DL2000分子量标准，泳道b为PCR扩增的Append)，扩增出了约1000bp的条带，与预期的Apoptin的大小一致。用与步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。

四、融合基因Append的克隆及鉴定

将扩增的Append与载体pGEM-T进行连接，10μl连接体系及连接条件为：按3∶1的摩尔比加入目的基因片段与载体DNA，10×连接酶缓冲液1μl，T₄DNA连接酶2U，4-6℃水浴连接12-24小时。然后将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，将转化细胞涂布于含60mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板上，随机挑选长出的白色单菌落，37℃活化12-24小时，提取质粒DNA，并以此为模板，用引物P1、P2进行PCR检测，PCR检测结果如图4所示(泳道a为DL2000分子量标准，泳道b-i为不同单克隆的PCR检测结果)，转化有Append的阳性克隆可扩增出约1000bp的条带。再对PCR鉴定的阳性克隆质粒用限制性内切酶Nhe I和BamH I进行双酶切鉴定，结果如图5所示(泳道a为PCR鉴定的阳性克隆质粒的双酶切产物，泳道b为DL2000分子量标准)，经酶切，阳性克隆质粒可获得大于2000bp和约1000bp的DNA片段，挑选阳性克隆，测序，测序结果表明所扩增的Append具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：4由954个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-954位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-360位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第406-954位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第361-405位碱基为连接肽(Gly4Ser)₃的编码序列，表明所克隆的Append序列正确。

实施例2、对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白基因Append的构建

一、Endostatin片段的PCR扩增及纯化

取实施例1中步骤一回收的Endostatin片段为模板，在引物P1-2：

5’-GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGCACAGCCACCGCGACTTCCA-3’(序列表中SEQ IDNO：13)和P2引导下，进行PCR扩增，除引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。

二、Apoptin片段的PCR扩增及纯化

取实施例1中步骤一回收的Apoptin片段为模板，在引物3和引物4-2：5’-CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCAGTCTTATACGCCTTCTT-3’(序列表中SEQ IDNO：14)引导下，进行PCR扩增，除引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。

取步骤一和步骤二回收的目的DNA片段各1ul，混匀，将其作为重叠PCR反应的模板，然后在引物3和引物2的引导下，用重叠PCR法扩增Append。PCR反应条件及体系与实施例1步骤三相同。

四、融合基因Append的克隆及鉴定

用与实施例1相同的方法将PCR扩增产物与载体pGEM-T进行连接，然后将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明所扩增的具有连接肽(Gly4Ser)₂的融合蛋白基因Append具有序列表中SEQ ID NO：5的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：5由939个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-939位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第391-939位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第1-360位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第361-390位碱基为连接肽(Gly4Ser)₂的编码序列，表明所克隆的Append序列正确。

实施例3、对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白基因Append的构建

一、Endostatin片段的PCR扩增及纯化

取实施例1中步骤一回收的Endostatin片段为模板，在引物P1-3：5’-GGTGGCGGTGGCTCGCACAGCCACCGCGACTTCCA-3’(序列表中SEQ ID NO：15)和P2引导下，进行PCR扩增，除引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。

二、Apoptin片段的PCR扩增及纯化

取实施例1中步骤一回收的Apoptin片段为模板，在引物3和引物4-3：5’CGAGCCACCGCCACCCAGTCTTATACGCCTTCTT-3’(序列表中SEQ ID NO：16)引导下，进行PCR扩增，除引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。

四、融合基因Append的克隆及鉴定

用与实施例1相同的方法将PCR扩增产物与载体pGEM-T进行连接，然后将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明所扩增的具有连接肽(Gly4Ser)的融合蛋白基因Append具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO：6由924个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-924位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第376-924位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第1-360位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第361-375位碱基为连接肽(Gly4Ser)的编码序列，表明所克隆的Append序列正确。

