KR101764852B1 - 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 - Google Patents
낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101764852B1 KR101764852B1 KR1020150118069A KR20150118069A KR101764852B1 KR 101764852 B1 KR101764852 B1 KR 101764852B1 KR 1020150118069 A KR1020150118069 A KR 1020150118069A KR 20150118069 A KR20150118069 A KR 20150118069A KR 101764852 B1 KR101764852 B1 KR 101764852B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antimicrobial
- seq
- peptide
- octopus
- activity
- Prior art date
Links
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 241000047760 Octopus variabilis Species 0.000 title description 9
- 241000238413 Octopus Species 0.000 claims abstract description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 18
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 77
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 27
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 20
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 101001014217 Morone saxatilis Moronecidin Proteins 0.000 description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 10
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 4
- 238000012287 DNA Binding Assay Methods 0.000 description 4
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 4
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 4
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 4
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 4
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 2
- 102100034523 Histone H4 Human genes 0.000 description 2
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGFPKYKDLYYTJH-OALUTQOASA-N 2-[[2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 BGFPKYKDLYYTJH-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- JUWQNWXEGDYCIE-YUMQZZPRSA-N Arg-Gln-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O JUWQNWXEGDYCIE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VNFWDYWTSHFRRG-SRVKXCTJSA-N Arg-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VNFWDYWTSHFRRG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UGZUVYDKAYNCII-ULQDDVLXSA-N Arg-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGZUVYDKAYNCII-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- HXKZJLWGSWQKEA-LSJOCFKGSA-N His-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HXKZJLWGSWQKEA-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KZJQUYFDSCFSCO-DLOVCJGASA-N Lys-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KZJQUYFDSCFSCO-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N Thr-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- XHALUUQSNXSPLP-UFYCRDLUSA-N Tyr-Arg-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 XHALUUQSNXSPLP-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N Val-Ser-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- GVNLOVJNNDZUHS-RHYQMDGZSA-N Val-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GVNLOVJNNDZUHS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000037237 body shape Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010034423 historphin Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 낙지로부터 유래하며, 항균 활성이 우수한 펩타이드를 가지고 상용화가 가능하도록 새롭게 디자인된 것이다. 즉, 아미노산의 수를 상용화가 가능하도록 적절히 디자인되었으며, 생체내 또는 생체외 모두에서 항균 활성이 우수하게 달성되도록 하여 모체 펩타이드가 낙지의 생체외에서 항균 활성이 현저히 감소되는 문제를 해결하였다. 또한 상용화에 따른 합성 과정에 불구하고, 합성에 따른 구조적 변경으로 인한 항균 활성 감소의 문제를 해소하였다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 낙지로부터 유래하며, 항균 활성이 우수한 펩타이드를 가지고 상용화가 가능하도록 새롭게 디자인된 것이다. 즉, 아미노산의 수를 상용화가 가능하도록 적절히 디자인되었으며, 생체내 또는 생체외 모두에서 항균 활성이 우수하게 달성되도록 하여 모체 펩타이드가 낙지의 생체외에서 항균 활성이 현저히 감소되는 문제를 해결하였다. 또한 상용화에 따른 합성 과정에 불구하고, 합성에 따른 구조적 변경으로 인한 항균 활성 감소의 문제를 해소하였다.
Description
본 발명은 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.
항균 펩타이드가 병원균에 작용하는 기작은 기존 항생제들의 작용기전과 매우 다르다. 이들은 주로 미생물의 세포표면에 결합한 후, 세포막에 pore를 형성함으로써 세포막의 정상적 투과특성을 교란하여 병원체를 빠른 속도로 죽게 한다(Pharmacol. Rev. 55: 27-55, 2003). 또한 이들은 병원체의 내독성 인자로 인해 초래되는 패혈증을 방지할 수 있다고 알려져 있으며(Biochim. Biophys. Acta. 1562: 32-36, 2002), 고등동물체내에서 후천성면역반응을 매개하는 신호분자로서도 작용한다고 보고되었다(J. Leukoc. Biol. 60: 415-422, 1996). 이러한 특성으로 인해 항균 펩타이드는 항생제 내성균을 제어할 수 있는 신규 항생제나 새로운 생체면역활성인자로 이용할 수 있을 것으로 주목 받고 있다. 이에 그 동안 기존 항생제를 대체할 수 있는 항생물질을 찾기 위해 다양한 생물체에서 펩타이드성 항생물질이 분리되어 시험 되었다. 그러나 실제 제품화되어 사용되고 있는 사례는 극히 드문데, 이는 펩타이드 항생제가 생체내에 주입되었을 때의 안정성이나 인체에 대한 안전성의 문제가 제기되었기 때문이다.
이러한 난점을 해결하기 위해서는 항균 또는 항진균 활성을 갖는 펩타이드들의 아미노산 서열과 구조를 비교 분석하여 인체에는 위해를 가하지 않으면서 효율적으로 미생물을 사멸시킬 수 있는 구조를 알아내야 한다. 이를 위해서는 지금까지 보고된 것 이상의 다양한 항균 활성 펩타이드의 아미노산 서열과 구조에 대한 정보가 필요한 실정이다.
또한 이러한 문제 이외에도 발견되는 항균 펩타이드를 상용화하기 위해서는 펩타이드의 구조가 복잡하지 않으면서 아미노산 서열도 12-15 개를 넘지 않아 쉽게 합성이 가능하면서 항균 활성도 우수하게 유지되어야만 하지만, 이러한 구조의 항균 펩타이드를 발견하기 위한 노력은 많이 부족한 실정이다.
한편, 척추동물 또는 무척추동물 모두에서는 자신을 방어하기 위한 면역 체계를 가지고 있는데, 특히 해양무척추동물의 경우에는 육상 환경과 달리 해양에 존재하는 감염원에 항상 노출되어 있으므로, 스스로의 방어 시스템에 의한 면역체계를 가지고 있다. 그러므로 이러한 해양무척추동물의 방어 시스템을 활용하여 항균 펩타이드를 발견하기 위한 노력이 필요함에도 불구하고, 관련 연구는 많이 부족한 실정이다. 특히 낙지와 같은 해양무척추동물에서는 아가미를 통한 외부의 침입 물질에 대한 방어기작으로 각종 항균 펩타이드가 존재할 수 있음에도 이러한 사실에 주목하여 항균 펩타이드를 발견하려는 노력은 많이 부족하였다. 또한 이들로부터 항균 펩타이드를 발견한다 하더라도, 이들을 상용화하기 위해서는 이러한 펩타이드를 모체로 하여 인위적으로 합성하는 과정이 따로 필요하나, 생체내(in vivo)와 생체외(in vitro)에서의 항균 활성이 현저히 달라질 수 있으며, 합성에 따른 구조적 변경을 수반하여 항균 활성이 떨어질 우려가 있으므로, 이러한 항균 펩타이드를 상용화하는데는 많은 문제가 따른다.
