CN107056923A - 一种抑癌肽的抗肿瘤应用 - Google Patents

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Abstract

本发明是基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤治疗途径发明一段重组多肽，证明其具有抗肿瘤的应用价值，并提供一段抑癌肽的特异的蛋白序列和核酸序列。利用生物合成技术，合成一段35个氨基酸(amino acid)多肽。接着对多肽的抗肿瘤功能进行了研究，细胞学和裸鼠体内实验表明此多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型生长的重要抗癌功能。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。

Description

一种抑癌肽的抗肿瘤应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一段抑癌基因编码抗肿瘤肽，其特征为重组人PIAS3 87-121位氨基酸，以合成肽的形式发挥其抗肿瘤作用。本发明研究了多种肿瘤，并筛选到了对这种肽敏感的多种肿瘤。
背景技术
癌症是全球发病和死亡的主要原因，在未来20年中，估计每年癌症病例将由2012年的1400万上升到2200万。因此，加强治疗肿瘤的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。目前，全球多肽药物的市场已经超过200亿美元，占医药品市场总分额的2％左右，但持10％左右的高速增长率。按照2014年总销售额排名，40亿美元以上的有一个，20亿美元以上的有三个，十亿美元以上的有七个，由此可见以生物手段研究多肽药物具有可观的市场前景。
我们发现肿瘤组织中的表达蛋白缺少某段多肽序列后丧失了抑癌功能，故推测此多肽具有抑癌效应。所以，在此发明中我们利用合成肽技术，合成35个氨基酸(amino acid)的多肽，将此多肽加药到肿瘤细胞中并通过腹腔注射注射到裸鼠体内，证明其独特的抑制多种肿瘤生长的抗肿瘤效应并筛选到了对这种肽敏感的多种肿瘤，包括人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HEPG-2细胞、人前列腺癌DU145细胞、人黑色素瘤A375细胞、人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人宫颈癌Hela细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人结肠癌HT-29细胞、人非转移性MCF-7细胞、人直肠癌SW480细胞。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
发明内容
本发明是基于肿瘤发生特点和治疗难点，利用生物合成技术，发明一段抑癌基因编码抗肿瘤肽，其特征为重组人PIAS3 87-121位氨基酸，以合成肽的形式发挥其抗肿瘤作用。重组蛋白序列长为35aa多肽，发明保护重组抑癌多肽序列为：
接着对多肽的抗肿瘤功能进行了研究，细胞学和裸鼠体内实验表明此多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型生长的重要抗癌功能。
本发明以肽的形式来研究抗肿瘤的氨基酸序列对肿瘤的作用，对人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HEPG-2细胞、人前列腺癌DU145细胞、人黑色素瘤A375细胞、人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人宫颈癌Hela细胞、人非小细胞肺癌A549细胞具有较显著的生长抑制效应，对人脑胶质瘤U251细胞、人结肠癌HT-29细胞、人非转移性MCF-7细胞、人直肠癌SW480细胞也有一定抑制作用，对人肾上皮293细胞、人乳腺上皮MCF-10A细胞无细胞毒性。
第一步：细胞学水平进行多肽抗肿瘤功能的检测
将重组肽加药到肿瘤细胞后，48小时后检测细胞活性，MTT结果显示此多肽具有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用。
第二步：动物学水平进行多肽抗肿瘤功能的检测
构建裸鼠皮下肿瘤模型，10天后待肿瘤体积均成0.2cm3，且每只鼠均有4处成瘤时即可给药，每天腹腔给药一次，每周测量两次测量肿瘤大小及裸鼠体重，绘制生长曲线，31天后，处死裸鼠，剥离肿瘤，称量重量，实验结果显示此多肽显著抑制肿瘤细胞生长。
附图说明：
图1A.MTT实验检测35aa多肽对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制率