实施例4、Append在巴斯德毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化

1、高表达转化子的筛选

将实施例1构建的具有连接肽(Gly4Ser)₃的融合蛋白基因Append导入毕赤酵母表达载体pPIC9中，得到重组重组酵母表达载体，命名为Append/pPIC9，用酵母原生质体转化法将其转化巴斯德毕赤酵母GS115his4(Mut+his-)NRRLY-15851(购自华美生物公司)，筛选转化子。随机挑取24个转化子，接种于4mL BMGY液体培养基中，每隔12小时加入终浓度为0.5％的甲醇进行诱导表达，在30℃、100rpm下摇培36-48小时。培养结束后5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，将不同样品分别进行15％SDS-PAGE电泳进行检测，将筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面培养，用于Append表达的工程菌，命名为Append/pPIC9(GS115)。

2、Append在巴斯德毕赤酵母中的表达

挑取步骤1筛选的表达量高的工程菌的单菌落(以转化有pPIC9空载体的酵母菌GS115为阴性对照，该菌命名为pPIC9(GS115))分别接种于4mL BMGY液体培养基中，在30℃、100rpm摇培12-24小时。取1mL酵母工程菌培养液转接于50mL BMGY培养基中，在相同条件下继续摇培18-24小时，再按4％接菌量将40mL种子接入1000mL BMGY液体培养基中，在30℃、100rpm下继续摇培24-30小时，将培养液5000rpm离心5min，弃上清，然后将收集的工程菌Append/pPIC9(GS115)用200mL BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，在30℃、100rpm下摇培3-4天，每隔24小时补加甲醇(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。培养初期每隔12小时取一次样，48小时后，每隔6小时取一次样。经测定，培养结束后巴斯德毕赤酵母工程菌菌液OD₆₀₀的光密度值已达到18-20，每升菌体干重为100-300克，表明Append表达的外源蛋白大多数已分泌到液体培养基中。将发酵培养基在4℃、10000rpm下离心20min，弃菌体，获得含大量融合蛋白基因Append表达产物的上清液，对不同时期取的样品进行10％SDS-PAGE电泳鉴定，结果诱导表达72小时，Append的表达量较高，表明Append在巴斯德毕赤酵母中获得了表达。对诱导表达的产物用10％SDS-PAGE进行进一步的鉴定，以转化有空载体的转化子为阴性对照，并用外标法测定蛋白表达量，结果样品中融合蛋白的表达量约为6.6mg/L。

3、Append融合蛋白的分离纯化

将步骤2中的培养上清用截留分子量为50KD的超滤管浓缩，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡Sephadex G-75分子筛(购自华美生物公司)，获得最终产物，凝胶过滤所用缓冲液为PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄)和0.1％Tween80，将纯化的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示(泳道a为蛋白分子量Marker，泳道b为纯化的目的蛋白)，结果获得了纯度较高的分子量为33.6KD的蛋白条带，经纯化后Append融合蛋白的纯度达90％以上，对其进行测序，测序结果表明获得了高纯度的具有连接肽(Gly4Ser)₃的凋亡素与人内皮抑素的融合蛋白Append，具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列。

此外，用上述相同的表达方法将实施例2、3构建的凋亡素基因和人内皮抑素基因的融合基因在毕赤酵母GS115中表达，得到了分别具有(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)连接肽序列的凋亡素和人内皮抑素的融合蛋白。

实施例5、细胞和动物实验

1、体外细胞实验(MTT法)

取对数生长期ECV-304细胞(人脐静脉内皮细胞)5×10⁴个/mL，将其接种于96孔板(100μl/孔)，24h分别(100μl/孔)加入稀释度分别为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍的实施例4表达的分别具有(Gly4Ser)₃、(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)连接肽序列的凋亡素和人内皮抑素的融合蛋白样品，以不加蛋白样品的为对照组(加PBS)，在37℃下作用60h后再加入5mg/mL MTT(10μl/孔)，继续孵育4h，吸取上清，加入DMSO(100μl/孔)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定OD₄₉₀值，然后计算抑制率，计算公式：抑制率＝1-(实验组OD₄₉₀/对照组OD₄₉₀)。

结果如图7所示(A为加蛋白孔，B为对照孔)，与对照相比，分别具有(Gly4Ser)₃、(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)连接肽序列的Append蛋白样品均可抑制ECV-304细胞的增殖，且具有剂量依赖效应。对获得的数据(即OD₄₉₀值)进行统计学分析，结果P＜0.05，具有统计学意义，说明本发明的融合蛋白Append在体外可抑制ECV304细胞的增殖。