본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1374267호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1은 신규한 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 전복으로부터 분리된 항생 펩타이드에 관한 것으로서 대장균 또는 황색포도상구균에 대하여 항균 활성이 뛰어난 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 특허문헌 1에서는 전복에서 분리한 항균용 펩타이드에 관한 내용만이 개시되어 있을 뿐, 낙지(Octopus variabilis)로부터 유래되는 항균 펩타이드에 관하여는 어떠한 개시 또는 암시조차 되어 있지 않다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 해양무척추동물인 낙지(Octopus variabilis)로부터 유래하며 항균 활성이 우수한 펩타이드를 발견하고, 이를 가지고 상용화가 가능할 정도로 아미노산의 개수를 적절하게 디자인하며, 항균 활성도 우수한 항균 펩타이드 유사체(analogue)를 디자인하여 제공하는 것이다. 특히, 합성에 따른 구조적 변경에도 항균 활성이 저하되지 않으면서, 모체 펩타이드와는 달리 생체내 또는 생체외 모두에서 항균 활성이 우수하게 유지되는 항균 펩타이드를 제공하는 것이 목적이다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균용 약학 조성물은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하며, 상기 항균 펩타이드는 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 낙지로부터 유래하며, 항균 활성이 약한 펩타이드를 가지고 상용화가 가능하도록 새롭게 디자인된 것이다. 즉, 아미노산의 수를 상용화가 가능하도록 적절히 디자인되었으며, 생체내 또는 생체외 모두에서 항균 활성이 우수하게 달성되도록 하여 모체 펩타이드가 낙지의 생체외에서 항균 활성이 현저히 감소되는 문제를 해결하였다. 또한 상용화에 따른 합성 과정에 불구하고, 합성에 따른 구조적 변경으로 인한 항균 활성 감소의 문제를 해소하였다.
도 1은 낙지 아가미 추출물의 트립신 처리 전후의 항균활성 측정 결과이다.
도 2는 Prep-cell pooled #의 E. coli D31에 대한 항균활성 및 활성 분포도이다.
도 3은 낙지 아가미 추출물들의 활성 prep-cell #들의 AU-PAGE이다.
도 4는 낙지 아가미 추출물의 활성분획 prep-cell #53으로부터 항균 펩타이드를 정제하기 위한 역상 HPLC 결과이다.
도 5는 낙지 아가미 추출물 펩타이드들의 분자량 측정 및 edman degradation 결과이다.
도 6은 낙지 아가미 추출물 유래 Ov 1(A)과 Ov 2(B)의 2차 구조예측이다.
도 7은 낙지 아가미 추출물 유래 Ov 1(A) 및 Ov 2(B)의 sequence alignment이다.
도 8은 Ov 1과 Ov 2의 항균활성 측정 결과이다.
도 9는 Ov 1 유사체들(Ov1-1, Ov1-2)의 항균활성 측정 결과이다.
도 10은 Ov 1과 Ov 2 유사체들과 piscidin 1의 인간 적혈구에 대한 용혈활성 측정 결과이다.
도 11은 Ov 1과 Ov 2 유사체들과 piscidin 1의 E. coli ML35p의 내막 투과성 측정 결과이다.
도 12는 Ov 1과 Ov 2 유사체들의 DNA 결합력 측정 결과이다.
도 2는 Prep-cell pooled #의 E. coli D31에 대한 항균활성 및 활성 분포도이다.
도 3은 낙지 아가미 추출물들의 활성 prep-cell #들의 AU-PAGE이다.
도 4는 낙지 아가미 추출물의 활성분획 prep-cell #53으로부터 항균 펩타이드를 정제하기 위한 역상 HPLC 결과이다.
도 5는 낙지 아가미 추출물 펩타이드들의 분자량 측정 및 edman degradation 결과이다.
도 6은 낙지 아가미 추출물 유래 Ov 1(A)과 Ov 2(B)의 2차 구조예측이다.
도 7은 낙지 아가미 추출물 유래 Ov 1(A) 및 Ov 2(B)의 sequence alignment이다.
도 8은 Ov 1과 Ov 2의 항균활성 측정 결과이다.
도 9는 Ov 1 유사체들(Ov1-1, Ov1-2)의 항균활성 측정 결과이다.
도 10은 Ov 1과 Ov 2 유사체들과 piscidin 1의 인간 적혈구에 대한 용혈활성 측정 결과이다.
도 11은 Ov 1과 Ov 2 유사체들과 piscidin 1의 E. coli ML35p의 내막 투과성 측정 결과이다.
도 12는 Ov 1과 Ov 2 유사체들의 DNA 결합력 측정 결과이다.
이에 본 발명자들은 낙지(Octopus variabilis)에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하면서 상용화가 가능한 펩타이드의 유사체인 항균용 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 항균용 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 유사체인 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 유사체일 수 있다. 또한 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 유사체일 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 낙지에서 유래된 모체 항균 펩타이드(서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드)와 이의 유사체(서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드)에 관한 것이다.
이러한 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 낙지의 아가미에서 유래하는 것으로서, 본 발명자들은 이러한 펩타이드의 항균 활성을 확인하였다. 다만, 이러한 항균 펩타이드를 인공적으로 합성한 이후에는 항균 활성이 현저하게 떨어지는 점을 확인하였다. 이는 합성 과정에서 수반되는 구조적 차이점 때문이거나, 생체외(in vitro)에서는 합성에 따른 환경적 차이로 인해 항균 활성이 현저히 떨어지는 것일 수 있다. 그리하여 상용화가 가능하도록 아미노산 수를 적절히 디자인하면서, 항균 활성도 우수하게 유지하고, 합성에 의해 in vitro 환경으로 변화하여도 in vivo와 마찬가지로 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드인 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 유사체(Analogue)를 디자인하게 되었다. 구체적으로는 상기 서술한 바와 같이 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 유사체일 수 있으며, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 유사체일 수 있다.