图1B.MTT实验检测35aa多肽对人肝癌HEPG-2细胞增殖的抑制率
图1C.MTT实验检测35aa多肽对人前列腺癌DU145细胞增殖的抑制率
图1D.MTT实验检测35aa多肽对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制率
图1E.MTT实验检测35aa多肽对人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制率
图1F.MTT实验检测35aa多肽对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制率
图1G.MTT实验检测35aa多肽对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制率
图2A.MTT实验检测35aa多肽对人脑胶质瘤U251细胞增殖的抑制率
图2B.MTT实验检测35aa多肽对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制率
图2C.MTT实验检测35aa多肽对人非转移性MCF-7细胞增殖的抑制率
图2D.MTT实验检测35aa多肽对人直肠癌SW480细胞增殖的抑制率
图3A.MTT实验检测35aa多肽对人肾上皮293细胞增殖无明显毒性
图3B.MTT实验检测35aa多肽对人乳腺上皮MCF-10A细胞增殖无明显毒性
图4A.SGC-7901细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图
图4B.DU145细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图
图4C.MDA-MB-231细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图
图5A.HEPG-2细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长曲线图
图5B.A375细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长曲线图
图5C.A549细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长曲线图
图6A.HEPG-2细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图
图6B.A375细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图
图6C.A549细胞裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图
图7A.HEPG-2细胞裸鼠成瘤模型肿瘤重量图
图7B.A375细胞裸鼠成瘤模型肿瘤重量图
图7C.A549细胞裸鼠成瘤模型肿瘤重量图
图8A.HEPG-2细胞裸鼠成瘤模型裸鼠体重图
图8B.A375细胞裸鼠成瘤模型裸鼠体重图
图8C.A549细胞裸鼠成瘤模型裸鼠体重图
具体实施方式：
实施例一：MTT实验证明重组肽细胞水平的抗肿瘤效应
本发明以合成肽的形式发挥其抗肿瘤作用，MTT实验证明此多肽对人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HEPG-2细胞、人前列腺癌DU145细胞、人黑色素瘤A375细胞、人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人宫颈癌Hela细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人脑胶质瘤U251细胞、人结肠癌HT-29细胞、人非转移性MCF-7细胞、人直肠癌SW480细胞具有生长抑制效应。
以一种癌细胞为例，将癌细胞分别以20000个/孔的密度接种于96孔培养板，16小时后将35aa多肽和其它对照组加药到SGC-7901细胞，48小时后每孔加入10ul 5mg/ml的MTT(MTT用PBS配制，过滤除菌，分装在4℃保存)，4小时后，弃培养基，加入150ul/孔DMSO，震荡10min,在490nm测量吸收值。吸收值大小反映了细胞活性，使用公式(抑制率＝1-加药组OD值/对照组OD值×100％)求出各组抑制率，根据实验数据，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标做图。MTT结果显示，35aa多肽实验组显著抑制了胃癌SGC-7901细胞的增殖，如【图1A】所示。我们也发现了其对包括肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、转移性乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌肿瘤细胞具有较显著的生长抑制效应，如【图1B-G】所示。对非转移性乳腺癌、结肠-直肠癌、脑胶质瘤肿瘤细胞也有一定抑制作用，如【图2A-D】。而对人胚肾细胞HEK293，如【图3A】，人乳腺上皮细胞MCF-10A，如【图3B】，重组肽无细胞毒性。
