KR101668229B1 - 참굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 참굴의 아가미로부터 유래하는 펩타이드인 cgMolluscidin을 가지고 유사체를 디자인한 것이며, 또한 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인 하였다. 또한 절감된 아미노산에 불구하고 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드이다. 이뿐만이 아니라 상기 항균 펩타이드는 막 투과성이 낮고, DNA 결합력이 강하거나 또는 용혈 활성도 낮다.

Description

참굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물{Antibacterial peptide derived from Crassostrea gigas and antibacterial pharmaceutical composition containing the same}

본 발명은 참굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.

항균 펩타이드가 병원균에 작용하는 기작은 기존 항생제들의 작용기전과 매우 다르다. 이들은 주로 미생물의 세포표면에 결합한 후, 세포막에 pore를 형성함으로써 세포막의 정상적 투과특성을 교란하여 병원체를 빠른 속도로 죽게 한다(Pharmacol. Rev. 55: 27-55, 2003). 또한 이들은 병원체의 내독성 인자로 인해 초래되는 패혈증을 방지할 수 있다고 알려져 있으며(Biochim. Biophys. Acta. 1562: 32-36, 2002), 고등동물체내에서 후천성면역반응을 매개하는 신호분자로서도 작용한다고 보고되었다(J. Leukoc. Biol. 60: 415-422, 1996). 이러한 특성으로 인해 항균 펩타이드는 항생제 내성균을 제어할 수 있는 신규 항생제나 새로운 생체면역활성인자로 이용할 수 있을 것으로 주목 받고 있다. 이에 그 동안 기존 항생제를 대체할 수 있는 항생물질을 찾기 위해 다양한 생물체에서 펩타이드성 항생물질이 분리되어 시험 되었다. 그러나 실제 제품화되어 사용되고 있는 사례는 극히 드문데, 이는 펩타이드 항생제가 생체내에 주입되었을 때의 안정성이나 인체에 대한 안전성의 문제가 제기되었기 때문이다.

이러한 난점을 해결하기 위해서는 항균 또는 항진균 활성을 갖는 펩타이드들의 아미노산 서열과 구조를 비교 분석하여 인체에는 위해를 가하지 않으면서 효율적으로 미생물을 사멸시킬 수 있는 구조를 알아내야 한다. 이를 위해서는 지금까지 보고된 것 이상의 다양한 항균 활성 펩타이드의 아미노산 서열과 구조에 대한 정보가 필요한 실정이다.

또한 이러한 문제 이외에도 발견되는 항균 펩타이드를 상용화하기 위해서는 펩타이드의 구조가 복잡하지 않으면서 아미노산 서열도 12-15 개를 넘지 않아 쉽게 합성이 가능하면서 항균 활성도 우수하게 유지되어야만 하지만, 이러한 구조의 항균 펩타이드를 발견하기 위한 노력은 많이 부족한 실정이다.

한편, cgMolluscidin은 참굴(태평양 굴, Crassostrea gigas)의 아가미에서 정제된 5568.7 Da의 분자량을 가진 55개의 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드로서 용혈활성은 전혀 없으면서 Gram-(+)와 (-) bacteria에 대해서 강한 항균활성을 보이지만 C. albicans에는 활성을 나타내지 않는 항균 펩타이드이다. 이러한 cgMolluscidin이 가진 활성의 제한성과 55개의 아미노산으로 구성된 길이의 한계성을 극복하기 위해 단편화된 길이의 활성이 증가된 유도체를 디자인하고 새로운 항균 펩타이드의 개발이 절실하다. 최근의 연구에서는 굴과 홍합의 아가미 및 외투막에는 외부 감염원에 대한 효율적인 방어 기작의 하나로서 항균활성 펩타이드가 중요한 역할을 담당한다는 것이 보고가 되고 있다. 이러한 결과에 불구하고 외부 환경에 대한 일차 방어 역할을 담당하는 아가미와 외투막은 굴과 같은 쌍각류의 면역 기작에서 중요한 역할을 담당하는 기관으로서, 선천 면역의 기능을 수행하는 항균활성 물질의 탐색 및 정제에 대한 연구에 중요한 대상이 됨을 의미하는 것이지만, 이를 주요 대상으로 하여 신규 항균 펩타이드를 개발하려는 노력은 많이 부족한 실정이다.