또한 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 모체 펩타이드일 수 있으며, 이의 실험치 분자량은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 1211.59 Da일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 모체 펩타이드일 수 있으며, 이의 실험치 분자량은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 2502.24 Da일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 β-쉬트(β-sheet) 구조와 turn 구조가 섞여있는 혼합구조를 이룰 수 있으며, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 α-헬릭스(α-helix)를 주요 구조로 β-쉬트(β-sheet) 구조와 turn 구조가 약간 섞여 있는 2차 구조일 수 있다.
또한 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 4에서 Gly 잔기 또는 Gln 잔기를 다른 아미노산으로 치환하고, C-말단을 아미드화 시키는 방법으로 유사체를 디자인할 수 있다. 또한 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 5의 2차 구조 예측 결과 α-헬릭스 구조를 취하는 부분을 우선적으로 선택하여 아미노산 치환법과 C-말단의 아미드화를 통해서 유사체를 디자인할 수 있다.
이렇게 디자인된 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro) 모두에서 항균 활성이 우수하면서, 상용화가 가능한 것이다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 용혈활성을 보이지 않아 세포 독성의 문제도 없는 항균용 펩타이드일 수 있다. 한편 본 발명에 따른 항균 펩타이드 중 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 내막 투과성이 약하지만, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 내막 투과성이 강하다. 또한 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3 모두 DNA에 대한 결합력은 강하다. 그러므로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 막을 직접 공격 대상으로 하기 보다는 DNA의 intracellular target site를 공격 대상으로 하여 간접접으로 항균 활성을 달성하는 것일 수 있다. 즉, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 항균 펩타이드는 목적(target)이 되는 DNA에 결합하여 전사와 번역을 방해함으로써 항균 활성을 나타내는 것일 수 있다. 또한 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 세포막을 직접 공격하여 항균 활성을 달성하는 작용 기작을 보일 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드는 C-말단에 아미노기(-NH2)가 결합할 수 있다. 이렇게 상기 항균 펩타이드의 C-말단에는 아미노기(-NH2)가 결합하는 경우에는 프로테아제(protease)에 대한 저항성 향상과 net-charge를 향상시키는 효과가 보다 향상될 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드는 B. subtilis , S. epidermidis , S. mutans , A. hydrophila. E. coli , S. enterica , S. flexni , S. sonnei , P. aeruginosa 및 C. albicans로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.
또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 바람직한 일실시예로서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 C-말단에 아미노기(-NH2)가 결합한 경우의 효과를 보다 구체적으로 살펴보면 항균 활성이 우수하면서, 용혈활성이 나타내지 않고, 막 투과성도 높지 않았으며, DNA와의 결합력도 높기 때문에, 이러한 경우에는 세균의 막을 직접적으로 공격하기 보다는 세포 내로 침투한 후에 세포 내 물질(예: DNA)에 결합을 하거나 또 다른 간접적인 방법(예: DNA에 결합하여 전사와 번역을 방해함)으로 항균 작용을 달성하게 됨을 의미할 수 있다.
또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 바람직한 일실시예에 해당하는 것으로서, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단에 아미노기(-NH2)가 결합한 경우의 효과를 보다 구체적으로 살펴보면 용혈활성이 나타나지 않고, DNA 결합력도 높았으나 나머지 유사체의 경우와는 달리 막 투과성이 높아 막을 직접 공격하는 방식으로 항균 활성을 달성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균용 약학 조성물은
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하며,
상기 항균 펩타이드는 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 유사체인 것을 특징으로 한다.
이러한 본 발명에 따른 상기 항균용 약학 조성물은 본 발명의 또 다른 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유함으로써, 항균 활성의 약리효과를 달성하게 된다.
상기 항균 펩타이드는 낙지의 아기미에서 발견된 펩타이드로부터 유래한 것으로서, 상기 항균 펩타이드는 C-말단에는 아미노기(-NH2)가 결합하는 것일 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드는 B. subtilis , S. epidermidis , S. mutans , A. hydrophila. E. coli , S. enterica , S. flexni , S. sonnei , P. aeruginosa 및 C. albicans로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.
한편, 상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.
또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드는 항균 활성을 B. subtilis , S. epidermidis , S. mutans, A. hydrophila . E. coli , S. enterica , S. flexni , S. sonnei , P. aeruginosa 또는 C. albicans로부터 대표적으로 유발되는 질병인 식중독, 칸디다즘, 장티푸스, 콜레라 등의 질병을 예방 또는 치료하는 것이 가능하기 때문에 이러한 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하여 상기 질병들의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
<재료 및 방법>
실험동물
실험에 사용된 낙지(삼천포 산)는 전북 군산시 해망동 수산물종합센터에서 살아있는 상태로 구입한 후, 실험실로 옮겨서 즉시 조직 채취 및 추출과정을 수행 하였으며, 얻어진 각각의 추출물들은 사용 전까지 -70 ℃에 보관하였다.
시약 및 재료
항균활성 측정을 위한 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, TSB)와 아가로스 타입 I(Low EEO Agar)은 Merck사(Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 천연물 및 합성물의 정제과정에서 사용된 HPLC용 물과 아세토니트릴(CH3CN)은 Tedia사(Ohio, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
해양무척추동물
조직 추출
각각의 조직을 채취한 후 즉시 약산을 이용한 추출과정을 수행하였다. 채취된 조직을 4 배의 조직 부피에 해당하는 1 % 초산(v/v)을 첨가하고 열을 가해서 5 분 동안 끓인 후에 얼음에 보관하면서 완전히 냉각을 시켰다. 냉각된 조직을 균질기(homogenizer)를 이용해서 완전히 파쇄를 시킨 후에 원심 분리를 하였다. 상층액을 취해서 항균활성 탐색 및 펩타이드 정제에 사용 전까지 -70 ℃에 보관하였다.