实施例二：裸鼠成瘤模型证明重组肽体内水平的抗肿瘤效应
本发明以合成肽的形式发挥其抗肿瘤作用，裸鼠成瘤模型证明此多肽对人胃癌SGC-7901 细胞、人前列腺癌DU145细胞、人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人肝癌HEPG-2细胞、人黑色素瘤A375细胞、人非小细胞肺癌A549细胞有生长抑制效应。
以一种癌荷瘤裸鼠模型为例，将癌细胞在37℃、95％湿度和5％CO2孵箱中培养，增殖若干板后，胰酶消化细胞，无血清DMEM培养基重悬细胞，搜集1×107细胞，注射于6月龄裸鼠皮下，每只鼠注射4点，分别位于背侧肩胛骨处及腹侧腹股沟处，每点注射约1×107个细胞，10天后待肿瘤体积均成0.2cm3，且每只鼠均有4处成瘤时即可给药，经分组将裸鼠分为两组：生理盐水对照组和PIAS3DETA肽(10mg/kg)组，每组两只裸鼠。将2×104ug/ml的药物配置成1mg/ml浓度后，腹腔注射200ul/只鼠(裸鼠体重约为20g)，持续腹腔给药30天后处死裸鼠，剥出肿瘤并拍照称重。实验结果显示，在胃癌SGC-7901细胞荷瘤裸鼠中，与生理盐水对照组相比，PIAS3DETA肽(10mg/kg)组肿瘤明显较小，如肿瘤生长大小图【图4A】,所示，表明此35aa多肽具有显著地抑制肿瘤模型生长的功效，同时，我们发现此35aa多肽在前列腺癌和乳腺癌中有相同的效应，肿瘤生长曲线图【图4B-C】。
此外，以另一种荷瘤裸鼠模型为例，将癌细胞在37℃、95％湿度和5％CO2孵箱中培养，增殖若干板后，胰酶消化细胞，无血清DMEM培养基重悬细胞，搜集1×107细胞，注射于6月龄裸鼠皮下，每只鼠注射4点，分别位于背侧肩胛骨处及腹侧腹股沟处，每点注射约1×107个细胞，10天后待肿瘤体积均成0.2cm3，且每只鼠均有4处成瘤时即可给药，经分组将裸鼠分为六组：对照肽组、低浓度组(3mg/kg)、中浓度组(10mg/kg)、高浓度组(30mg/kg)、顺铂组(1mg/kg)、顺铂+中浓度组，每组四只裸鼠。将50％纯度的药物粉末配置成相应浓度后，腹腔注射200ul/只鼠(裸鼠体重约为20g)，每周测量两次裸鼠肿瘤体积及裸鼠体重，持续腹腔给药31天后处死裸鼠，剥出肿瘤并拍照称重。实验结果显示，在肝癌HEPG-2细胞荷瘤裸鼠中，与对照肽组相比，中浓度组(10mg/kg)、高浓度组(30mg/kg)肿瘤模型虽不如顺铂，但远远好于对照肽，如表1-1、表3及肿瘤生长曲线图【图5A】、肿瘤生长大小图【图6A】、肿瘤重量图【图7A】所示，再次表明此35aa多肽具有显著地抑制肿瘤模型生长的功效，且最适剂量是10mg/kg，同时，我们发现此35aa多肽在黑色素瘤和肺癌中有相同的效应，如表1-2、表1-3、表3及肿瘤生长曲线图【图5B-C】、肿瘤生长大小图【图6B-C】、肿瘤重量图【图7B-C】。
我们又通过测量裸鼠体重，证明顺铂组及顺铂+中浓度组裸鼠体重明显下降，而肽类药物组并无此副作用，进一步证明了此多肽在裸鼠体内无毒性，具有安全性，如表2-1、表2-2、表2-3及【图8A-C】。
表1-1连续给药31天HEPG-2细胞裸鼠成瘤模型肿瘤体积(单位cm3)
表1-2连续给药31天A375细胞裸鼠成瘤模型肿瘤体积(单位cm3)
表1-3连续给药31天A549细胞裸鼠成瘤模型肿瘤体积(单位cm3)
表2-1连续给药31天HEPG-2细胞裸鼠成瘤模型裸鼠体重(单位：g)
表2-2连续给药31天A375细胞裸鼠成瘤模型裸鼠体重(单位：g)
表2-3连续给药31天A549细胞裸鼠成瘤模型裸鼠体重(单位：g)
表3连续给药31天裸鼠成瘤模型肿瘤重量(单位：mg)

Claims (2)

1.一段抑癌基因编码抗肿瘤肽，其特征为重组人PIAS3 87-121位氨基酸，以合成肽的形式发挥其抗肿瘤作用。重组蛋白序列长为35aa多肽，发明保护重组抑癌多肽序列为：
2.保护根据权利1所述抑癌基因编码蛋白序列对对人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HEPG-2细胞、人前列腺癌DU145细胞、人黑色素瘤A375细胞、人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人宫颈癌Hela细胞、人非小细胞肺癌A549细胞具有较显著的生长抑制效应，对人脑胶质瘤U251细胞、人结肠癌HT-29细胞、人非转移性MCF-7细胞增、人直肠癌SW480细胞也有一定抑制作用，对人肾上皮293细胞、人乳腺上皮MCF-10A细胞无细胞毒性。
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