2、鸡胚绒毛尿囊膜(CMV)实验

将1-10μg纯化的具有(Gly4Ser)₃、(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)不同连接肽序列的三种Append融合蛋白加样于灭菌滤纸小片上，以未加Append融合蛋白的为对照组，置于孵育7d鸡胚的CAM上，37℃继续孵育48h，剥开蛋壳观察结果。

结果如图8所示(图A为未加Append融合蛋白的对照组，图B为未加Append融合蛋白的实验组)，未加Append融合蛋白的对照组CAM血管呈脉状分布，清晰可见，而分别添加具有(Gly4Ser)₃、(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)连接肽的3种Append蛋白(10μg)的实验组的鸡胚CAM血管生长均得到显著抑止，在载样滤纸片覆盖的部位血管网分布较少，而其它部位的血管网分布均匀、粗大，形成了一个强烈抑制CAM血管生成的作用圈，表明本发明的Append蛋白具有抑制血管生成作用。

3、体外诱导肿瘤细胞凋亡实验

取对数生长期的人神经胶质瘤细胞5×10⁴个/mL，将其接种于96孔板(100μl/孔)，24h后分别(100μl/孔)加入稀释度分别为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍的实施例4表达的Append蛋白样品，以不加Append蛋白样品的为对照组(加PBS)，在37℃下作用60h后再加入5mg/mL MTT(10μl/孔)，继续孵育4h，吸取上清，加入DMSO(100μl/孔)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定OD₄₉₀值，然后计算抑制率，计算公式：抑制率＝1-(实验组OD₄₉₀/对照组OD₄₉₀)。

结果如图9所示(A为加Append蛋白组，B为对照组)，与对照相比，分别具有(Gly4Ser)₃、(Gly4Ser)₂和(Gly4Ser)连接肽序列的Append蛋白样品均可抑制人神经胶质瘤细胞的增殖，且具有剂量依赖效应。对获得的数据(即OD₄₉₀值)进行统计学分析，P＜0.05，具有统计学意义，说明Append蛋白在体外可抑制人神经胶质瘤细胞的增殖。上述实验结果表明本发明的融合蛋白具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备抗肿瘤药物。

综合上述实验结果，可初步认为本发明的Append融合蛋白具有“抑制血管新生”和“诱导肿瘤细胞凋亡”的多靶点效应。

序列表

<160>16

<210>1

<211>318

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg

1 5 10 15

Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile

20 25 30

Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys

35 40 45

Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro

65 70 75 80

Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val

85 90 95

Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg

100 105 110

Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val

130 135 140

Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly

145 150 155 160

Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly

165 170 175

Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu

180 185 190

Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn

195 200 205

Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly

225 230 235 240

Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His

245 250 255

Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr

260 265 270

Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu

275 280 285

Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr

290 295 300

Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys

305 310 315

<210>2

<211>313

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg

1 5 10 15

Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile

20 25 30

Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys

35 40 45

Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro

65 70 75 80

Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val

85 90 95

Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg

100 105 110

Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala

130 135 140

Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp

145 150 155 160

Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe

165 170 175

Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg

180 185 190

Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu

195 200 205

Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu

210 215 220

Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg

225 230 235 240

His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn

245 250 255

Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala

260 265 270

Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu

275 280 285

Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile

290 295 300

Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys

305 310

<210>3

<211>308

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg

1 5 10 15

Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile

20 25 30

Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys

35 40 45

Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro

65 70 75 80

Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val

85 90 95

Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg

100 105 110

Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser His Ser His

115 120 125

Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu

130 135 140

Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln

L45 150 155 160

Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser

165 170 175

Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala

180 185 190

Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp

195 200 205

Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg

210 215 220

Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro

225 230 235 240

Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr

245 250 255

Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly

260 265 270

Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala

275 280 285

Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met

290 295 300

Thr Ala Ser Lys

305

<210>4

<211>954

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aacgccctcc aagaagatac tccacccgga ccatcaacgg tgttcaggcc accaacaagt 60