항균활성측정방법 및
사용균주
항균 펩타이드의 정제를 위한 실험에서는 E. coli D31을 사용하였으며, 유도체들의 항균활성 측정 실험에는 그람 양성균 3종(B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans), 그람 음성균 4종(E. coli D31, S. enterica, Shigella sonnei, P aeruginosa) 및 yeast 1종(Candida albicans)을 사용하였다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay(URDA)법을 이용하였다. URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양 온도에서 18 시간 동안 pre-culture 후 colorimeter(ProductNo.52- 1210, BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도를 84%T(≒ 1 x 108 CFU/mL)가 되게 맞추었다. 그 후, 9.5 mL의 0.03 % TSB, 1 % 타입 Ⅰ 아가로스 및 10 mM 포스페이트 버퍼(PB)(pH 6.5)를 포함하는 언더레이 젤에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 mL을 넣고 잘 섞은 후에 플레이트에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 플레이트에 펀치를 사용하여 직경 2.5 mm의 웰을 뚫은 후에 5 μL의 정제과정의 용액 또는 5 μL의 펩타이드 용액(1000 ug/mL in 0.01 % HAc)을 도입시켰다. 모든 샘플은 0.01 % 아세틱 산 5 μl를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다. 펩타이드가 배지에 스며들면 3 시간 동안 1 차 배양한 후, 그 위에 10 mL의 6 % TSB, 1 % 타입 Ⅰ 아가로스 및 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)를 포함하는 오버레이 젤을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18 시간 동안 2 차 배양하였다. 다음날 웰 주위에 생긴 클리어링 존(clearing zone)의 크기를 측정하여 항균활성을 확인하였다. 대조군으로는 미국산 잡종 농어의 비만세포에서 유래한 항균 펩타이드로서 항균력은 우수하나 용혈활성이 강력한 piscidin 1을 사용하였다.
용혈활성
(
Hemolysis
) 측정
인간 적혈구에 대한 용혈활성을 측정하기 위해서 사람 혈액(혈액형 B형)에 동량의 포스페이트 버퍼 살린(phosphate buffered saline, PBS, 50 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 넣고 혼합한 후 8000 x g, 4 ℃, 1 분간 원심분리해 상층액을 제거하였다. 이러한 세척과정을 3 회 반복한 후 얻어진 적혈구를 3 % 헤마토크리트(hematocrit)이 되도록 PBS를 첨가하였다. 용혈활성을 측정하기 위해서 3 % 헤마토크리트(hematocrit) 90 μL를 e-튜브(tube)에 도입시키고 10 μL의 각 농도의 펩타이드 용액을 첨가하였다. 각각의 e-튜브(tube)를 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 4 ℃에서 10 분간 13,000 x g로 원심분리를 하였다. 얻어진 각각의 상층액에서 70 μL를 취해서 96-웰 마이크로티터 플레이트(well microtiter plate)로 옮긴 후 542 nm에서 헤모글로빈 유출 정도를 측정하였다. 적혈구의 100 % 용혈을 위한 실험 대조구로는 트리톤(triton) X-100 (0.1 %)을 사용하였으며, 다음 식을 사용하여 용혈활성 정도를 계산하였다.
% Hemolysis = [(Abs 542nm in the peptide solution - Abs 542nm in buffer) / (Abs 542nm in 0.1% Triton X-100 - Abs 542nm in buffer)] x 100
Acid
-
urea
PAGE
(
AU
-
PAGE
)와 버그-블롯(
bug
-
blot
)
펩타이드성 물질의 분포도와 활성 정도를 확인하기 위해서 acid-urea PAGE를 수행하였다. 아세트산(Acetic acid)과 요소(urea)를 포함하는 젤에 각 추출물 20 uL를 2x 샘플 버퍼 20 uL와 혼합한 후에 젤에 도입시키고 150 V로 50 분 동안 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후에 젤은 coomassie brilliant blue(CBB) R-250 dye로 염색을 한 후에 결과를 확인 하였다. 또한 버그-블롯(bug-blot)을 수행하기 위해서는 전기영동 후에 염색과정을 수행하지 않고 젤을 린스(rinse)한 후에 E. coli D31를 포함하고 있는 LB 플레이트 위에 블롯시키고 3 시간 동안 37 ℃에서 1 차 배양한 후 젤을 제거하고 16-18 시간 동안 37 ℃에서 2 차 배양한 후에 생성된 클리어링 존(clearing zone)과 염색된 젤의 결과를 비교하였다.
Prep
-
cell
Run
Bio-rad Prep cell 491(Bio-rad)을 사용해서 preparative continuous acid-urea PAGE (CAU-PAGE)로 낙지 아가미 추출물의 조 정제과정을 수행하였다. Prep-cell run을 위해서는 6.8 cm의 높이를 가진 젤과 5 % HAc를 버퍼로 사용해서 우선 40 mA로 90 분 동안 pre-run을 실시하였다. Pre-run 과정 후에 아가미 추출물 10 mL을 2x 샘플 버퍼와 혼합한 후에 젤에 도입을 시키고 30 mA로 7 시간 동안 분리과정을 수행하면서 분획을 확보하였다.
항균활성물질의 분리 및 정제
낙지 아가미 추출물은 HPLC(YL9100 HPLC system, 영린기기, Korea)를 이용하여 활성물질을 분리 정제하였다. 즉, 95 % A 용매(0.1 % TFA in HPLC grade water)와 5 % B 용매(0.1% TFA in HPLC CH3CN)로 평형화시킨 Capcell-Pak C18 column(4.6 mm×250 mm, Shiseido, Japan)에 시료를 주입한 후, 60 분간 용매B (5-65 %)의 농도구배로 용출시켰다. 이때, 유속은 1.0 mL/min로 유지하였으며, 각각의 분리된 획분은 URDA방법으로 E. coil D31에 대한 항균 활성을 측정하였다. 활성 피크(peak)들은 동일한 조건으로 최종 단계를 진행한 후에 단일 피크(peak)로 정제하였다.
트립신(
Trypsin
) 처리에 의한 단백질성 활성물질 확인
낙지 아가미 추출물에 존재하는 활성물질이 단백질성 물질인지를 확인하기 위해서 트립신(trypsin) 처리 전, 후의 항균활성 변화를 URDA 법을 이용해서 확인하였다. 낙지 추출물에 트립신(1 mg/mL) 1 μL를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 뒤, URDA 방법으로 활성 변화를 측정하였으며, 대조군으로 4 μL에 0.01 % HAc 1 μL를 첨가한 것을 사용하였다. 트립신을 처리하여 충분히 반응 시킨 후 활성 물질이 분해되어 활성이 소실 또는 감소된다면 활성에 관여하는 물질은 단백질일 것으로 판단하였다.