본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1374267호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1은 신규한 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 전복으로부터 분리된 항생 펩타이드에 관한 것으로서 대장균 또는 황색포도상구균에 대하여 항균 활성이 뛰어난 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 특허문헌 1에서는 전복에서 분리한 항균용 펩타이드에 관한 내용만이 개시되어 있을 뿐, 미국산 굴로부터 정제되는 펩타이드(AOD)로부터 유래되는 항균 펩타이드에 관하여는 어떠한 개시 또는 암시조차 되어 있지 않다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-1374267호

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 참굴(태평양 굴, Crassostrea gigas)로부터 유래하며 항균 활성이 우수한 펩타이드인 cgMolluscidin을 가지고 상용화가 가능할 정도로 아미노산의 수를 절감하면서 항균 활성도 우수한 항균 펩타이드 유사체(analogue)를 디자인하여 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin의 유사체인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균용 약학 조성물은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하며, 상기 항균 펩타이드는 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin의 유사체인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 참굴의 아가미로부터 유래하는 펩타이드인 cgMolluscidin을 가지고 유사체를 디자인한 것이며, 또한 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인 하였다. 또한 절감된 아미노산에 불구하고 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드이다. 이뿐만이 아니라 상기 항균 펩타이드는 막 투과성이 낮고, DNA 결합력이 강하거나 또는 용혈 활성도 낮다.

도 1은 cgMolluscidin의 2차 구조의 예측 결과이다.
도 2는 cgMolluscidin의 모체 펩타이드 및 유사체들의 N-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취함을 보여주는 것이다.
도 3은 cgMolluscidin 유사체들의 항균 활성을 보여주는 것이다.
도 4는 cgMolluscidin 유사체와 piscidin 1의 인간 적혈구에 대한 용혈활성 측정 결과를 보여주는 것이다.
도 5는 cgMolluscidin 유도체와 amphotericin B의 E. coli ML35p에 대한 내막투과성 측정 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 cgMolluscidin 유도체들의 DNA 결합력(DNA-Binding ability) 측정 결과를 보여주는 것이다.
도 7은 cgMolluscidin 유도체인 cgA3의 3가지 셀 라인(cell line)에 대한 항암활성 측정 결과를 보여주는 것이다.

이에 본 발명자들은 참굴에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하면서 상용화가 가능한 cgMolluscidin의 유사체인 항균용 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 항균용 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin의 유사체인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 참굴(태평양 굴, Crassostrea gigas)의 아가미로부터 항균 활성이 우수한 펩타이드(cgMolluscidin)로부터 유래한 것인데, 상기 참굴로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin는 참굴의 아가미에서 발견되었으며, 항균력이 우수한 펩타이드이다. 하지만, 상기 cgMolluscidin는 총 55개의 아미노산으로 이루어져 있기 때문에 상용화가 어렵다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 참굴로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하게 유지되면서 상용화도 가능한 항균 펩타이드를 개발한 것이다.

상기 항균 펩타이드는 N-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조일 수 있다. 이렇게 α-헬릭스(α-helix) 구조인 경우에는 친수성과 소수성을 동시에 가지는 양친매성이 나타나게 된다. 그리하여 친수성을 띄는 부분에서는 결합력이 우수하게 되고, 소수성을 띄는 부위에서는 침투성이 우수하게 된다. 또한 상기 항균 펩타이드는 C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합하는 것일 수 있다. 본 발명자들은 유사체 디자인을 위해서 2차 구조예측 프로그램을 사용해서 cgMolluscidin의 2차 구조를 예측하였다. 예측된 cgMolluscidin의 2차 구조는 random coli 구조와 α-헬릭스(α-helix) 구조 및 β-쉬트(β-sheet) 구조가 혼합된 구조로 나타났다. 예측된 2차 구조를 바탕으로 항균활성을 나타내는데 가장 이상적인 구조로 알려져 있는 양친매성 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취하는 부분을 우선적으로 cgMolluscidin에서 선택하였다. 이러한 조건에서 cgMolluscidin의 N-말단 부분을 유사체 디자인을 위한 모체 펩타이드(parent peptide) 부분으로 선택을 하였다. 선택된 N-말단 부분의 구조적 특성은 양친매성의 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취하며, 이 부분을 모체 펩타이드로 하여서 C-말단의 아미드화(amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법으로 본 발명에 따른 2 개의 유사체(서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드)를 디자인하였다.