tcacggccgt tggaaacccc tcactgcaga gagatccgga ttggtatcgc tggaattaca 120

atcactctat cgctgtgtgg ctgcgcgaat gctcgcgctc ccacgctaag atctgcaact 180

gcggacaatt cagaaagcac tggtttcaag aatgtgccgg acttgaggac cgatcaaccc 240

aagcctccct cgaagaagcg atcctgcgac ccctccgagt acagggtaag cgagctaaaa 300

gaaagcttga ttaccactac tcccagccga ccccgaaccg caagaaggcg tataagactg 360

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctcacag ccaccgcgac 420

ttccagccgg tgctccacct ggttgcgctc aacagccccc tgtcgggcgg catgcggggc 480

atccgcgggg ccgacttcca gtgcttccag caggcgcggg ccgtggggct ggcgggcacc 540

ttccgcgcct tcctgtcctc gcgcctgcag gacctgtaca gcatcgtgcg ccgtgccgac 600

cgcgcagccg tgcccatcgt caacctcaag gacgagctgc tgtttcccag ctgggaggct 660

ctgttctcag gctctgaggg tccgctgaag cccggggcac gcatcttctc ctttgacggc 720

aaggacgtcc tgaggcaccc cacctggccc cagaagagcg tgtggcatgg ctcggacccc 780

aacgggcgca ggctgaccga gagctactgt gagacgtggc ggacggaggc tccctcggcc 840

acgggccagg cctcctcgct gctggggggc aggctcctgg ggcagagtgc cgcgagctgc 900

catcacgcct acatcgtgct ctgcattgag aacagcttca tgactgcctc caag 954

<210>5

<211>939

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

aacgccctcc aagaagatac tccacccgga ccatcaacgg tgttcaggcc accaacaagt 60

tcacggccgt tggaaacccc tcactgcaga gagatccgga ttggtatcgc tggaattaca 120

atcactctat cgctgtgtgg ctgcgcgaat gctcgcgctc ccacgctaag atctgcaact 180

gcggacaatt cagaaagcac tggtttcaag aatgtgccgg acttgaggac cgatcaaccc 240

aagcctccct cgaagaagcg atcctgcgac ccctccgagt acagggtaag cgagctaaaa 300

gaaagcttga ttaccactac tcccagccga ccccgaaccg caagaaggcg tataagactg 360

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc 420

cacctggttg cgctcaacag ccccctgtcg ggcggcatgc ggggcatccg cggggccgac 480

ttccagtgct tccagcaggc gcgggccgtg gggctggcgg gcaccttccg cgccttcctg 540

tcctcgcgcc tgcaggacct gtacagcatc gtgcgccgtg ccgaccgcgc agccgtgccc 600

atcgtcaacc tcaaggacga gctgctgttt cccagctggg aggctctgtt ctcaggctct 660

gagggtccgc tgaagcccgg ggcacgcatc ttctcctttg acggcaagga cgtcctgagg 720

caccccacct ggccccagaa gagcgtgtgg catggctcgg accccaacgg gcgcaggctg 780

accgagagct actgtgagac gtggcggacg gaggctccct cggccacggg ccaggcctcc 840

tcgctgctgg ggggcaggct cctggggcag agtgccgcga gctgccatca cgcctacatc 900

gtgctctgca ttgagaacag cttcatgact gcctccaag 939

<210>6

<211>924

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

aacgccctcc aagaagatac tccacccgga ccatcaacgg tgttcaggcc accaacaagt 60

tcacggccgt tggaaacccc tcactgcaga gagatccgga ttggtatcgc tggaattaca 120

atcactctat cgctgtgtgg ctgcgcgaat gctcgcgctc ccacgctaag atctgcaact 180

gcggacaatt cagaaagcac tggtttcaag aatgtgccgg acttgaggac cgatcaaccc 240

aagcctccct cgaagaagcg atcctgcgac ccctccgagt acagggtaag cgagctaaaa 300

gaaagcttga ttaccactac tcccagccga ccccgaaccg caagaaggcg tataagactg 360

ggtggcggtg gctcgcacag ccaccgcgac ttccagccgg tgctccacct ggttgcgctc 420

aacagccccc tgtcgggcgg catgcggggc atccgcgggg ccgacttcca gtgcttccag 480

caggcgcggg ccgtggggct ggcgggcacc ttccgcgcct tcctgtcctc gcgcctgcag 540

gacctgtaca gcatcgtgcg ccgtgccgac cgcgcagccg tgcccatcgt caacctcaag 600

gacgagctgc tgtttcccag ctgggaggct ctgttctcag gctctgaggg tccgctgaag 660

cccggggcac gcatcttctc ctttgacggc aaggacgtcc tgaggcaccc cacctggccc 720

cagaagagcg tgtggcatgg ctcggacccc aacgggcgca ggctgaccga gagctactgt 780