분자량 측정
펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF/TOF 5800 시스템(AB SCIEX)을 이용하여 측정하였다. 사용된 매트릭스는 5 mg/mL(0.1 % TFA/50 % 아세토니트릴)의 농도로 녹여진 α-Cyano-4-하이드록시신나믹산(hydroxycinnamic acid, CHCA)을 사용하였다. 각각의 펩타이드를 10 uL의 0.1 % TFA 용매로 녹인 후, 매트릭스와 1:1(v/v)로 섞어 기기에 도입시키고, MS Reflector(Positive) operation mode로 분자량을 측정하였으며 standard는 Calmix 2를 사용하였다.
아미노산 서열결정
정제한 펩타이드들의 아미노산 서열을 결정하기 위해서 한국기초과학지원 연구원에 있는 Procise 491 HT protein sequencer(Applied Biosystems, USA)를 사용한 Edman 분해법으로 분석하였다.
분자량,
pI
,
homology
search
및
sequence
alignment
분석된 일차 구조의 분자량 및 pI의 계산은 Expasy tool(http://expasy.org/tools/)을 사용하여 분석을 하였다. 그리고 homology search는 NCBI BlastP(http://www.ncbi..nlm.gov/BLAST)를 이용하여 확인하였다. 유사성이 있는 물질들과의 primary sequence들의 alignment는 ClustalX program을 이용해서 수행하였다.
유사체 디자인
유사체 디자인을 위해서 2차 구조예측 프로그램을 사용해 정제 펩타이드의 2 차 구조를 예측하였으며, 예측된 2 차 구조를 바탕으로 유사체 디자인을 위한 가장 이상적인 부위를 선택하였다. 모체 펩타이드(Parent peptide)로 선택된 부분의 구조적 특성을 확인하고 C-말단의 아미드화(amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법으로 유사체를 디자인하였다.
항균
펩타이드의
합성 및 정제
디자인된 펩타이드는 펩트론 (주)(대전)으로부터 순도 95 %이상으로 합성 및 정제되어 공급되었다. 유사체들은 펩타이드 합성기 ASP48S(펩트론, 대전 한국)를 사용한 F-moc 고상합상법에 의해서 합성되었고, Shiseido Capcell-Pak C18 column(250 mm × 4.6 mm, 10 μm)을 이용한 RP-HPLC로 정제되었다. 정제 조건은 0.1%(v/v) trifluoroacetic acid를 포함하는 H2O-CH3CN의 용매시스템으로 3-40 %의 농도구배조건에서 220 nm에서 유속 1 mL/min으로 수행되었다. 정제된 펩타이드의 분자량 측정은 liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS; HP1100 series; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 정제된 펩타이드들은 0.01 % 초산에 1000 ug/mL의 농도로 녹여져서 이후의 실험에 사용되었다.
세균의 내막 투과성(
Cytoplasmic
membrane
permeabilization
) 측정
세균의 내막 투과성 측정은 nonmembrane permeative chromogenic substrate인 O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 사용해서 E. coli ML35p의 세포질에 존재하는 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)의 활성을 측정함으로써 수행되었다. 배양된 Mid-logarithmic phase의 E. coli ML35p를 10 mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer)(pH7.4)로 세척한 후에 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 버퍼에 용해시켰다. 그 후, 측정할 펩타이드를 첨가한 뒤 유출된 E. coli ML35p의 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)에 의한 ONPG의 O-nitrophenol로의 가수분해 정도를 405 nm에서 측정함으로써 수행되었다. Piscidin1과 0.01 % 초산은 각각 대조군으로서 사용되었다.
DNA
-
Binding
assay
펩타이드의 DNA-binding assay는 DNA와 펩타이드의 배양 후 아가로스 젤 전기영동(agarose-gel electrophoresis)에서 DNA 이동을 저해하는 정도로서 확인하였다. 이를 위해서 1 Kb DNA 마커, λ-Hind III-digested DNA(50 ng)(Roche, Basel, Switzerland)와 각 펩타이드(1 ug)를 혼합해서 37 ℃에서 30 분 반응시킨 후 0.5 μg/mL ethidium bromide(EtBr)를 포함하는 1.0 % 아가로스 젤에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
실험예
<
실험예
1: 항균
펩타이드의
정제 및 특성화>
1) 아가미 추출물의 항균활성
낙지 아가미 추출물의 항균활성과 단백질성 항균물질의 존재를 확인하기 위해서 아가미 추출물들의 트립신(trypsin) 처리 전후의 항균활성을 E. coil D31와 B. subtilis KCTC1021에 대해서 URDA 법을 사용하여 측정하였다(도 1). 도 1에서 Before는 트립신(trypsin) 처리 전의 추출물의 항균활성이고, after는 트립신(trypsin) 처리 후의 추출물들의 항균활성이다. 그 결과 아가미 추출물은 두 균주에 대해서 강한 항균활성을 나타내었고, 트립신(trypsin) 처리 후에는 이러한 항균활성이 거의 소실되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 낙지 아가미 추출물은 단백질성 항균물질을 함유하고 있다는 것을 의미하는 것이다. 따라서 아가미 추출물에 존재하는 항균 펩타이드의 정제를 위한 실험을 수행하였다.
2) Continuous AU-PAGE
아가미 추출물을 Bio-rad Prep-cell 491에 도입을 시켜서 조정제 과정을 수행하였다. 그 결과, 분취된 분획 #37부터 항균활성을 나타내기 시작해서 분획 #103까지의 넓은 범위에 걸쳐서 활성을 나타내었으며, 특히 분획 #43~#63에서 강한 활성을 나타내었다(도 2A). 이러한 결과는 낙지 아가미 추출물에는 다양한 분자량과 net-charge를 가진 항균물질이 존재하고 있음을 의미하는 것이다 (도 2B). 도 2는 이러한 Prep-cell pooled #의 E. coli D31에 대한 항균활성 및 활성 분포도이다. 이러한 도 2A는 각 prep-cell#들을 농축시킨 후에 0.01 % HAc에 녹여서URDA법을 사용해서 E. coli D31에 대해 항균활성을 측정하였다. 또한 도 2B는 각 분획들의 URDA 결과로 얻어진 clearing zone diameter를 나타낸 그래프이다. 항균물질 정제를 위해서 역상 HPLC에 도입한 분획은 빨간색 막대로 나타내었다.
