KR102099154B1

KR102099154B1 - 가지까막살 유래 렉틴 및 이를 부호화하는 렉틴 유전자

Info

Publication number: KR102099154B1
Application number: KR1020180140569A
Authority: KR
Inventors: 한종원; 황현주; 전한철; 한진욱
Original assignee: 국립해양생물자원관
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2020-04-10
Also published as: US20200157156A1

Abstract

본 발명은 홍조류인 가지까막살(Glateloupia chianggi)의 조추출물(crude extract)을 준비하는 단계; 및 상기 조추출물로부터 D-만노오스 친화성 크로마토그래피를 이용한 전기영동에 의하여 가지까막살 유래 렉틴(GLC)을 정제하는 단계를 포함하는, 항바이러스성 가지까막살 유래 렉틴의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 정제된 렉틴의 아미노산 서열 및 이를 부호화하는 상보적 염기서열을 규명함으로써, 향후 다양한 의학 또는 제약 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

Description

가지까막살 유래 렉틴 및 이를 부호화하는 렉틴 유전자{GRATELOUPIA CHIANGGI LECTIN AND LECTIN DNA CODING THE SAME}

본 기술은 천연물로부터 유래된 특정 단백질 및 이의 활용에 관한 기술로서, 구체적으로는 홍조류의 일종인 가지까막살(Grateloupia chianggi) 유래의 렉틴 단백질 및 이의 활용에 관한 기술이다.

렉틴은 탄수화물 결합 단백질로 정의되며 약 100년 전에 발견되었다. 렉틴은 특정 탄수화물 사슬을 인식하여 적혈구를 응집시킬 수 있는 특성을 가지고 있다. 따라서 응집소(agglutinin) 또는 혈구 응집소(hemagglutinin)라고도 한다. 렉틴은 박테리아에서 식물과 동물에 이르기까지 널리 분포되어 있으며, 생명활동의 인식 분자 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 렉틴의 탄수화물 결합 성질로 인하여, 렉틴은 생물학적 연구 및 약리학에서 다양한 응용 가능성이 있는 것으로 생각되고 있다.

홍조류 렉틴 (red algal lectin)은 독특한 일차 구조를 가지며, 다른 렉틴과 같이 여러 가지 용도로 제안되었다. 홍조류에 있는 렉틴은 주로 성적 생식에 관여하는 것으로 알려져 있다. 지금까지, 홍조류로부터 약 500개의 렉틴이 스크리닝 되었으나, 현재까지 약 10개의 렉틴만이 홍조류로 부터 정제되었으며 아미노산 서열이 결정되었다. 이것은 홍조류 렉틴은 혈구 응집 시험에 기초하여 스크리닝 되었지만 약리학적 응용연구를 위한 홍조류 렉틴의 수는 극히 미미하다는 것을 의미한다. 이러한 이유에서, 홍조류 렉틴의 중요성에도 불구하고 홍조류로부터 정제된 렉틴의 응용연구는 더디게 진행되고 있다.

한편, 가지까막살 (Glateloupia chianggi)은 우리나라 남해안 및 제주도지역에 주로 분포하는 홍조류로서 당결합 단백질에 대한 연구는 거의 진행되지 않았다.

본 발명은 전술한 바와 같은 현실을 고려하여 홍조류 유래의 새로운 렉틴을 정제하고 이의 유용성을 발굴하고자 하는 기술적 의도에서 착안된 발명으로서, 홍조류인 가지까막살(Glateloupia chianggi)로부터 항바이러스성 렉틴을 분리 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 항바이러스 특성을 갖고, 위와 같이 정제된 가지까막살 유래 렉틴을 제공하는 것을 목적으로 한다.

나아가, 본 발명은 상기 가지까막살 유래 렉틴을 부호화하는 렉틴 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항바이러스성 가지까막살 유래 렉틴의 제조방법은 홍조류인 가지까막살(Glateloupia chianggi)의 조추출물(crude extract)을 준비하는 단계; 및 상기 조추출물로부터 D-만노오스 친화성 크로마토그래피에 의하여 가지까막살 유래 렉틴(Grateloupia Chiangii Lectin; GCL)을 정제하는 단계를 포함한다.