gagacgtggc ggacggaggc tccctcggcc acgggccagg cctcctcgct gctggggggc 840

aggctcctgg ggcagagtgc cgcgagctgc catcacgcct acatcgtgct ctgcattgag 900

aacagcttca tgactgcctc caag 924

<210>7

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct cacagccacc gcgacttcca 50

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

cgcgctagcc tacttggagg cagtcatgaa g 31

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

ccgggatcca tgaacgctct ccaagaagat actc 34

<210>10

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

ccgacccacc accgcccgag ccaccgccac ccagtcttat acgccttctt 50

<210>11

<211>591

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc 60

cacctggttg cgctcaacag ccccctgtcg ggcggcatgc ggggcatccg cggggccgac 120

ttccagtgct tccagcaggc gcgggccgtg gggctggcgg gcaccttccg cgccttcctg 180

tcctcgcgcc tgcaggacct gtacagcatc gtgcgccgtg ccgaccgcgc agccgtgccc 240

atcgtcaacc tcaaggacga gctgctgttt cccagctggg aggctctgtt ctcaggctct 300

gagggtccgc tgaagcccgg ggcacgcatc ttctcctttg acggcaagga cgtcctgagg 360

caccccacct ggccccagaa gagcgtgtgg catggctcgg accccaacgg gcgcaggctg 420

accgagagct actgtgagac gtggcggacg gaggctccct cggccacggg ccaggcctcc 480

tcgctgctgg ggggcaggct cctggggcag agtgccgcga gctgccatca cgcctacatc 540

gtgctctgca ttgagaacag cttcatgact gcctccaagt aggctagcgc g 591

<210>12

<211>403

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

ccgggatcca tgaacgccct ccaagaagat actccacccg gaccatcaac ggtgttcagg 60

ccaccaacaa gttcacggcc gttggaaacc cctcactgca gagagatccg gattggtatc 120

gctggaatta caatcactct atcgctgtgt ggctgcgcga atgctcgcgc tcccacgcta 180

agatctgcaa ctgcggacaa ttcagaaagc actggtttca agaatgtgcc ggacttgagg 240

accgatcaac ccaagcctcc ctcgaagaag cgatcctgcg acccctccga gtacagggta 300

agcgagctaa aagaaagctt gattaccact actcccagcc gaccccgaac cgcaagaagg 360

cgtataagac tgggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgg 403

<210>13

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg cacagccacc gcgacttcca 50

<210>14

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

cgacccacca ccgcccgagc caccgccacc cagtcttata cgccttctt 49

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

ggtggcggtg gctcgcacag ccaccgcgac ttcca 35

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

cgagccaccg ccacccagtc ttatacgcct tctt 34

Claims

1、对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一表示的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)序列表中的SEQ ID №：2；和

3)序列表中的SEQ ID №：3。

2、编码权利要求1所述的对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白的基因，是编码序列表中SEQ ID №：1-3的DNA序列。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中SEQ ID №：4、SEQ ID №：5或SEQ ID №：6的DNA序列。

4、含有权利要求3所述基因的表达载体。

5、含有权利要求3所述基因的转基因细胞系。

6、含有权利要求3所述基因的宿主菌。

7、一种表达权利要求1所述的对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白的方法，是将含有权利要求2所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到对肿瘤细胞具有抑制作用的融合蛋白。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述酵母菌为巴氏毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168；所述大肠杆菌为E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10。

10、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体为pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。

11、权利要求1所述的融合蛋白在制备抑制血管生成和/或神经胶质瘤治疗性药物中的应用。