또한 항균활성 펩타이드의 분리를 위해서 저분자 물질을 포함하는 분획선택과 원활한 정제과정 수행을 위해서 활성 분획들을 acid-urea PAGE에 도입시켜 각 분획들의 분자량을 확인하였다(도 3). 그 결과 prep-cell 분획 #43~53까지는 약 6.5 kDa이하의 분자량에 해당하는 band를 포함하고 있었으며 #57~63까지는 ~11 kDa 이상의 분자량을 가지는 것으로 나타났다. 도 3은 낙지 아가미 추출물들의 활성 prep-cell #들의 AU-PAGE이며, 20 uL의 prep-cell #33~65(A)과 prep-cell #69~97(B)를 2x sample buffer 혼합한 후에 전기영동을 수행하였다. Marker로는 human histone H1(~21 kDa) 1 ug, lysozyme(~11 kDa, 2 ug), aprotinin(~6.5 kDa, 3 ug) 및 synthetic peptide Cg3(~1.4 kDa, 1 ug)을 사용하였다.
3) HPLC purification
낙지 아가미 추출물의 prep-cell 활성 분획인 #53을 역상 HPLC에 도입시켜 항균활성 펩타이드의 정제과정을 수행하였다(도 4). 그 결과 아가미 추출물의 역상 HPLC에서 활성이 확인된 2 개의 피크와 유사한 retention time(32 %와 34 %의 아세토니트릴의 농도)을 가지는 2 개의 활성 피크가 prep-cell #53에 포함되어 있는 것이 확인되었고, 각각의 활성 피크의 최종 정제과정을 동일한 정제조건을 사용해서 수행하였다(도 4B와 도 4C). 그 결과 2 개의 항균활성 물질(Ov1 1, 2로 명명)을 최종 정제하였다. 2 개의 정제된 항균 물질은 분자량 측정과 edman degradation법을 통해서 일차구조 분석을 진행하였다.
4) Peptide identification
낙지 아가미 추출물의 prep-cell 활성 분획인 #53의 역상 HPLC에서 최종 정제된 두 개의 항균 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF/TOF™™ 5800 system(AB SCIEX)을 이용하여 측정하였다. 분자량 측정 결과, 정제된 펩타이드 1과 2의 분자량은 각각 1211.29 Da과 2502.24 Da인 것으로 확인되었다(도 5A, B).
낙지 아가미 추출물에서 최종 정제된 두 항균 펩타이드의 펩타이드 시퀀싱은 PROCISE 491 HT protein sequencer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행되었다. 그 결과 펩타이드 1과 2는 각각 11개와 24개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 밝혀졌다(도 5C, D). 일차구조 분석 자료의 정확성을 확인하기 위해서 실제의 분자량 측정으로 얻어진 각 펩타이드의 실험치 분자량(1211.59 Da과 2502.24 Da)들과 edman degradation으로 확인된 각 펩타이드의 구성 아미노산을 토대로 계산된 이론치 분자량(1211 Da과 2502 Da)들을 비교한 결과 두 가지의 분자량들이 정확히 일치하는 것으로 확인되었다.
5) 정제된 펩타이드들의 이차구조 예측
정제된 펩타이드의 2차 구조예측은 EMBOSS GUI의 garnier method를 사용하여 수행되었다. 그 결과 Ov 1은 β-쉬트(β-sheet) 구조와 turn구조가 섞여 있는 혼합구조를 이루고 있는 것으로 예측되었다(도 6A). 반면 Ov 2는 α-헬릭스(α-helix)를 주요 구조로 β-쉬트(β-sheet) 구조와 turn 구조가 약간 섞여 있는 2차 구조를 가지는 것으로 나타났다(도 6B).
6) 정제한 펩타이드들의 sequence alignment
정제된 펩타이드들의 상동성 확인은 Genome Net의 BLASTP 2.2.10와 TBLASTN 2.2.10을 이용해서 수행되었다. 그 결과 Ov 1(서열번호 4)은 다양한 생물에 공통적으로 존재하는 histone H4의 C-말단 부분과 완전하게 상동성을 나타내었고, Ov 2(서열번호 5)도 역시 다양한 생물의 histone H2B의 N-말단 부분과 완벽하게 상동성을 나타내었다(도 7A, B). 이러한 결과는 정제된 펩타이드들은 낙지에 존재하는 히스톤(histone) 단백질에서 유래된 단편(fragment)들로 예측되며, 히스톤(histone) 단백질이 선천면역에도 관계되어 있음을 의미하는 것이다.
<
실험예
2:
해양무척추동물인
낙지 유래 항균
펩타이드의
유사체 개발>
1) 정제 펩타이드 (Ov 1 & Ov 2)의 항균활성
정제된 펩타이드들의 항균활성을 측정하기 위해서 확인된 아미노산 서열에 따라서 펩타이드를 고상합성법으로 합성을 하였으며 합성된 펩타이드를 이용해 항균활성을 측정하였다(도 8). 그 결과 합성된 펩타이드들은 약한 항균활성을 나타내었다. 이러한 결과는 아마도 펩타이드들의 천연의 form과 합성된 form에서의 구조적 차이나 이들이 존재하는 생체내(in vivo)의 환경과 생체외(in vitro) 환경의 차이에서 기인된 결과인 것으로 판단된다. 따라서 Ov 1(서열번호 4)과 Ov 2(서열번호 5)의 활성 개선과 안정도 증대를 위해서 이들 펩타이드의 일차구조를 주형으로 사용해서 단편화된 길이를 가진 활성이 증가된 선도 펩타이드를 선별하기 위해서 유사체를 디자인하였다.
2) Ov 1, 2 유래의 유사체 디자인
Ov 1과 Ov 2의 일차구조를 바탕으로 디자인된 유사체들에 대한 서열정보는 표 1에 나타내었다. Ov 1의 유사체들은 11개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 분자 내에 Gly 잔기 또는 Gln 잔기를 다른 아미노산으로 치환하고, C-말단을 아미드(amide)화 시키는 방법으로 유사체를 디자인하였다. Ov 2의 유사체도 모체인 Ov 2의 2차 구조 예측 결과에서 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취하는 부분을 우선적으로 선택하여 아미노산 치환법과 C-말단의 아미드(amide)화를 통해서 유사체를 디자인 하였다. 또한 N-말단 부분의 선택을 통해서 Ov 2의 길이의 단편화를 목적으로 디자인 되었다.