이렇게 디자인된 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수하면서, 상용화가 가능한 것이다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 내막 투과성이 약하다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 용혈활성을 보이지 않아 세포 독성의 문제도 없는 항균용 펩타이드일 수 있거나, 또는 DNA 결합력이 강하여 막을 직접 공격하기 보다는 막 내에서 DNA에 결합하여 항균 활성을 나타낼 수 있다. 즉, 목적(target)이 되는 DNA에 결합하여 전사와 번역을 방해함으로써 항균 활성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 항균 펩타이드는 B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans, A. hydrophila. E. coli, S.enterica, S. flexneri, S. sonnei, P. aeruginosa 및 C. albicans로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 상기 항균 펩타이드의 N-말단에는 α-헬릭스(α-helix) 구조인 경우에는 양친매성을 나타내게 되며, 이로 인해 친수성 부위에서 세포막 또는 DNA와의 결합이 용이하게 되며, 소수성 부위로 인해 침투력이 용이하게 된다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 상기 항균 펩타이드의 C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합하는 경우에는 프로테아제(protease)에 대한 저항성 향상과 positive net-charge를 향상시키는 효과가 보다 향상될 수 있다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 바람직한 일실시예로서 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 α-헬릭스(α-helix) 구조이면서, C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합한 경우의 효과를 보다 구체적으로 살펴보면 용혈활성이 전혀 나타내지 않으면서 막 투과성도 높지 않았다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 바람직한 일실시예에 해당하는 것으로서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 α-헬릭스(α-helix) 구조이면서, C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합한 경우의 효과를 보다 구체적으로 살펴보면 막 투과성이 높지 않으면서 DNA 결합력이 강하기 때문에 세균의 막을 직접적으로 공격하기 보다는 세포 내로 침투한 후에 세포 내 물질(예: DNA)에 결합을 하거나 또 다른 간접적인 방법(예: DNA 또는 mRMA에 결합하여 전사와 번역을 방해함)으로 항균 작용을 달성하게 됨을 의미할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균용 약학 조성물은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하며,

상기 항균 펩타이드는 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin의 유사체인 것을 특징으로 한다.

이러한 본 발명에 따른 상기 항균용 약학 조성물은 본 발명의 또 다른 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유함으로써, 항균 활성의 약리효과를 달성하게 된다.

상기 항균 펩타이드는 참굴(태평양 굴, Crassostrea gigas)의 아기미에서 발견된 펩타이드(cgMolluscidin)로부터 유래한 것으로서, 상기 항균 펩타이드는 N-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조일 수 있다. 또한 상기 항균 펩타이드의 C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합하는 것일 수 있다.

참굴(태평양 굴, Crassostrea gigas)의 아가미로부터 항균 활성이 우수한 펩타이드(cgMolluscidin)로부터 유래한 것인데, 상기 참굴로부터 유래한 펩타이드인 cgMolluscidin는 참굴의 아가미에서 발견되었으며, 항균력이 우수한 펩타이드이다.

또한 상기 항균 펩타이드는 B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans, A. hydrophila. E. coli, S.enterica, S. flexneri, S. sonnei, P. aeruginosa 및 C. albicans로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

한편, 상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.

또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드는 항균 활성을 보이는 B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans, A. hydrophila. E. coli, S.enterica, S. flexneri, S. sonnei, P. aeruginosa 또는 C. albicans로부터 대표적으로 유발되는 질병인 식중독, 칸디다즘, 장티푸스, 콜레라 등의 질병을 예방 또는 치료하는 것이 가능하기 때문에 이러한 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하여 상기 질병들의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드 중 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드는 항암 효과가 있기 때문에 이를 유효성분으로 함유하여 항암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<재료 및 방법>

시약 및 재료

항균활성 측정을 위한 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, TSB)와 아가로스 타입 I(Low EEO Agar)는 Merck사 (Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 합성물의 정제과정에서 사용된 HPLC용 물과 아세토니트릴(CH₃CN)은 Tedia사(Ohio, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.