상기 가지까막살 유래 렉틴은 HSV1 및 HSV2에 대한 항바이러스 특성을 갖는다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항바이러스성 가지까막살 유래 렉틴은 가지까막살로부터 분리 및 정제된 단백질로서, 서열목록 1의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 렉틴 유전자는 전술한 항바이러스성 가지까막살 유래 렉틴을 부호화하고, 서열목록 2로 표시되는 염기 서열을 포함한다.

본 발명은 잘 알려지지 않은 홍조류의 일종인 가지까막살로부터 렉틴을 분리 정제하고, 상기 렉틴의 유용성을 규명함으로써 향후 상기 렉틴의 다양한 활용 가능성을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 렉틴의 아미노산 서열을 확인하고 이를 부호화하는 DNA 염기서열을 제공함으로써, 항후 상기 렉틴의 재조합을 통한 대량생산의 기초를 제공한다.

도 1은 D-만노오스 친화성 크로마토그래피를 이용한 가지까막살 조추출물의 전기영동 결과이다.
도 2는 GCL에 말 적혈구 및 양 적혈구에 대한 혈구 응집결과를 도시한 도면이다.
도 3은 GCL의 탄수화물 및 단백질에 대한 혈구 응집분석 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 온도에 따른 GCL의 활성도를 도시한 그래프이다.
도 5는 2가 양이온 첨가에 따른 CGL 활성도 변화를 분석한 그래프이다.
도 6 및 도 7은 GCL에 대한 글리칸 마이크로 어레이 분석결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 GCL의 아미노산 서열 및 상보적 DNA 서열을 도시한 도면이다.
도 9는 GCL에 대한 LC-MS/MS 데이터를 도시한 그래프이다.
도 10은 GCL의 6개의 반복 도메인 서열을 도시한 도면이다.
도 11은 GCL의 반복 도메인을 포함하는 텐덤 구조를 도시한 개념도이다.

이하에서는 본 발명의 가지까막살 유래 렉틴의 제조방법 및 이에 의하여 분리 정제된 렉틴에 대하여 자세하게 설명하도록 한다. 그러나 하기 설명들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시적인 설명들이며, 본 발명의 기술사상은 하기 설명들에 의하여 제한되지 않는다. 본 발명의 기술사상은 오직 후술하는 청구범위에 의하여 해석되거나 제한될 수 있다.

몇몇 홍조류 렉틴의 독특한 구조와 유용성에 대한 보고가 이루어지고 있고 소수의 해양 홍조류에만 국한되어 연구되어 왔으나, 본 발명은 홍조류의 일종인 가지까막살(Grateloupia chiangii)의 새로운 렉틴을 정제하고 이에 대한 기술적 특징들을 포함한다. 분리된 렉틴은 이하, GCL(Grateloupia chiangii lectin)으로 명명된다.

본 발명의 GCL을 정제하기 위해서는, 우선 채집된 가지까막살 샘플을 멸균된 해수로 세척한 후, 충분히 수분이 제거되어야 한다. 준비된 샘플은 후속 과정을 위하여 적어도 -80℃ 이하의 온도에서 보관되는 것이 바람직하다.

준비된 샘플은 액체 질소 등에 침지시켜 분쇄시킴으로써 분말화된 상태로 완충용액에 첨가하여 추출됨으로써 조추출물(crude extract) 상태로 후속 정제과정에 적용된다. 크로마토그래피는 D-만노오스 친화성 수지에 조추출물을 로딩함으로써 이루어진다. 후술하겠으나, 상기 크로마토그래피에 의하여 단일하게 명확히 분획된 GCL을 수득할 수 있다.

한편, 수득된 GCL은 후술할 분석 방법 및 장치에 의하여 아미노산 서열 및 상보적 DNA 염기 서열이 규명될 수 있다. 상기 아미노산 서열은 서열목록 1으로 제시되어 있으며, 상기 DNA 염기서열은 서열목록 2로 제시되어 있다.

상기 정제된 렉틴(GCL)은 우수한 항바이러스 특성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이러한 특성에 기반한 의학 및 제약적 유용성은 매우 클 것으로 판단된다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시예로서 가지까막살 유래 렉틴의 분리 정제 방법 및 정제된 렉틴의 자세한 분석 결과를 설명하도록 한다. 한편, 하기 구체적인 설명들로부터 본 발명의 기술사상이 한정되거나 제한되지 않는다. 아울러, 하기 설명들은 첨부된 도면을 참조하여 이루어질 수 있다.

[실시예]

샘플 채집

홍조류인 가지까막살(Glateloupia chianggi)은 한국 남해안에서 채집되었다. 채집된 샘플은 멸균된 해수로 2회 세척하고 종이 타월을 이용하여 수분을 제거하였다. 세척 된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관 하였다.

렉틴의 정제

샘플 30g(습윤중량)을 액체 질소에 담그고 막자사발을 사용하여 미세 분말로 분쇄 하였다. 5배 부피의 완충용액(Tris-buffered saline, 20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5, TBS)을 시료에 첨가한 후, 4℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 교반액을 20분 동안 4℃에서 원심 분리 한 후, 상등액을 조추출물(crude extract)로서 회수 하였다.

Bio-rad FPLC 시스템(Bio-rad, USA)을 사용하여 D-만노오스 친화성 크로마토그래피에 조추출물을 직접 로딩 하였다. 컬럼을 10배 부피의 TBS로 세척 하여 결합되지 않은 단백질을 제거 하였다. GCL은 0.5M D-만노오스가 포함된 완충용액을 이용하여 용리하였으며, 280nm에서 흡광도를 모니터링 하였다. 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 결과에서 단일 밴드를 나타내는 분획을 분석에 사용하였다. 정제된 단백질을 4시간마다 완충액을 교환하여 오버나잇 동안 TBS 완충액에서 투석시켰다. 전체 단백질 및 정제된 단백질 농도는 ELISA 판독기를 사용하여 브래드포드 단백질 정량법(Bradford micro-ssay)에 의해 측정되었다.

만노오스 결합형 단백질, 즉 가지까막살 유래 렉틴(Glateloupia chiangii lectin; GCL)은 전술한 바와 같이 만노오스 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 도 1은 D-만노오스 친화성 크로마토그래피를 이용한 가지까막살 조출물의 전기영동 결과이다(M, molecular weight marker; lane 1, crude extract; lane 2, flow-through fraction; Lane 3, purified GCL). 도 1을 참조하면, GCL은 단일 단백질 밴드가 불순물 없이 단리된 분획에서 관찰되었다. GCL의 분자량은 SDS-PAGE에서 약 25 kDa였다. 하기 표 1에서 보는 바와 같이 가지까막살 샘플 30g으로부터 약 13.8 mg의 총 단백질을 추출 하였으며 GCL 0.65 mg을 수득하였다. 이는 추출된 전체 단백질의 4.7 %이고 활성은 51,200 (titer/mg)이었다. 정제 배수는 14.72로 증가 하였다.

	Total protein (mg)	Concentration (mg/mL)	Total activity (Titer)	Specific activity (Titer/mg)	Percentage of Recovery	Purification fold
Crude extract	13.8	0.092	48,000	3,478	100	1.00
Affinity chromatography	0.65	0.025	33,280	51,200	69.3	14.72

혈구 응집분석 및 탄수화물 특이성

혈구 응집분석을 위하여 말과 양 혈액을 구입하였다(Hanil Comed, 한국). 상등액의 붉은색이 사라질 때까지 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.3)로 혈액을 씻어 내었다. 각 적혈구는 PBS에서 4% 현탁액으로 제조 하였다. 샘플을 96-웰 U bottom 플레이트에서 연속 희석시킨 후 4% 적혈구 현탁액을 각 웰에 첨가 하였다. 실온에서 30분 동안 방치한 후, 응집 활성을 판정 하였다.

탄수화물 특이성은 혈구 응집 억제 시험으로 측정하였다. 억제 시험을 위하여 사용된 단백질과 탄수화물은, D-글루코스(D-Glc), D-만노오스 (D-Man), D-갈락토오스(D-Gal), N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), N-아세틸-D-갈락토스아민(GalNAc), D-푸코스(F-Fuc), 과당(Fru), 락토오스(Lac) 및 페투인(fetuin)이다. 4 유닛의 혈구 응집 활성을 갖는 샘플(25 μL)을 각 탄수화물(25 μL)과 혼합하고 25 μL의 혼합물을 웰에서 제거하였다. 동량의 4% 말 적혈구 현탁액을 샘플에 첨가하고 혼합 하였다. 플레이트를 실온에서 30 분 동안 방치한 후 억제 활성을 측정 하였다.

도 2는 GCL에 말 적혈구 및 양 적혈구에 대한 혈구 응집결과를 도시한 도면이다. 도 2를 참조하면, GCL에 의해 말 적혈구는 응집 되었지만, 양 적혈구는 응집되지 않았다. 말 적혈구의 응집을 위한 GCL의 최소 농도는 0.8 μg/mL이었다.

도 3은 GCL의 탄수화물 및 단백질에 대한 혈구 응집분석 결과를 도시한 도면이다. GLC에 의한 저해 실험은 렉틴의 탄수화물 결합 특이성을 결정하기 위해 10개의 다른 탄수화물을 이용하여 수행되었다. 도 3을 참조하면, GCL의 혈구 응집 활성은 D-만노오스 및 과당에 의해 각각 125 mM 및 250 mM에서 억제되었다. 활성은 195 μg/mL의 당 단백질인 페투인(fetuin)에 의해서도 억제되었다. 그러나 실험된 다른 탄수화물은 활성을 억제하지 못했다.

온도와 2가 양이온의 영향

도 4는 온도에 따른 GCL의 활성도를 도시한 그래프이다. 도 4를 참조하면, GCL의 열 안정성은 다양한 온도 (20-90℃)에서 측정되었다. GCL 활성은 30℃까지 영향을 받지 않았다. 활성의 절반은 40℃에서 사라졌다. 흥미롭게도 원래 활성의 약 15%가 90℃에서 30 분 동안 가열 한 후에도 유지되었다. 도 5는 2가 양이온 첨가에 따른 CGL 활성도 변화를 분석한 그래프이다. 도 5를 참조하면, 렉틴의 활성은 2가 양이온의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 2가 양이온, Mg2⁺ 및 Ca2⁺의 첨가는 GCL 활성을 증가시키지 않았다.

GCL의 N-말단 아미노산 서열의 결정

N-말단 아미노산 서열은 한국 기초 과학 연구원 (KBSI, 한국)에서 결정 하였다. 단백질 밴드는 웨스턴 블랏 키트(Bio-rad, USA)를 사용하여 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 폰시스 S 염색 용액으로 염색 하였다. 멤브레인상의 단일 밴드를 나이프를 사용하여 얇게 오린 후 KBSI로 발송했다. 시퀀서, Procise 491 HT 단백질 시퀀서(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 N-말단 서열 분석을 수행하였다.

질량 분석법을 이용한 펩티드 맵핑

전기영동에 의하여 수득한 단백질 밴드를 절제하고, 트립신으로 겔에서 소화시키고, Zip-tip(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 세정하였다. 질량 분석은 6545 Q-TOF LC/MS(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)와 Capillary LC-Nano ESI-MS를 사용하여 수행되었다. ZORBAX 300SB-C8 컬럼(1 x 50 mm, 3.5 μm; Agilent)는 0.1%(v/v) 포름산이 포함된 Mass grade의 물로 평형화시키고, 물과 100% 아세토 니트릴 사이의 구배로 시료를 용리하였다. 이동상의 속도는 10 μL/min 이었다. 질량 분석에 사용 된 튜닝 파라미터는 다음과 같다.

[모세관 온도 300 ℃, 소스 전압 1.9 kV, 스키머 전압 45 V 및 프래그먼트 전압 175 V]

GCL의 클로닝 및 cDNA 서열의 결정

N-말단 서열 및 펩티드 맵핑 결과에 기초하여, cDNA 서열을 전사체(transcriptome) 데이터(Hi-seq 3000에 의해 생성됨)와 비교하여 확보하였다. 전체 cDNA 서열은 PCR을 통해 확인 하였다. Total RNA는 판매사의 방법에 따라 Qiagen Plant total RNA isolation kit를 사용하여 얻었다. Total RNA의 품질은 분광 광도계와 포름 알데히드 아가로즈겔 전기영동을 사용하여 측정했다. cDNA 합성 키트을 사용하여 First strand cDNA를 합성했다. 인트론 PCR 정제 키트를 사용하여 cDNA를 정제하고, 정제된 cDNA는 PCR에 직접 사용 하였다. 전사체 데이터와 N-말단 서열 결과를 바탕으로 PCR 프라이머를 설계 하였다. PCR 반응은 다음과 같이 수행 하였다.

predenaturation 95℃ 2 분, 95℃ 20 초 35 cycle, 60℃ 30 초, 72℃ 1 분 후 72 ℃에서 10 분간 최종 반응을 수행 하였다. PCR 산물은 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 확인하였으며, 표적 밴드는 날카로운 칼로 절제하여 정제에 사용하였다. PCR 생성물은 제조사의 방법에 따라 겔 용출 키트를 사용하여 정제 하였다. 분리된 PCR 산물을 T-easy 클로닝 벡터에 클로닝하고 숙주 DH5α로 형질 전환시켰다. 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 오버나잇동안 배양 하였다. 배양 후, 양성 콜로니를 모으고 LB Broth에서 37℃에서 오버나잇 동안 배양 하였다. Qiagen(Qiagen, USA)의 플라스미드 분리 키트를 사용하여 플라스미드를 분리하였다. DNA는 Sanger 기반 방법 (Macrogen, 한국)에 의해 서열을 분석하였다.

글리칸 미세 배열법(glycan microarray)

글리칸 미세배열법은 Ebiogen(한국)에 의해 수행되었다. 글리칸 어레이 키트는 RayBioTech(Norcross, GA, USA)에서 구입했다. 유리 슬라이드 상에 4개의 인쇄 된 300개의 합성 글리칸을 함유하는 어레이를 사용 하였다. 라벨 기반 검출은 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다. 50 μg/mL의 Biotinylated 렉틴을 웰에 넣고 3 시간 이상 온화하게 흔들어 주었다. 유리 슬라이드를 키트에 제공된 1X 세척 버퍼 I 및 II로 세척 하였다. 글리칸-렉틴 결합은 실온에서 1시간 동안 Cy3 등가 염료가 결합된 스트렙타비딘으로 반응시켜 검출 하였다. Cy3 검출을 위해 신호를 마이크로 어레이 레이저 스캐너(Genfix 4100A, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 시각화 하였다(exitation 554 nm, emmision 568 nm). 마이크로 어레이 분석 소프트웨어 Genfix를 사용하여 데이터 추출을 수행 하였다. R,FF;ZLS 어레이 데이터는 RayBioTech(RayBioTech) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

도 6 및 도 7은 GCL에 대한 글리칸 마이크로 어레이 분석결과를 도시한 그래프이다. 탄수화물 특이성을 결정하기 위해, 300개의 다른 탄수화물을 고정화시킨 glycan-300 어레이 키트를 사용하여 글리칸 마이크로 어레이를 수행 하였다. 도 6 및 도 7, 및 하기 표 2를 참조하면, 300개의 테스트된 탄수화물 중에서 18개가 1,000 이상의 양성 신호를 나타냈다. GCL은 단당류, β-Glc-sp, β-Gal-sp 및 α-Man-sp에 약한 결합 신호를 보였다. 정규화된 신호 강도는 각각 2,579, 2,269 및 2,194이다. 또한, 신호 강도 2,705로 Maltotetraose-β-Sp1에 결합 할 수 있었다. GCL은 Maltohexaose-β-Sp1과 Maltoheptaose-β-Sp1에 강하게 결합 하였다. 이 단백질은 약한 결합 친화력(1,000 시그널 강도)의 N-글리칸에 결합할 수 있었다. 고만난 구조, 즉, Man-α-1,6-(Man-α-1,3-), Man-α-1,6-(GlcNAc-β-1,2-Man-α-1,3- )Man-β-1, 4-GlcNAc-β-1, 4-GlcNAc-Sp5 또한 GCL과 상호 작용하는 것으로 확인되었다.

GCL의 분자 특성 및 클로닝

도 8은 GCL의 아미노산 서열 및 상보적 DNA 서열을 도시한 도면이다. 도 9는 GCL 단백질을 이루는 8개의 펩타이드를 분석한 그래프이다. 에드만 분해법(Edman degradation)을 이용하여 GCL의 N- 말단 아미노산 서열을 결정하였으며, 도 8을 참조하면 N-말단 서열은 Val-Val-Ser-Asn-Arg-Lue-Val-Ser-Gly-Glu-X- Leu-His-Arg으로 확인되었다. 전장 cDNA 서열은 Hi-seq 2000을 사용하여 생성된 전사체 데이터와 PCR에 의해 결정되었다. cDNA는 900bp로 이루어져 있고, 696bp의 Open reading frame(ORF)을 포함 하였다. 단백질의 계산된 분자량은 24.9kDa이고 이론 등전점은 pI 6.97이었다. 도 9는 GCL에 대한 LC-MS/MS 데이터를 도시한 그래프이다. LC-MS/MS 데이터로부터 8개의 펩타이드 질량 데이터가 얻어졌으며, 전체적으로 단백질 서열의 약 70%를 차지하였다. 전술한 펩티드 맵핑 데이터 및 N-말단 서열 분석 결과는 예측된 펩타이드 질량 정보와 일치하였다. N-말단 메티오닌은 N-말단 서열과 데이터를 비교하여 전사 후 변형 후에 제거되는 것으로 판단된다. 도 10은 GCL의 6개의 반복 도메인 서열을 도시한 도면이다. 도 11은 GCL의 반복 도메인을 포함하는 탠덤 구조를 도시한 개념도이다. 도 10 및 도 11을 참조하면, 흥미롭게도, GCL은 ~ 30mer의 아미노산으로 구성된 6개의 반복 도메인을 포함하는 탠덤 반복 구조를 가진 것으로 확인되었다. GCL은 렉틴 B 클래스의 구성원이었으며 박테리아로부터 유래한 만노오스 결합 렉틴과 유사성을 보였다. 만노오스 결합 부위와 이량체화 계면은 잘 보존 되어 있었다. 그러나 식물이나 조류 그룹의 유사한 단백질은 유전자은행 데이터베이스를 사용하여 찾을 수 없었다.

항바이러스 효과

표 3을 참조하면, GCL은 낮은 농도, 0.18 μg/mL과 0.036 μg/mL에서 각각 HSV1 (herpes simplex virus 2)과 HSV2 (herpes simplex virus 2)에 대해 항바이러스 효과를 나타냈다. 또한 GCL은 5 μg/mL까지 세포독성을 보이지 않았다. 대조군으로 사용한 대표적인 만노오스 결합 단백질인 Concanavalin A는 29.29 μg/mL에서 세포독성을 보였으며, 5 μg/mL 이하에서는 항바이러스 효과가 없었다. 항바이러스 효과는 virus-induced cytopathic effect(CPE) 저해법 및 MTT법에 의한 세포생존율 등을 이용하여 확인하였다. 양성대조군으로 단순포진 바이러스 감염 및 치료에 사용되는 항바이러스 약물인 아시클로비어(Acyclovir)와 덱스트란설페이트 8000 Dextran sulfate 8000) 및 펜토산 폴리설페이트(Pentosan polysulfate)를 사용하였다. 사용된 양성대조군 중 아시클로비어가 가장 높은 항바이러스 활성을 가지고 있었으며, 활성도는 HSV1과 HSV2에 대해 각각 0.52μM, 2.87μM 이었다. GCL은 사용된 양성대조군보다 낮은 농도에서 항바이러스 활성을 가지고 있었다. 또한, 약물로서의 개발가능성이 높은 지수를 나타내는 선택도(Selective index; SI) 값이 5 이상일 경우 추가적인 항바이러스 연구가 진행됨을 감안하면, GCL은 각각 28과 140 이상을 가지고 있어 잠재적인 항바이러스 제제로서 가능성이 있는 것으로 판단된다.

	Toxicity CC₅₀	Antiviral activity (EC₅₀),μg/ml		Selective index
	Toxicity CC₅₀	HSV1(F)	HSV2(MS)	HSV1(F)	HSV2(MS)
GCL	>5	0.18	0.036	>28	>140
Concanavalin A	29.29	5.82	5.15	5	6
Acyclovir	>100	0.52^￡	2.87^￡	>192	>35
Dextran sulfate 8000	>100	15.54	4.52	>6	>22
Penosan polysulfate	>100	4.77	2.10	>21	>48

￡: concentration, μM

<110> NATIONAL MARINE BIODIVERSITY INSTITUTE OF KOREA <120> GRATELOUPIA CHIANGGI LECTIN AND LECTIN DNA CODING THE SAME <130> XDP18-006 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLC <400> 1 Met Val Val Ser Asn Arg Leu Val Ser Gly Glu Ser Leu His Arg Gly 1 5 10 15 Gln His Ile Ile Ser Ser Asp Gln His Phe Met Leu Val His Gln Tyr 20 25 30 Asp Gly Asn Val Val Leu Tyr Asp Val Ala Gly Ser Gly Ser Gly Lys 35 40 45 Pro Leu Trp Ser Thr Asn Thr Tyr Gly Ser His Thr Thr Val Phe Lys 50 55 60 Met Gln Glu Asp Ser Asn Leu Val Leu Tyr Ala Thr Gly Gly Lys Pro 65 70 75 80 Ile Trp Ala Ser Asp Thr His Gly Ser Gly Gly Arg Phe Leu Glu Met 85 90 95 Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Asp Val Gly Lys Pro Lys 100 105 110 Trp Ala Ser Asp Thr His Gln Gly Ile Ala Pro Arg Ser Glu Ile Ser 115 120 125 Val Asn Gln Val Leu Arg Ile Arg Glu Gly Leu His Ser Ala Asn Lys 130 135 140 Arg Asn Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Leu Ser Lys 145 150 155 160 Asn Gly Ser Thr Ala Trp Ser Ser Gly Thr Ala Gly Thr Gly Ala Asn 165 170 175 Val Leu Val Leu Gln Ile Asp Gly Asn Leu Val Leu Tyr Asn Asp Thr 180 185 190 Lys Ser Val Trp Ala Ser Gly Ser Met Asn Lys Gly Gly Arg Thr Ala 195 200 205 Val Met Gln Asp Asp Gly Asn Phe Val Leu Tyr Ala Glu Gly Gly Lys 210 215 220 Pro Val Trp Ala Thr Asn Thr 225 230 <210> 2 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL_cDNA <400> 2 ctctatataa caagcgccag taatccggtt gggatcacag cccagtcatc tcagacatca 60 accacactag ttttccattg aaaattgaaa tctctctaac ttgtggtgtt aacgcaaaga 120 aacatggttg tctccaacag acttgtcagc ggtgaaagtt tgcatcgtgg acaacatata 180 atctcgtctg atcagcattt tatgttggtg catcaatatg atgggaatgt ggtcctttac 240 gatgttgccg ggagtggctc agggaaacct ttatggagca cgaacacata tggttctcac 300 accactgtct ttaaaatgca agaggattca aatctcgtgc tttatgccac tggtgggaaa 360 ccgatatggg catctgacac ccacggttcc ggtggcaggt tcctggagat gcaaaatgat 420 ggaaatttgg ttgtgtacac cgacgtaggt aaaccgaaat gggcctcgga cacccatcaa 480 gggattgcac ctcgcagtga aatctcggtg aatcaagtcc ttcgcatacg cgaagggctg 540 cattctgcga ataagaggaa cgagttgatc ttgcagaatg acggaaattt ggttctttct 600 aagaatggaa gcacagcctg gagttctgga actgctggta cgggggctaa tgttctggtc 660 ctacagattg atggcaactt ggtgctttac aacgatacca agagcgtctg ggcttctggt 720 tcgatgaata agggcggtcg caccgcggtg atgcaggacg acggcaactt tgtgctttac 780 gcggagggag gaaaacccgt ctgggctacc aatacgtaat accgcttcga tgccgttcca 840 gatatgttca ttcactaatg aaagtgatgg gataatcgat ttaccacgca tatgtagaag 900 900

Claims

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홍조류인 가지까막살(Grateloupia chiangii)로부터 분리 및 정제된 단백질로서,
서열목록 1의 아미노산 서열을 포함하고, HSV1 및 HSV2에 대하여 항바이러스 특성을 갖는 항바이러스성 가지까막살 유래 렉틴.
제3항의 항바이러스성 가지까막살 유래 렉틴을 부호화하고,
서열목록 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 렉틴 유전자.