<
실험예
3:
Ov
1과
Ov
2의 유사체들의 항균활성>
Ov 1(서열번호 4)과 Ov 2(서열번호 5)의 유사체들과 대조군으로 piscidin 1(미국산 잡종 농어에서 유래된 항균 펩타이드)을 7종의 세균과 1종의 yeast(C. albicans)에 대해서 항균활성을 URDA법을 사용해서 측정하였다 (도 9, 표 2). 항균활성 측정 결과, 3 가지의 유사체들은 강한 항균활성을 나타내었다. 특히, Ov1-1(서열번호 1)과 Ov1-2(서열번호 2)는 측정에 사용된 모든 균주에 대해서 piscidin 1의 활성과 유사하거나 강한 항균활성을 나타내었다. 흥미로운 결과는 대조군으로 사용된 piscidin 1은 C. albicans에 대해서 약한 활성을 나타내었으나 Ov1-1과 Ov1-2는 C. albicans에 대해서도 강한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Ov 1과 Ov 2의 약한 활성이 유사체 디자인을 통해 길이의 단편화와 활성의 증대라는 개선된 결과를 나타내는 선도물질 개발의 모체(parent)로서 활용 될 수 있으며 새로운 항균 펩타이드의 개발도 가능하다는 것을 의미하는 것이다.
<
실험예
4:
Ov
1과
Ov
2의 유사체들의
용혈활성
측정>
유사체들의 독성을 확인하기 위해서 유사체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1의 사람의 적혈구(혈액형 B형)에 대한 용혈활성을 측정하였다(도 10). 그 결과, Ov 1-2가 약간 용혈활성을 보였지만 나머지 유사체들은 사람의 적혈구에 대해서 용혈활성을 거의 나타내지 않았으나, 대조군으로 사용된 piscidin 1은 12.5 μg/mL의 농도부터 강한 용혈활성을 나타내기 시작하였다. 이러한 결과는 강력한 용혈활성을 가진 piscidin 1과는 대조적으로 Ov 1-1(서열번호 1), Ov 1-2(서열번호 2) 및 Ov 2-2(서열번호 3) 유사체들은 유의한 항균활성을 나타내는 농도보다도 훨씬 높은 농도에서 사람의 적혈구에 대해서 독성이 없음을 나타내는 것이다. 따라서 강한 항균활성을 나타내는 위의 3 가지의 유사체들은 새로운 항균 펩타이드의 개발에 활용될 수 있음을 의미하는 것이다.
<
실험예
5:
Cytoplasmic
membrane
permeabilization
측정>
Ov 1과 Ov 2 유사체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1의 bacteria membrane에 대한 투과성을 확인하기 위해서 E. coli ML35p에 대한 내막투과성을 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 막 투과성 측정결과, 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidn 1은 강한 세균의 내막 투과성을 나타내었고, Ov 1과 Ov 2 유사체들 중에서는 Ov 2-2만이 강한 막 투과성을 나타내었고 다른 유사체들은 막 투과성을 거의 나타내지 않았다(도 11). 이러한 결과는 Ov 2-2는 세균의 막을 직접 공격하는 방법으로 항균활성을 나타낼 가능성을 의미하는 것이며, Ov 1-1과 Ov 1-2는 막을 직접적으로 공격하기보다는 간접적인 작용에 의해서 항균작용을 나타낼 가능성이 있음을 의미하는 것이다.
<
실험예
6:
DNA
-
binding
assay
>
Ov 1과 Ov 2 유사체들의 DNA와의 결합력은 electrophoretic mobility shift assay(EMSA)법을 이용하여 측정하였다(도 12). 그 결과, 대조군으로 사용된 piscidin 1은 DNA의 전기적 이동을 완전히 저해하였으며, 유사체 중에서는 Ov 1-1 및 Ov 1-2와 Ov 2-2가 DNA의 전기적 이동을 완전히 저해하였다. 반면 다른 유사체들은 DNA의 전기적 이동에는 영향을 주지 않았다. 이러한 DNA-binding assay 결과와 막 투과성을 비교해 보면 항균활성을 나타내는 유사체들 중에서 Ov 1-1과 Ov 1-2는 세균의 intracellular target site를 공격대상으로 해서 항균활성을 나타내는 것으로 판단되며, Ov 2-2는 세포막을 직접 공격하는 작용기작을 가진 것으로 판단된다. 이러한 유사체들의 예상 작용기작에 대한 자료들은 새로운 펩타이드 선도물질을 개발하는 데 중요한 기초자료로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
<결과>
본 발명자들은 낙지의 아가미로부터 2 개의 항균 펩타이드(Ov1, Ov2)를 정제하였고, 일차구조를 규명한 결과, 2 개의 펩타이드들은 히스톤(histone) H4의 C-말단 부분 및 히스톤(histone) H2B의 N-말단 부분과 완전하게 상동성을 나타내었다. 두 펩타이드는 용혈활성은 전혀 없으면서 Gram-(+)와 (-) 박테리아에 대해 항균활성을 나타내었다. 또한 두 펩타이드를 모체로하여 짧은 길이의 활성이 개선된 항균 펩타이드를 선별하기 위해서 6개의 유사체를 디자인하고 고상합성법으로 합성하였다. 유사체들은 Ov1과 Ov2의 일차구조를 토대로 아미노산 치환 및 C-말단을 amide화하는 방법으로 디자인되었다. 유효 유사체를 선별하기 위해서 다양한 활성측정을 수행하였으며, 그 결과 3개의 유효 유사체 (Ov1-1, Ov1-2, Ov2-2)를 선발하였다. Ov 2-2는 세균의 막을 직접 공격하는 기작으로 항균활성을 나타내는 것으로 예측되며, Ov 1-1과 Ov 1-2는 막을 직접적으로 공격하기보다는 intracellular target site를 공격대상으로 하는 간접적인 기작에 의해서 항균작용을 나타내는 것으로 예측되었다.
결국, 본 발명을 통해서 낙지 아가미에서 2개의 항균 펩타이드 (Ov1과 Ov2)를 정제하였고, 이들을 parent peptide로 해서 활성이 개선된 단편의 유사체를 디자인 및 선별하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Kunsan National University
<120> Antimicrobial peptide derived from Octopus variabilis and
antimicrobial pharmaceutical composition containing the same
<130> HPC-6216
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Octopus variabilis
<400> 1
Arg Gln Leu Arg Thr Leu Tyr Arg Phe Leu Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Octopus variabilis
<400> 2
Arg Leu Leu Arg Thr Leu Tyr Arg Phe Leu Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Octopus variabilis
<400> 3
Leu Ala Lys His Ala Val Lys Lys Ala Leu Lys Ala Val
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Octopus variabilis
<400> 4
Arg Gln Gly Arg Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Octopus variabilis
<400> 5
Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys Ala
1 5 10 15
Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys
20
Claims (12)
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드로서,
상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 이 콜라이(E. coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드. .