항균 펩타이드의 디자인

cgMolluscidin의 유사체 디자인을 위해서 2차 구조예측 프로그램을 사용해 cgMolluscidin의 2차 구조를 예측하였다. 예측된 2차 구조를 바탕으로 유사체 디자인을 위한 가장 이상적인 부위를 선택하였다. 모체 펩타이드(Parent template)로 선택된 부분의 구조적 특성을 확인하고 C-말단의 아미드화(amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법으로 유사체를 디자인하였다

항균 펩타이드의 합성 및 정제

디자인된 펩타이드는 펩트론(주)(대전)으로부터 순도 95 % 이상으로 합성 및 정제되어 공급되었다. 유사체들은 펩타이드 합성기 ASP48S(펩트론, 대전 한국)를 사용한 F-moc 고상합상법에 의해서 합성되었고, Shiseido Capcell-Pak C18 column(250 mm × 4.6 mm, 10 μm)을 이용한 RP-HPLC로 정제되었다. 정제 조건은 0.1%(v/v)trifluoro aceticacid를 포함하는 H2O-CH3CN의 용매시스템으로 3-40 %의 농도구배조건으로 220 nm에서 유속 1 mL/min으로 수행되었다. 정제된 펩타이드의 분자량 측정은 liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS; HP1100 series; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 정제된 펩타이드들은 0.01 % 초산에 1000 ug/mL의 농도로 녹여져서 이후의 실험에 사용되었다.

항균활성측정방법 및 사용균주

실험에 사용된 균주는 그람 양성균 3종(B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans), 그람 음성균 6종(E. coli D31, A. hydrophila, E. coli ML35p, S. enterica, Shigella sonnei, P aeruginosa) 및 yeast 1종(Candida albicans)을 사용하였다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay(URDA)법을 이용하였다. URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양 온도에서 18 시간 동안 프리컬쳐 후 컬러미터(ProductNo.52- 1210, BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도를 84%T(≒ 1 x 108 CFU/mL)가 되도록 맞추었다. 그 후, 9.5 mL의 0.03 % TSB, 1 % TypeⅠ agarose 및 10 mM 포스페이트 버퍼(PB)(pH 6.5)를 포함하는 언더레이 젤에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 mL을 넣고 잘 섞은 후에 plate에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 플레이트에 펀치를 사용하여 직경 2.5 mm의 well을 뚫은 후에 5 μL의 펩타이드 용액(1000 ug/mL in 0.01 % HAc)을 도입시켰다. 모든 샘플은 0.01 % 아세틱산 5 μl를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다. 펩타이드가 배지에 스며들면 3 시간 동안 1 차 배양한 후, 그 위에 10 mL의 6 % TSB, 1 % 타입 Ⅰ 아가로스 및 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)를 포함하는 오버레이 젤을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18 시간 동안 2 차 배양하였다. 다음날 웰 주위에 생긴 클리어링 존(clearing zone)의 크기를 측정하여 항균 활성을 확인하였다. 대조군으로는 미국산 잡종 농어의 비만세포에서 유래한 항균 펩타이드로서 항균력은 우수하나 용혈활성이 강력한 piscidin 1을 사용하였다

용혈활성 ( Hemolysis ) 측정

인간의 적혈구를 이용하여 용혈활성을 측정하였다. 사람의 혈액에 동량의 포스페이트 버퍼 살린(phosphate buffered saline, PBS, 50 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 넣고 혼합한 후 8000 x g, 4 ℃, 1 분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이러한 세척과정을 3 회 반복한 후 얻어진 적혈구를 3 % 헤마토크리트(hematocrit)이 되도록 PBS를 첨가하였다. 용혈활성을 측정하기 위해서 3 % 헤마토크리트(hematocrit) 90 μL를 e- 튜브(tube)에 도입시키고 10 μL의 각 농도의 펩타이드 용액을 첨가하였다. 각각의 e-튜브(tube)를 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 4 ℃에서 10 분간 13,000 x g로 원심분리를 하였다. 얻어진 각각의 상층액에서 70 μL를 취해서 96-웰 마이크로티터 플레이트(well microtiter plate)로 옮긴 후 405 nm에서 헤모글로빈 유출 정도를 측정하였다. 적혈구의 100 % 용혈을 위한 실험 대조구로는 트리톤(triton) X-100(0.1 %)을 사용하였으며, 다음 식을 사용하여 용혈활성 정도를 계산하였다.

% Hemolysis = [(Abs 405 nm in the peptide solution - Abs 405 nm in buffer) / (Abs 405nm in 0.1 % Triton X-100 - Abs 405 nm in buffer)] x 100

세균의 내막 투과성( Cytoplasmic membrane permeabilization ) 측정

세균의 내막 투과성 측정은 nonmembrane permeative chromogenic substrate인 O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 사용해서 E. coli ML35p에 세포질에 존재하는 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)의 활성을 측정함으로써 수행되었다. 배양된 Midlogarithmic phase의 E. coli ML35p를 10 mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer)(pH7.4)로 세척한 후에 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 버퍼에 용해시켰다. 그 후, 측정할 펩타이드를 첨가한 뒤 유출된 E. coli ML35p의 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)에 의한 ONPG의 O-nitrophenol로의 가수분해 정도를 420 nm에서 측정함으로써 수행되었다. Amphotericin B와 0.01 % 초산은 각각 대조군으로서 사용되었다.

DNA - Binding assay

펩타이드의 DNA-binding assay는 DNA와 펩타이드의 배양 후 아가로스 젤 전기영동(agarose-gel electrophoresis)에서 DNA 이동을 저해하는 정도로서 확인하였다. 이를 위해서 1 Kb DNA 마커, λ-Hind III-digested DNA(50 ng)(Roche, Basel, Switzerland)와 각 펩타이드(1 ug)를 혼합해서 37 ℃에서 30 분 반응시킨 후 0.5 μg/mL ethidium bromide(EtBr)를 포함하는 1.0 % 아가로스 젤에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.

항암활성 측정

항암활성은 3 개의 cell line [HUVEC (Normal), HeLa(Cervex adenocarcinoma), A549(Lung adenocarcinoma)]에 유사체를 도입 시킨 후에 시간별로 세포 활성을 공초점 현미경을 사용하여 확인하는 방법으로 측정하였다.

실험예

< 실험예 1: 디자인된 cgMolluscidin 의 유사체들>

1) cgMolluscidin

cgMolluscidin은 태평양 굴(Crassostrea gigas)의 아가미에서 정제된 5568.7 Da의 분자량을 가진 55 개의 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드로서 인간의 적혈구에 대해서는 용혈활성이 거의 없으며, Gram-(+)와 (-) 박테리아에 대해서는 강한 항균활성을 보이지만 C. albicans에는 활성을 나타내지 않는 dibasic residue repeat rich 항균 펩타이드이다. cgMolluscidin의 활성의 제한성과 55 개의 아미노산으로 구성된 길이의 한계성을 극복하기 위해서 단편화된 길이의 활성이 증가된 유사체를 디자인하고 새로운 항균 펩타이드 개발을 위한 연구를 수행하였다.

2) cgMolluscidin의 유사체들(analogs)

유사체 디자인을 위해서 2차 구조예측 프로그램을 사용해서 cgMolluscidin의 2차 구조를 예측하였다. 예측된 cgMolluscidin의 2차 구조는 random coil 구조와 α-헬릭스(α-helix) 구조 및 β-쉬트(β-sheet) 구조가 혼합된 구조로 나타났다(도 1). 예측된 2차 구조를 바탕으로 항균활성을 나타내는데 가장 이상적인 구조로 알려져 있는 양친매성 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취하는 부분을 우선적으로 cgMolluscidin에서 선택하였다. 이러한 조건에서 cgMolluscidin의 N-말단 부분을 유사체 디자인을 위한 모체 펩타이드(parent peptide) 부분으로 선택을 하였다(도 1). 도 1은 cgMolluscidin의 유사체 디자인을 위해 선택된 parent peptide를 밑줄로 표시하였다. 선택된 N-말단 부분의 구조적 특성은 양친매성의 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취하는 것으로 나타났다(도 2). 도 2의 점선은 각 유사체들의 극성부분을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 cgMolluscidin의 N-말단 부분이 유사체 디자인을 위한 적당한 부위임을 의미하는 것으로서 이 부분을 모체 펩타이드로 하여서 C-말단의 아미드화(amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법으로 2 개의 유사체(cgA2, cgA3)를 디자인하였다(표 1). 하기 표 1에서 H는 helix를 의미하는 것으로서 디자인된 항균 펩타이드는 전체적으로 helix 구조를 취하는 양상을 보여주는 것이고, 모체 펩타이드(cgA1) 및 디자인된 2 개의 유사체들은 양친매성을 나타내는 것이다.

< 실험예 2: cgMolluscidin 유사체들의 항균활성>

cgMolluscidin 유사체들과 대조군으로 piscidin 1(미국산 잡종 농어에서 유래된 항균 펩타이드)을 7종의 세균과 1종의 yeast(C. albicans)에 대해서 항균활성을 URDA법을 사용해서 측정하였다(도 3 및 표 2). 도 3은 cgMolluscidin 유사체들의 항균활성으로서, URDA법을 이용한 항균활성 측정을 위해서 5 ug의 각 펩타이드를 사용하였다. 또한 표 2는 cgMolluscidin 유사체들의 항균활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 이러한 항균활성 측정 결과, 유사체의 모체 펩타이드(parent peptide)인 cgA1은 측정에 사용된 모든 균주에 대해서 항균활성을 거의 나타내지 않았으나, 2 가지의 유사체들(cgA2와 cgA3)은 강한 항균활성을 나타내었다. 특히, cgA2(서열번호 1)와 cgA3(서열번호 2)는 piscidin 1의 활성과 유사한 활성을 나타내었다. 흥미로운 결과는 유사체들의 모체 펩타이드인 cgMolluscidin은 C. albicans에 대해서는 전혀 항균활성을 나타내지 않았으나 cgA2와 cgA3는 C. albicans에 대해서 강한 항균활성을 나타내었다. 또한 대조군으로 사용된 강한 항균활성을 지닌 펩타이드로 알려져 있는 piscidin 1도 C. albicans에 대해서는 약한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 cgA2와 cgA3는 새로운 항균 펩타이드의 개발을 위해서 활용이 가능하다는 것을 의미하는 것이다.

< 실험예 3: cgMolluscidin 유사체들의 용혈활성 >

유사체와 대조군으로 piscidin 1을 사람의 적혈구 (혈액형 B형)에 대해서 용혈활성을 측정하였다(도 4). 도 4는 cgMolluscidin의 유사체와 piscidin 1의 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 나타내는 것이며, 각각의 펩타이드는 100-3.13 ug/mL의 농도로 측정되었고, 유출된 헤모글로빈의 농도는 542 nm에서 측정하였다. 용혈활성 측정 결과, cgA1과 cgA2는 사람의 적혈구에 대해서 용혈활성을 거의 나타내지 않았으나, cgA3는 사람의 적혈구에 대해서 강한 용혈활성을 나타내었다. 대조군으로 사용된 piscidin 1도 12.5 μg/mL의 농도부터 강한 용혈활성을 나타내기 시작하였다. 이러한 결과는 cgA3는 강한 항균활성을 포함하는 반면 독성도 동시에 함유하고 있으며, cgA2는 사람의 적혈구에 대해서는 독성이 없음을 의미하는 것이다.

< 실험예 4: Cytoplasmic membrane permeabilization >

cgMolluscidin 유사체들과 대조군인 amphotericin B의 bacteria inner membrane에 대한 투과성 확인을 위해서 E. coli ML35p에 대한 내막 투과성을 확인하였다. 그 결과, amphotericin B은 강한 내막 투과성을 나타낸 것과는 달리 cgMolluscidin의 유사체들은 상대적으로 약한 막 투과성을 나타내었다(도 5). 도 5는 cgMolluscidin 유도체와 amphotericin B의 E. coli ML35p에 대한 내막 투과성이며, 내막 투과성은 impermeable, chromogenic 기질인 ONPG 가수분해물의 405 nm에서 흡광도값으로 측정하였다. 40 ug/mL의 펩타이드 농도가 측정에 사용되었다. 이러한 결과는 cgMolluscidin의 유사체들은 세균의 막을 직접적인 타겟 사이트(target site)로 인식해서 공격함으로써 항균활성을 나타내는 기작은 아님을 의미하는 것이다.

< 실험예 5: DNA - Binding assay >

cgMolluscidin의 유도체들의 DNA와의 결합력은 electrophoretic mobility shift assay(EMSA)법을 이용하여 측정하였다(도 6). 도 6은 cgMolluscidin 유도체들의 DNA 결합력(DNA-binding ability)을 측정한 결과를 나타내는 것이며, DNA는 l kb DNA ladder를 사용하였으며 측정에 사용된 펩타이드 1 ug과 혼합한 후에 37 ℃에서 30 분 반응 시킨 후에 1 % agarose gel에 도입 시켜서 전기영동을 실시하였다. 그 결과 cgA2는 DNA의 전기적 이동에는 영향을 주지 않았으나 cgA3는 DNA의 전기적 이동을 완전히 저해하였으며 항균활성이 거의 없는 cgA1도 약한 DNA 결합력(DNA-binding ability)을 나타내었다. 이러한 결과는 net-charge 또는 각 펩타이드의 구조적 특성이 DNA 결합력에 중요한 역할을 한다는 것을 의미하는 것이다.

< 실험예 6: 항암활성 측정>

3 개의 cell line에 [HUVEC (Normal), HeLa(Cervex adenocarcinoma), A549(Lung adenocarcinoma)]에 대해서 유도체들의 항암활성을 확인하였다(도 7). 도 7은 cgMolluscidin 유도체인 cgA3의 3가지 cell line에 대한 항암활성 측정한 것이며, 3가지의 cell(HUVEC, HeLa, A549)들에 대해서 유도체를 도입 시킨 후에 세포 활성(cell viability)을 확인함으로써 항암활성을 확인하였다. 그 결과 cgA3만이 유효한 항암활성을 나타내었다. 이러한 결과는 cgA3는 항생제뿐만 아니라 항암제로서 개발 가능하다는 것을 의미하는 것이다.

<결과>

본 발명자들은 새로운 항균 펩타이드를 선발하기 위해서 태평양 굴 (Crassostrea gigas)의 아가미로부터 정제된 항균 펩타이드인 cgMolluscidin을 토대로 3 개(1 개의 모체 펩타이드인 cgA1 포함)의 유사체를 디자인하고 고상합성법으로 합성하였다. 유사체들은 cgMolluscidin의 N-말단에 위치하고 있는 부위(region)을 토대로 아미노산 치환 및 C-말단을 아미드(amide)화하는 방법으로 디자인되었다. 항균활성과 용혈활성 측정 결과, cgA2와 cgA3는 강한 항균활성은 나타내었고, cgA2는 적혈구에 대한 용혈활성을 거의 나타내지 않은 반면 cgA3는 강한 용혈활성을 나타내었다. 유사체들은 세균의 내막에 대해서 약한 투과성을 나타내었으며, cgA3는 강한 DNA 결합력(DNA- binding ability)를 보였다. 이러한 결과는 두 가지 유사체는 세균의 막을 직접적으로 공격하기 보다는 세포 내로 침투한 후에 세포 내 물질(예: DNA)과 결합을 하거나 또 다른 간접적인 방법으로 항균작용을 나타낸다는 것을 의미하는 것이다. 또한, 흥미로운 것은 cgA3가 2 가지의 암세포에 대해서 강한 독성을 나타낸 다는 것이다. 이것은 cgA3가 항암제로서 연구 가능하다는 것을 나타내는 것이다. 그러므로 cgA2와 cgA3는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생제 대체제 개발이나 항암제를 위한 후보물질로서 활용 가능할 것으로 판단된다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Kunsan National University <120> Antibacterial peptide derived from Crassostrea gigas and antibacterial pharmaceutical composition containing the same <130> HPC-6215 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Crassostrea gigas <400> 1 Ala Lys Trp Ala Leu Lys Leu Ala Lys Lys Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Crassostrea gigas <400> 2 Leu Lys Trp Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu 1 5 10

Claims (13)

1. 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 cgMolluscidin의 유사체인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 항균 펩타이드는 N-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 항균 펩타이드는 C-말단에 아미노기(-NH₂)가 결합하는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미니스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 이 콜라이(E. coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 플렉스니(Shigella flexni), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
   
5. 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 cgMolluscidin의 유사체인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 약학 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 항균 펩타이드는 N-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조인 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 항균 펩타이드는 C-말단에 아미노기(-NH₂)가 결합하는 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미니스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 이 콜라이(E. coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 플렉스니(Shigella flexni), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
   
9. 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 cgMolluscidin의 유사체인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
10. 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 cgMolluscidin의 유사체인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 칸디다즘 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
11. 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 cgMolluscidin의 유사체인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 장티푸스 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
12. 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 cgMolluscidin의 유사체인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
13. 삭제

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