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 항균 펩타이드는 C-말단에 아미노기(-NH2)가 결합하는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
- 삭제
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는,
바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ), 이 콜라이( E. coli ) 및 살모넬라 엔테리카( Salmonella enterica )로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주에 대한 항균용 약학 조성물.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 항균 펩타이드는 C-말단에 아미노기(-NH2)가 결합하는 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
- 삭제
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 낙지로부터 유래된 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 장티푸스 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150118069A KR101764852B1 (ko) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150118069A KR101764852B1 (ko) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160137475A Division KR101723949B1 (ko) | 2016-10-21 | 2016-10-21 | 낙지 유래 항균 펩타이드 유사체 Ｏｖ２２ 및 이를 포함하는 항균제 조성물 |
| KR1020160137473A Division KR101720539B1 (ko) | 2016-10-21 | 2016-10-21 | 낙지 유래 항균 펩타이드 유사체 Ｏｖ１１，Ｏｖ１２ 및 이를 포함하는 항균제 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170022723A KR20170022723A (ko) | 2017-03-02 |
| KR101764852B1 true KR101764852B1 (ko) | 2017-08-03 |
Family
ID=58426934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150118069A KR101764852B1 (ko) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101764852B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200125452A (ko) * | 2019-04-25 | 2020-11-04 | 한국화학연구원 | 세파로토신을 유효성분으로 포함하는 인지 기능 장애 및 스트레스성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200047329A (ko) * | 2018-10-26 | 2020-05-07 | 국립해양생물자원관 | 옥토미닌 또는 이의 단편, 및 이를 포함하는 항균 조성물 |
| KR102324208B1 (ko) * | 2019-10-14 | 2021-11-10 | 국립해양생물자원관 | 낙지 유래 생체방어 펩타이드를 함유하는 스트렙토코코스에 대한 항균조성물 |
| KR102363854B1 (ko) * | 2020-01-22 | 2022-02-17 | 국립해양생물자원관 | 낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물 |
| KR102632736B1 (ko) * | 2021-04-26 | 2024-02-01 | 국립해양생물자원관 | 낙지 유래 신규한 항균 펩타이드 및 이의 용도 |
| CN115894661B (zh) * | 2022-08-11 | 2024-05-28 | 电子科技大学 | 一种抗菌肽及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101374267B1 (ko) | 2012-03-06 | 2014-03-13 | 조선대학교산학협력단 | 전복으로부터 분리된 신규한 항생 펩타이드 및 이의 용도 |
-
2015
- 2015-08-21 KR KR1020150118069A patent/KR101764852B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Hong S.W., et al, Molecular Oral Microbiology 29:pp.208-218 (2014.).* |
| Sheila Castellanos-Martínez 등. PLOS one. Vol. 9, No. 10, 페이지 e107879 (2014.) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200125452A (ko) * | 2019-04-25 | 2020-11-04 | 한국화학연구원 | 세파로토신을 유효성분으로 포함하는 인지 기능 장애 및 스트레스성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
| KR102239947B1 (ko) | 2019-04-25 | 2021-04-14 | 한국화학연구원 | 세파로토신을 유효성분으로 포함하는 인지 기능 장애 및 스트레스성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170022723A (ko) | 2017-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101764852B1 (ko) | 낙지에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 | |
| Noga et al. | Piscidin 4, a novel member of the piscidin family of antimicrobial peptides | |
| Leippe et al. | Amoebapores, a family of membranolytic peptides from cytoplasmic granules of Entamoeba histolytica: isolation, primary structure, and pore bacterial cytoplasmic membranes | |
| Boman et al. | Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids | |
| Gibson et al. | Bombinin-like peptides with antimicrobial activity from skin secretions of the Asian toad, Bombina orientalis. | |
| Lai et al. | Antimicrobial peptides from skin secretions of Chinese red belly toad Bombina maxima | |
| Ramírez-Carreto et al. | Peptides from the scorpion Vaejovis punctatus with broad antimicrobial activity | |
| Monincová et al. | Novel antimicrobial peptides from the venom of the eusocial bee Halictus sexcinctus (Hymenoptera: Halictidae) and their analogs | |
| Hou et al. | Isolation and characterisation of a new antimicrobial peptide from the skin of Xenopus laevis | |
| Li et al. | A novel antimicrobial peptide from skin secretions of the earthworm, Pheretima guillelmi (Michaelsen) | |
| McDonald et al. | Structure–function relationships in histidine-rich antimicrobial peptides from Atlantic cod | |
| Sousa et al. | Leptoglycin: a new Glycine/Leucine-rich antimicrobial peptide isolated from the skin secretion of the South American frog Leptodactylus pentadactylus (Leptodactylidae) | |
| KR101668229B1 (ko) | 참굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 | |
| Yu et al. | A novel antimicrobial peptide from salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis | |
| Monincová et al. | Lasiocepsin, a novel cyclic antimicrobial peptide from the venom of eusocial bee Lasioglossum laticeps (Hymenoptera: Halictidae) | |
| BRPI0104510B1 (pt) | peptídeos antibióticos da família das phylloseptinas isolados da secreção da pele de phylloseptina hypocondrialis e composição antimicrobiana relacionada | |
| KR101942813B1 (ko) | 전복의 살균침투성증가단백질로부터 유래한 항균 펩타이드 및 그의 용도 | |
| Kim et al. | Purification and characterization of antimicrobial peptides from the skin secretion of Rana dybowskii | |
| Conlon et al. | A glycine-leucine-rich peptide structurally related to the plasticins from skin secretions of the frog Leptodactylus laticeps (Leptodactylidae) | |
| Chen et al. | Kassorins: novel innate immune system peptides from skin secretions of the African hyperoliid frogs, Kassina maculata and Kassina senegalensis | |
| KR101667278B1 (ko) | 미국산 굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 | |
| KR101834884B1 (ko) | 태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도 | |
| Kim et al. | Bacterial expression of tenecin 3, an insect antifungal protein isolated from Tenebrio molitor, and its efficient purification | |
| Yu et al. | Identification, eukaryotic expression and structure & function characterizations of β-defensin like homologues from Pelodiscus sinensis | |
| Liu et al. | Purification and cloning of a novel antimicrobial peptide from salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |