WO2014107042A1

WO2014107042A1 - 헬리코박터 파일로리균의 리보좀 단백질 l1으로부터 유래된 신규한 항생 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: WO2014107042A1
Application number: PCT/KR2014/000043
Authority: WO
Inventors: 박윤경; 이종국
Original assignee: 조선대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2014-07-10
Also published as: US20150297673A1; US9463214B2; KR20140089664A; KR101583025B1

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리균의 리보좀 단백질 L1으로부터 유래된 신규한 항생 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로써, 구체적으로, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프롤린으로 치환하여 서열번호 4로 기재되는 신규한 펩타이드를 합성하였으며, 상기 신규한 펩타이드가 유의적인 항균활성을 나타내고, 세포독성이 없음을 확인하였으며, 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써, 상기 신규한 펩타이드는 천연 항균제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

헬리코박터 파일로리균의 리보좀 단백질 L1으로부터 유래된 신규한 항생 펩타이드 및 이의 용도

【기술분야】

본 발명은 헬리코박터 파일로리균의 리보좀 단백질 L1으로부터 유래된 신규한 항생 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. [배경기술]

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데， 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다. 실제로， 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 0 ie/ coc«/s faecal is) , 마이코박테리움 투버쿨로시스 ( yco/«c er/i/;77 tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (/¾«i/(¾« 3s aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53， 1998) . 항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데， 1970년대에 뉴모코커스 (/¾ew7?o«?ca/s 에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다 (Tomasz et al .， Nature, 227， 138-140, 1970) . 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin)과 같은 세균의 자가분해 (autolyt ic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데， 페니실린의 경우에 있어서 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydro lytic enzymes)를 활성화함으로써 세균을 죽이지만 또한 세균이 이 효소의 활성을 억제하여 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데， 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev. Infec. Dis. , 7， 368-386, 1985). 아울러， 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데， 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis. , 152, 365-372, 1985)， 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다. 작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지로 구분되는데， 첫번째는 모든 세균에 있어서 성장 속도가 감소할 때 일어나는 외형적 (phenotypic) 내성이며 (TuomanenE. , Revs. Infect. Dis. , 3， S279-S291, 1986),두번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은， 오토라이신 효소의 활성을 감소시키는 조절 (down regulation)이 일어나는 것인데， 이러한 조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이지만， 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게， 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소의 결손으로 생긴 경우인데， 확실하지 않은 여러 가지 이유로， 이러한 자가분해 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며， 오히려 임상에서 발견되는 내성은 오토라이신 효소의 활성을 외형적으로 조절하는 과정으로 이루어진다 (Tuomanen et al. , J. infect. Dis. , 158， 36-43, 1988) .

상기에서 살펴본 바와 같이， 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며， 오토라이신 효소의 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 한편， 세균은 박테리오신 (bacteriocin)이라는 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데， 이러한 박테리오신들은 구조적 특징에 따라 세 가지로 구분된다. 첫번째는 란티바이오틱스 (lantibiotics)이며 두번째는 비 (非)란티바이오틱스 (nonlantibiotics)이고, 세번째는 신호 펩타이드 (signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다 (Cintas et al .， J. Bad. , 180, 1988-1994, 1998) . 곤충을 포함하여， 동물 역시 펩타이드 항생제를 자체적으로 생산할 수 있는데 (Bevins et al . , Ann. Rev. Biochem. , 59， 395-414, 1990)， 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트 (sheet) 펩타이드이고, 두번째는 α-회전형 (helical)의 양친화성 펩타이드 분자이며， 세번째는 프를린이 풍부한 (proline-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al. , Int. J. Antimicrob. Agents, 9， 269-280, 1998) . 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G.， Cell, 65:205, 1991； Boman, H. G. , Annu. Rev. Microbiol. , 13:61, 1995). 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데， 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다.

소화성 궤양이 스트레스와 위산 과다생성에 의해 발생한다는 가설이 있어왔으나, 최근에 이러한 소화성 궤양이 헬리코박터 파일로리균에 의한 것이라고 밝혀지면서 (Blaser, MJ. , Trends Microbiol. , 1， 255-260, 1991) 헬리코박터 파일로리 균에 대한 관심이 집중되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 그람 음성균에 속하는데 성장 속도가 매우 느리고 나선형 몸체와 편모를 가지는 혐기성 미생물이다. 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 많은 단백질 중 RPL1이라는 단백질은 230개의 아미노산으로 구성되어 있으며， 상기 단백질의 아미노말단 부위가 세크로핀과 유사한 구조를 갖는 것이 밝혀졌는데, 특히 8개의 아미노산이 세크로핀과 같은 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 아미노말단 부위는 완벽한 양친화성 나선모양 구조를 가지는데 (Putsep, K. et al., Nature, 398， 671—672， 1999) , 이러한 양친화성 펩타이드는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 미생물의 세포막 지질과 결합하여 미생물의 세포막을 파괴하거나， 세포막의 전위를 변화시켜 미생물을 파괴한다는 작용 기작이 보고되어 있다. 이 외에도 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위는 역시 항균활성을 가진다는 보고가 있다 (Putsep . et al. , Nature, 398, 671-672， 1999) .

따라서 양친화성 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며， ᅳ이를 이용해 세균에 대한 항생제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 지금까지 보고된 양친화성 펩타이드로는 서열번호 1로 기재되는 HP(2-20) 펩타이드， 멜리틴 (melittin, ME) 펩타이드 등이 있다.

¾리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성 활성을 갖고 항생 활성을 나타내는 펩타이드인 서열번호 1로 기재되는 HP(2-20) 펩타이드는 세포 독성은 없으면서 항균활성과 함께 항진균 효과가 있다고 보고되었다 (Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2002， 291, 1006—1013， Biochim. Biophys. Acta. 2002, 1598, 185-194) .

또한， 멜리틴 펩타이드는 벌독의 성분 중 고형분의 50% 이상을 차지하는 펩타이드로서 카르복시 말단이 아미노화 (amidation) 되어 있고 _Γ 진핵세포에 대하여 세포독성이 매우 높아 고등동물세포를 낮은 농도에서도 잘 파괴하고， 미생물인 그람 음성균 및 그람양성균에 대해서도 항균활성이 높다고 보고되었다 (Habermann, E.， Science, 177： 314, 1972； Steiner, H. , et al . , Nature, 292： 246, 1981； Tosteson, M. T.， et al. , Biochemistry, 228： 337， 1987) . 그 이외 HP (2-20)과 유사한 아미노산 서열이 있는 세크로핀 계열의 양친화성 펩타이드는 초파리에게서 처음 발견되었고， 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은창자에서도 발견되었는데， 이 중 세크로핀 A cecropin A, CA)는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것으로 보고되었다 (Boman, H. G. and Hu It mark, D. , Annu. Rev. Microbiol. , 41： 103， 1987) .

또한 상기 양친화성 펩타이드의 활성에 관한 연구와 더불어， 그들이 갖는 아미노산 서열 및 단백질 구조 등의 특성을 살펴보면， 그 서열상의 특성이 항균활성과 매우 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있다. 따라서 상기 양친화성 펩타이드의 아미노산 서열을 이용하여 그 서열의 특정부위에서 유사한 아미노산으로 치환하거나， 일부 서열들을 재조합하여 접합 펩타이드 (conjugation peptide)를 제조하고， 펩타이드 서열의 일부 기능 부위를 서로 도치시킴으로써 항균, 항진균 또는 항암 활성이 탁월한 새로운 합성 펩타이드를 제조할 수 있다 (Chan, H. C. , et al. , FEBS Lett. , 259： 103, 1989； Wade, D. , et al. , Int. J. Pept . Prot . Res., 40： 429, 1992).

실제로 상기의 양친화성 펩타이드를 웅용하여 항암효과가 있는 합성 펩타이드 mag A및 mag G등이 제조되었고，그 효능이 보고된 바 있다 (Ohsaki， et al. , Cancer Res. , 52： 3534, 1992). 그 외에도， 마가이닌 2 및 멜리틴 펩타이드들의 양친화성 부위， 유연성 부위 및 소수성 부위 등의 아미노산을 상호 결합시켜 항진균 활성을 나타내는 합성 펩타이드들이 개발되었으며， 이들은 특히 박테리아 및 곰광이 속 균주에 작용함이 특허 등록된 바 있다 (대한민국 특허등록 제 02045이호).

또한， 본 발명자들은 기존의 ΗΡ(2— 20) 펩타이드의 특정 아미노산을 트립토판으로 치환하여 소수성을 증가시킴으로써 항생효과가 증진됨을 확인하여 항생 펩타이드 (서열번호 2)로써 특허 등록된 바 있고 (대한민국 특허등록 제 0459808호)， ΗΡΑ3펩타이드 (서열번호 2)의 글루타민산을 프를린으로 치환시킴으로써 접힘구조를 갖는서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드를 특허 등록된 바 있다 (대한민국 특허등록 제 0935029호). 항생 펩타이드 구조의 대부분은 일직선상의 나선 구조로 구성되어 있음으로써 세포의 막을 공격하는 특징을 갖는데， 이때 일직선상의 나선구조의 적절한 부위에 접힘 구조를 줌으로써 세포의 막에 더욱더 잘 결합하도록 조절하는 것이 가능해진다. 즉 세균이나 곰팡이의 막 표면의 소수성 또는 전하를 이용하여 이들의 막에서 결합을 더욱 잘하도록 유도하는 것이다. 이에 본 발명자들은 새로운 천연 항균제를 개발하기 위해 노력한 결과， 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환하여 서열번호 4로 기재되는 신규한 펩타이드를 합성하였으며, 상기 신규한 펩타이드가 유의적인 항균활성을 나타내었고, 세포독성이 없음을 확인하였으며， 생체 내 (//2 rVo)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 상기 신규한 펩타이드를 천연 항균제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명올 완성하였다.

【발명의 상세한 설명]

【가술적 과제】

본 발명의 목적은 산규한 항균용 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

[기술적 해결방법]

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.

또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 항균 펩타이드 또는 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 항균 펩타이드 또는 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 병원성 세균에 기인한 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 항균제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드를 제공한다.

또한， 본 발명은 항균용 건강식품으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드를 제공한다.

또한， 본 발명은 본 발명에 따른 템타이드를 항균제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

아울러， 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 항균용 건강식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

【유리한 효과】

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물은 탁월한 항균활성을 나타내고 용혈작용 및 세포독성이 없으며， 생체 내 ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명의 HPA3P에 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환하므로서 모체인 펩타이드에 비해 접힘 구조와 유연성이 높은 항생 펩타이드를 2차 구조 분석기 (CD: Circular Dichroism)를 이용하여 확인한 도이다:

A: HPA3P (서열번호 3) 처리군; 및

B: HPA3P2(서열번호 4) 처리군.

도 2는 대장균의 세포 내부 막에 미치는 영향을 사이톡스 -그린 형광물질을 이용해 형광 광도의 증가정도를 확인한 도이다:

A: HPA3P (서열번호 3) 처리군，

B: HPA3P2 서열번호.4) 처리군； 및

C: 버포린 -2(Buporin-2) 펩타이드. 도 3은 본 발명의 펩타이드와 모체펩타이드에 로다민 (rhodamine) 형광 다이 (dye)를 부착 후 펩타이드가 대장균에 작용여부를 형광 현미경을 통해 확인한 도이다:

A: HPA3P (서열번호 3) 처리군； 및 ^'

B: HPA3P2(서열번호 4) 처리군.

도 4는 ICR 마우스에 Pseudomo s aeruginosa 균을 감염 시켜 염증을 유발한 후 서열번호 4 펩타이드를 처리하여 면역 반웅 억제 측정을 나타낸 도이다:

A: 염증이 유도된 ICR마우스에 서열번호 4 펩타이드를 한번 및 여러 번 처리하여 10일 동안 염증 억제를 확인한 도이다;

B: 염증이 유도된 ICR 마우스에 서열번호 4 펩타이드를 농도별로 처리하여 염증 억제를 확인한 도이다:

1) 음성 대조군;

2) P. aeruginosa 균으로 감염된 양성 대조군;

3) 서열번호 4 펩타이드 0.25 mg/kg농도를 처리한 군; 및

4) 서열번호 4 펩타이드 0.5 mg/kg 농도를 처리한 군.

도 5는 ICR 마우스에 대장균을 처리하여 각 조직의 변화를 확인한 도이다.

도 6은 ICR 마우스에 Pseudomonas aeruginosa 균을 감염 시켜 염증을 유발한 후 서열번호 4 펩타이드를 처리하여 항 염증 관련 단백질 증가여부를 확인한 도이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드는 대한민국 특허등록 제 0935029호에서 제조된 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3P의 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한，상기 펩타이드는 그람 양성균， 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균활성을 갖는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 상기 그람 양성균은 스트랩토코쿠스 (5 rep ococ«/s), 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (S rooiococcws Pneumonia)， 코리네박테리움 디프테리아 ( Corynebacterium diphtheriae) , 클로스트리디움 테타니 ( CIos iridium tetani) , 바실러스 안트라시스 0¾c///i/s anthracis) , 스트렙토미세스 그리세우스 (Sfre io yces^/sei/s),스태필로코쿠스 아우레우스 (^ap y/ococ /s aureus) 및 바실리우스 서브틸리스 (fec///i/s subtilis ^ 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나, 상기 그람 음성균은 살포넬라 (5a½( e//a), 쉬겔라 (5 7 e//a), 타이포이드 바실러스 (iyp /i/ bacillus) , 비브리오 콜레라 cholerae) , 예르시니아 페스티스 (yers//?/a pest is) , 나이세라아 고노로에아 fe/sser/a gonorrhoeae) , 나이세리아 메닌지티디스 (Afe/ssar/a meningitidis) , 스피로해타， ^^균 Escherichia coli) 및 슈도모나스 에루기노사 (/¾«¾ 35 aeruginosa) 으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느- 하나 및 상기 항생제 내성 균주는 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM3090, 3108, 3114， 3126)， 대장균류 ( . coli CCARM 1229, 1238) 및 슈도모나스 에루기노사 0 «fe7OTas aeruginosa 1034， 3904, 4007， 4891)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 대하여 항균활성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명자들은 세포막에 대한 결합력 향상을 위한 항생 펩타이드를 제조하기 위하여， 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법에 따라， Fmoc(9-flurenylmethoxy carbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하여 , 서열번호 3으로 기재되는 HPA3P 펩타이드의 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환시킨 서열번호 4으로 기재되는 HPA3P2펩타이드를 합성하였다 (표 1및 도 1 참조). 또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드 항균활성을 측정하기 위하여， 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농동인 생육 최소저해농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC)를 측정하여 관찰하였다. 이 때 사용한 그람 양성균은 스태필로코쿠스 아우레우스 (5iap/2y/iX c s aureus) 및 바실리우스 서브틸리스 (fec///i/s subtilis)⁰]^, 그람 음성균은 대장균 c?er/ ¾/a coli) 및 슈도모나스 에루기노사 (/¾«¾7?i as aeruginosa)이며 항생제 내성 균주는 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCAM 3090, 3108， 3114, 3126), 대장균류 ( . coli CCARM 1229, 1238)및 슈도모나스 에루기노사 蕭 as aer^/ sa 1034， 3904, 4007, 4891)이다. 그 결과， 일반 균주에서 본 발명의 펩타이드 (HPA3P2)는 모체 펩타이드에 비해 약간의 항균활성이 낮음을 확인하였고 (표 1 참조)， 내성 균주에서는 모체 펩타이드와 유사한 항균활성을 확인하였다 (표 2 참조).

또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지 확인하기 위하여， 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과， 본 발명의 서열번호 3으로 기재된 HPA3P 및 서열번호 4로 기재된 HPA3P2 펩타이드의 용혈작용은 800 μΜ에서도 일어나지 않음을 확인하였다 (표 1 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 정상세포주에서 세포독성을 나타내는지 확인하기 위하여, 사람의 각질 형성 세포주 (HaCaT cell line)을 이용하여 세포독성올 측정한 결과， 서열번호 4로 기재된 HPA3P2 펩타이드는 세포독성 억제 10%(ECi₀)가 180.5 μΜ로 모체 펩타이드인 ΗΡΑ3Ρ보다 좋은 것을 확인하였으며， 세포독성 억제 50%(EC₅₀)에서는 400 μΜ에서 독성이 일어나지 않는 것을 확인하였다 (표 1 참조).

또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드 구조 변화를 분석하기 위하여 원편광 이색성 분광 측정법 (_Ci_rcui_ar dichroism, CD)를 이용하여 분석한 결과， 서열번호 4로 기재된 펩타이드 (HPA3P2)는 세포막 지질과 유사한 SDS에서 약간의 알파-나선형 구조를 형성하지만 기타 다른 조성에서는 구조를 형성하지 않는 것을 확인하였다 (도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 세포막을 투과하여 핵산과 작용하는지를 확인하여 위하여 사이특스 -그린 (SYTOX-Green) 형광 및 광도를 시간단위로 측정한 결과， 본 발명의 서열번호 4로 기재된 펩타이드 (HPA3P2) (도 2B)는 서열번호 3으로 기재된 펩타이드 (HPA3P) (도 2A)에 비해 농도가 증가함에도 형광 강도의 변화는 일어나지 않는 것을 확인하였다. 반면에， 서열번호 3으로 기재된 펩타이드 (HPA3P)는 버포린 -2(buforin-2) (도 2C)와 동일한 반웅을 나타내는 것을 확인하였다 (도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 대장균의 어느 부분에 작용하는지 그 위치를 확인하기 위하여 공초점 레이저 현미경 (confocal laser scanning microscopy)을 이용하여 확인한 결과， 서열번호 3으로 기재된 HPA3P (도 3A)는 대장균의 막 내부에 투과하여 대장균이 붉은빛을 강하게 발산하는 것을 확인하였으며， 서열번호 4로 기재된 HPA3P2 도 3B)는 대장균이 거의 없으며， 또한 형광을 거의 발산하지 않은 것으로 빠른시간에 대장균을 파괴시켜서 세척과정 중 작은 입자로 분리된 대장균이 세척되어버린다는 것을 확인하였다 (도 3 참조).

또한， 본 발명자들은 생체 내 (/? w^'ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인하기 위하여， ICR 마우스 ((주 ) 셈타코 바이오 코리아)에 증을 유도하 7] 위하여， Pseudo onas aeruginosa (mult idrug— resistant P. aeruginosa 4007 cells, MDRPA, 6xl0⁷cfu/ml )균을 lOOul 처리하여 염증이 유도된 마우스쎄서 본 발명의 펩타이드에 의한 면역 반응 억제를 측정한 결과， 박테리아를 처리한 부분에서 면역세포가 밀집 되는 현상을 확인하였다. 이와 대조로 펩타이드를 처리한 곳에서는 농도가 증가함에 따라ᅳ 염증 반웅은 줄어드는 것을 확인 하였다 (도 4 참조).

또한， 본 발명자들은 ICR 마우스에 염증을 유도하기 위하여 GFP가 라밸링된 대장균 (E.Coli)을 감염 시킨 후, 상기 염증이 유도된 마우스의 조직을 적출하여 각각의 조직을 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과， 항균 펩타이드를 0.25 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 농도로 처리한 마우스 군에서 염증이 억제되는 것을 확인하였으며， 항균 펩타이드를 높은 농도 (0.5 mg/kg)로 처리한 마우스 군의 조직에서 염증이 현저하게 줄어드는 것을 확인함으로써, 서열번호 4 항균 펩타이드에 의해 조직에 감염된 미생물에 대한 강한 항균활성을 보이므로 피부염 유발을 예방할 수 있음을 확인하였다 (도 5 참조).

아울러， 본 발명자들은 ICR 마우스에 Pseudorwnas aeruginosa (mult i drug-resist ant P. aeruginosa 4007 eel Is, MDRPA, 6xl0⁷cfu/ml )균을 이용하여 염증을 유도 시킨 후， 상기 마우스에 각기 다른 농도의 서열번호 4 항균 펩타이드를 처리하여 조직을 적출한 후， 웨스턴 블랏을 사용하여 항염증 단백질의 발현 정도를 확인한 결과， 염증이 유도된 마우스의 조직에서 신호전달 단백질 (IL-6, TLR-4, NF-kB) 및 사이토카인 (TNF-a , IL— 1β)이 과 발현하는 것을 확인하였고， 각각의 농도로 서열번호 4 항균 펩타이드를 처리한 마우스군의 조직에서 상기 펩타이드 처리 농도가 증가함에 따라 염증 관련 단백질이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 서열번호 4 항균 펩타이드가 항 염증 억제에 강한 작용을 한다는 것을 확인하였다 (도 6 참조).

따라서， 본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고， 생체 내 ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드는 대한민국 특허등록 제 0935029호에서 제조된 서열번호

3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3P의 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프롤린으로 치환된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한，상기 펩타이드는 그람 양성균， 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균활성을 갖는 것이고， 보다 구체적으로 상기 그람 양성균은 스트랩토코쿠스 스트랩토코쿠스 뉴모니아 (5 rep ococa/s

Pneumonia) , 코리네박테리움 디프테리아 (< rj¾ebac er7½7 diphtheriae) , 클로스트리디움 테타니 7osi /o7i/ff tetani) , 바실러스 안트라시스 ( ac/77 s anthracis) , 스트랩토미세스 그리세우쓰 Streptomyces griseus)， 스태필로코쿠스 아우레우스 (5 ap/?y/ococa/s aureus) 및 바실리우스 서브틸리스 0¾c///i/ssib ///s)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나,상기 그람 음성균은 살모넬라 (5a½(¾ //a), 쉬겔라 (s?7 e//a), 타이포이드 바실러스 ( yp /d bacillus), 비브리오 콜레라 ( /br/o cholerae) , 예르시니아 페스티스 (yers ?/a pest is) , 나이세라 고노로에 ⁰K\fe/sser/a gonorrhoeae) , 나이세리아 메닌지티디스 (Afe/sser/a meningitidis) , 스피로헤타， ^ ( Escherichia coli) 및 슈도모나스 에루기노 H ¾«< WMas aeruginosa) 으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 상기 항생제 내성 .균주는 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM 3090, 3108. 3114， 3126) , 대장균류 (£\ coli CCARM 1229, 1238)및 슈도모나스 에루기노사 (/¾« / M s aer g7^'¾ a 1034， 3904, 4007， 4891)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 대하여 항균활성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 신규한 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉， 본 발명의 신규한 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제, 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제， 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol)ᅳ 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골， 트원 (tween) 61, 카카오지， 리우린지， 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규한 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체 (carrier)와 흔합하여 사용될 수 있고， 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스， 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물， 아스코르브산 (ascorbic acid) 또는 글루타치은 (glutathione)과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이트화제 (chelating agents) , 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규한 펩타이드의 유효용량은 0.01 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 iiig/kg 이며， 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드의 총 유효량은 볼루스 (bolus)형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입 (infusion)등에 의해 단일 투여량 (single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 또한， 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 ¬타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 보조제 또는 식품 첨가제를 제공한다.

본 발명의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우， 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 흔합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 본 발명의 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량부이하ᅳ 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나， 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며， 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류， 소시지， 빵， 쵸코렛， 캔디류， 스넥류， 과자류， 피자， 라면，기타 면류， ¾류，아이스크림류를 포함한 낙농제품，각종스프,음료수，차， 드링크제， 알코을 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

^' 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 항균 펩타이드 또는 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법을 제공한다.

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고, 생체 내 (/ /ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써 , 본 발명의 항균 펩타이드 또는 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법으로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 항균 펩타이드 또는 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 병원성 세균에 기인한 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 병원성 세균은 스태필로코쿠스 아우레우스 (5 ap/2y/ococ /s aureus) ^장균 Escherichia coli) , 및 슈도모나스 에루기노사 (/¾ea½7( as aerugiiiosa)⁰ 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고 생체 내 w o)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 본 발명의 항균 펩타이드 또는 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균에 기인한 질환 예방 또는 치료방법으로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 항균제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고， 생체 내 y/ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 본 발명에 따른 펩타이드를 항균제로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 항균용 건강식품으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고， 생체 내 (/ r/ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 본 발명에 따른 펩타이드를 항균용 건강식품으로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 항균제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고， 생체 내 (//? r/ra)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 본 발명에 따른 펩타이드를 항균제의 제조에 이용하는 용도로 사용될 수 있다. 아울레 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 항균용 건강식품의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 유의적인 항균활성을 나타내고 용혈 작용 및 세포독성이 없고， 생체 내 wVo)에서 본 발명의 펩타이드에 의한 항 염증 효과를 확인함으로써， 본 발명에 따른 펩타이드를 항균용 건강식품의 제조에 이용하는 용도로 사용될 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다. <실시예 1>펩타이드들의 합성 및 분리정제

세포막에 대한 결합력 향상을 위한 항생 펩타이드를 합성하기 위해， 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법 (Merri field, RB. , J. Am. Chem. Soc. , 85， 2149, 1963)에 따라, Fmoc(9-f luorenylmethoxy carbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하여， 서열번호 3으로 기재되는 HPA3P 펩타이드의 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환시킨 서열번호 4로 기재되는 HPA3P2 펩타이드를 합성하였다 (표 1 및 도 1). 그 외에도 대조군으로 버포린 -2(buforin-2) 펩타이드를 합성하였다.

구체적으로， 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -NH₂형태인 펩타이드는 RinkAmideMBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며，카르복실말단이 -0H 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산 -Wang Resin 을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 사슬 (chain)의 연장은 DCC ( N-hydr oxybenzo tr iazole(HOBt)- d i eye 1 o-hexyc ar bod i i m i de ) 법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산올 커플링 (coupling) 시킨 후， NMP(20% piper idine/N-methyl pyrolidone)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. ^'여기에 TFA (trif luoroacetic acid)—phenol_thioanisole_¾0— triisopropylsilane(85 ： 5 ： 5 ： 2.5 ： 2.5， v/v) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반웅시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후ᅳ 디에틸에테르 (diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드 (crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배 (acetonitrile gradient)에서 정제형 역상 (reverse phase, RP)-HPLC cokmin(Delta Pak, C₁₈ 300A, 15， 19.0mm. χ 30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6NHC1로 110°C에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02 N HC1에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 상기의 방법으로 조성된 펩타이드들의 순도를 확인한 결과 95%이상의 순도를 나타내었으며， MALDI 질량 분석법 (Hill, et aJ . , Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5： 395, 1991)을 이용하여 분자량을 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 비교한 결과， 그 값이 일치하는 것을 확인하였다. 특히， 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드는 MALDI 분석 결과， 분자량 (HPA3P: 2417.2, HPA3P2: 2367.0)이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다 (표 1).

【표 11

¾하이¾ 아미: ¾서 분자량, 휼5ᅵ서간 활성여^ 인 설계 서열 분자량

i AS (서 ：번; A I^F RLPiO,FSiqWNWK-NH2 2417.2 23.66 1 8 16 2 >800>8W ,151.5/3812

ΗΡΑ3Ρ2(서 , 번호 ¾ AKKVFIOU.PKLPS iW W -NHl 2367Λ 19.82 16 16 >64 >64 >80»/>800 I8».5 00

Ec: ^^균 Escherichia coli) , Pa: 슈도모나스 에루기노사 (/¾ec½?( as aeruginosa) , Sa: 스태필로코쿠스 아우러 1우스 (5ia /o"?":i/s aureus) , Bs： 바실리우스 서브틸리스 (fec; /i/s subt il is), : 생육 최소저해농도 (Minimal Inhibitory Concentration)

<실시예 2>항균활성 측정

상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 HPA3P2 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여， 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도 (MIC)값을 측정하였다. ^{^}

구체적으로， 항균활성 측정을 위하여 표준 균주인 그람 음성균으로써 대장균 (KCTC 1682) 및 슈도모나스 에루기노사 (KCTC 1637)를， 그람 양성균으로써 스테필로코쿠스 아우레우스 (KCTC 1637) 및 바실리우스 서브틸리스 (KCTC 1918)를 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아， 그리고 각종 저항성 균주로 스테필로코쿠스 아우레우스 (CCARM 3090， 3018， 3114， 3126) 및 대장균 (CCARM 1229, 1238)은 이화여자대학 균주은행으로부터 분양받았으며， 슈도모나스 에루기노사 (1034， 3904， 4007， 4891)은 전남대학교병원 중이염 환자로부터 입수하였다. 각 균주를 LB배지 (1%박토 트립톤 0.5%박토 이스트 추출물， 1% 염화나트륨; Sigma, USA)에서 중간 -로그 상 (mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지 (Difco, USA)로 5 X 10⁵ 세포 /100 ^의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트 (Nunc, USA)에 접종하였다. 상기 <실시예 1>에서 합성한 펩타이드 및 표 1의 펩타이드들을 각각 96웰부터 1/2배씩 희석하여 폴레이트에 첨가한 후 37°C에서 6 시간 동안 배양하였고， 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기 (Merck Elisa reader , Germany)를 이용하여 620 ran의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였다.

그 결과， 표 1및 표 2에 나타낸 바와 같이， 상기 <실시예 1>에서 합성한 본 발명의 펩타이드 (HPA3P2)와 모체 펩타이드 (HPA3P)의 항균활성 측정결과 표준 균주인 그람 음성균과 그람 양성균에서 본 발명의 펩타이드가 모체 펩타이드에 비해 약간의 항균활성이 낮음을 확인하였고 (표 1)， 각종 저항성 균주에서는 모체 펩타이드와 같거나 유사한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다 (표 2) ·

【표 2】 저항성 균주에 관한항^활성 측정

!VHC稱

균^'丁 '

HPA3P HPA3P2 Ampiciltin Erythromycin Piperacillin

S. aureus CCARM 3090 I 1 - 漏 -

S. aureus CCARM 3018 1 1 - >800 -

S.aumts CCARM 3114 1 1 • >806 -

S. aureus CCARM 3126 1 1 - >800 -

Kcoli CCARM 1229 0.5-1 0.5-1 >800 - -

E.mUCCARMWS 0.5-i 0.54 >800 - -

P. aeruginosa 1034 1 1 - - >400

P. aeruginosa 3904 1 1 - - >40«

P. aeruginosa 4007 1 1 - - >400

P. aeruginosa 4891 1 i - - >400

<실시예 3>용혈 활성 측정

상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 접힘 구조를 갖는 HPA3P2 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 접힘 구조를 갖는 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다.

구체적으로， 인간 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완층용액 (PBS, pH

7.0)으로 회석하고 여기에 12.5 μΜ/웰부터 1/2의 농도로 표 1에 서열번호 3과

4로 기재된 펩타이드들을 각각 연속적으로 희석하여 37°C에서 1 시간 동안 반웅시켰다. 이후， 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 해모글로빈량을， 414 ηπι 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 비교 조사하기 위하여 1% 트리톤 X— KXKsigma, USA) 을 인간 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였다. ^' 상기 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하고， 하기 수학식 1에 따라 본원 발명의 펩타이드 및 표 l의 펩타이드들의 적혈구 파괴능을 계산하였다.

상기 수학식 1에서， 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도 흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1%트리톤 X— 100의 흡광도를 나타낸다.

그 결과， 표 1에 나타낸 바와 같이， 서열번호 3으로 기재된 HPA3P과 본 발명의 서열번호 4로 기재된 HPA3P2 펩타이드의 용혈작용은 800 μΜ에서도 일어나지 않는 것을 확인하였다 (표 1).

<실시예 > 정상 세포주에서 세포독성 확인

상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 정상 세포주에서의 세포독성을 확인하기 위해， 사람의 각질 형성 세포주 (HaCaT cell line, Dr. NE. Fusenig, Heidelberg, Germany)을 이용하여 독성을 측정하였다.

구체적으로, 10% FBSCFetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle's Medium)배지에서 배양된 사람의 각질 형성 세포주 (HaCaT eel 1 line)를 2 χ 10⁴씩 96웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후， 상기 <실시예

1>에서 제조한 펩타이드들을 각각 농도별로 처리하여 24시간 동안 5% C0₂ 인큐베이터에서 반웅시켰다. 배양 후， 5 mg/ml 농도로 인산 완충액 생리식염수 (phosphate buffered saline; PBS)에 녹인 MTT Thiazolyl Blue

Tetrazolium Bromide) 용액 20 C를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반웅시켰다. 상층액을 제거하고， 200 ^의 DMS0를 넣어 형성된 MTT 크리스탈을 녹여， 560 nm에서 결과를 확인하였다.

그 결과， 표 1에 나타낸 바와 같이， 사람의 각질 형성 세포주 (HaCaT cell line)에서 서열번호 3으로 기재된 HPA3P펩타이드는 세포독성 억제 10%(EC₁₀)가 151.1 μΜ이었으며，본 발명의 서열번호 4로 기재된 ΗΡΑ3Ρ2펩타이드는 서포독성 억제 10%(EC₁₀)가 180.5 μΜ로 모체 펩타아드인 ΗΡΑ3Ρ보다 좋음을 알 수 있었으며， 세포독성 억제 5OT(EC₅₀)에서는 400 μΜ에서 독성은 일어나지 않음을 확인하였다 (표 1).

<실시예 5>원편광 2색성 스펙트라 (CD: Circular Dichroism Spectra)분석 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드를 원편광 이색성 측정법 이용한 구조의 변화를 측정하였다. 원편광 이색성 스펙트라 (Jasco J-810 spectropolarimeter(Jasco, 미국)) 장비로 은도조절이 가능한 것으로 25°C로 온도를 고정시켰다. 구조결정을 확인하기 위해 사용된 cell의 경로길이 (path- length quartz)는 0.1 cm자리를 이용하였다. 각 펩타이드의 농도는 30 μΜ을 이용하였으며， 사용 완충제로는 10 mM 인산나트륨 (sodium phosphate) , 50% trif luoroethanoKTFE, v/v) , 30 mM sodium dodecyl sul fateCSDS, v/v) 그리고 300 mM lipopolysaccharide(LPS)와 반웅한 후 원편광 이색성 스뭬트라의 250-190 nm 범위에서 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드돌의

2차 구조를 분석하였다. 이들 타원형 구조 ([Θ], degcm'dmor¹) 분석은 수학식 2와 같다.

[수학식 ²]

[θ] = Θ obs I 10 /c

9obs는 1/1000 (mil lidegree)에서 신호 (타원형)가 측정된 값， 는 셀의 길이 (cm)에 빛이 투과되는 길이 (optical path-length), c는 시료의 몰 (molar)에 농도를 의미한다.

그 결과， 도 1에 나타낸 바와 같이， 서열번호 3으로 기재된 펩타이드 (HPA3P)는 10 mM 인산 완층제에서는 구조를 형성하지 않지만 TFA, SDS그리고 LPS에서 전형적인 알파-나선형 (helix)구조를 갖는 것으로， 특히 세포막 지질과 유사한 SDS에서는 아주 강하게 구조를 형성하는 것을 확인하였다. 이것과 비교로 서열번호 4로 기재된 펩타이드 (HPA3P2)는 세^ᅵ포막 지질과 유사한 SDS에서 약간의 알파-나선형 구조를 형성하지만 기타 다른 조성에서는 구조 형성이 일어나지 않음을 확인하였다 (도 1).

<실시예 6>펩타이드의 사이특스 -그린 (SY OX-Green) 형광 빛 광도 측정 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드를 사이특스 -그린 (SYTOX-Green) 형광 및 광도를 시간단위로 측정하였다. 구체적으로， 대장균 0?. co//)을 LB배지로 37°C에서 배양한 후 10 mM인산 나트륨 (sodium phosphate) 완층제에서 대장균 세포를 2 χ 10⁷cells/ml로 맞추었다. 이들 대장균 세포에 사이특스 -그린 (SYTOX-Gree)올 1 μΜ을 처리하여

15분에서 20분가량 빛이 들어오지 않은 배양기에서 반웅을 시킨 후 비교군 (HPA3P(A), Buporin-2(C))과 실험군 (HPA3P2)(B) 펩타이드를 최소억제농도 (MIC)로 처리하고 사이톡스 -그린 (SYTOX-Green)으로부터 형광 광도 증가를 발광파장 485 nm와 방사파장 520 nm에서 측정하여 결정한 값으로 나타내었다.

그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 서열번호 4로 기재되는 펩타이드 (HPA3P2) (도 2B)는 서열번호 3으로 기재된 펩타이드 (HPA3P) (도 2A)에 비해 농도가 증가함에도 형광 빛 강도의 변화는 일어나지 않았다. 반면 대조군 (HPA3P)은 버포린 -2(Buforin-2) (도 2C)와 동일한 반웅을 나타내는 것을 확인하였다 (도 2).

따라서， 기존에 알려진 버포린 -2 펩타이드는 세포막을 투과하여 핵산과 작용하는 것으로 막을 투과시 순간의 구멍 (tranzent pore)이 형성되어 형광물질이 핵산과 결합 후 형광 빛 강도의 변화가 일어나는 것으로 대조군인 HPA3P 펩타이드가 이러한 작용을 하지만 실험군인 HPA3P2 펩타이드는 형광 빛 강도의 변화가 템타이드 농도가 증가함에도 불구하고 아무런 변화가 일어나지 않은 것으로 실험군과 대조군의 기작이 다름을 확인하였다.

<실시예 7> 형광현미경 (CLSM: Confocal Laser-Scaining Microscopy)에 의한 펩타이드가 대장균 co//)의 막에 작용여부 확인

상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 HPA3P2 펩타이드에 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine;TAMRA)올 실험군과 대조군의 C말단의 아민 (amine)기에 부착하여 대장균 ( 에 미치는 작용기작을 형광현미경 (CLSM: Confocal Laser-Scaining Microscopy)을 이용하여 확인하였다.

구체적으로， 실험군인 서열.번호 4로 기재된 HPA3P2와대조군인 서열번호

3으로 기재된 HPA3P의 C말단에 TAMRA을 부착 후 37 ⁰C에서 24시간동안 LB 배지에서 배양된 대장균 ( . 에 실험군과 대조군의 최소 억제 농도 (MIC ： minimum inhibitory concentration) 값에서 처리하여 상은에서 5분간 반응 시간을 유지 후 원심분리기 4,000 rpm으로 침전시킨 대장균을 생리식염수 (PBS)로 3번 세척하였다. 형광 다이 (dye)가 부착된 실험군과 대조군이 대장균에 작용하는 현상을 LSM 510 형광현미경으로 헬륨 네온 레이저 (helium neon laser) 543 nm 파장을 사용하였으며， 이것을 이미징으로 작성하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이， 서열번호 3으로 기재된 HPA3P (도 3A)는 대장균의 막내부에 투과하여 대장균이 붉은빛을 강하게 발산하는 것을 확인하였으며， 서열번호 4로 기재된 HPA3P2(도 3B)는 대장균이 거의 없으며， 또한 형광을 거의 발산하지 않은 것으로 빠른시간에 대장균을 파괴시켜 세척 과정 중 작은 입자로 분리된 대장균이 세척되버린다는 것을 확인하였고, 또한 대조군과 실험군이 대장균에 작용시 미치는 영향력 /기작이 다르다는 것을 확인하였다 (도 3).

：제조예> 약학적 제제의 제조 <1-1>산제의 제조

<실시예 ι>의 펩타이드 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 흔합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2>정제의 제조

<실시여 1 1>의 펩타 0 100 mg

옥수수전분 100 mg

Τ으Γ 당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 흔합한 후,

제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3>캡슐제의 제조

<실시예 ]>의 펩타이 100 mg

옥수수전분 100 mg

ΤΓ 당 100 nig

스테아린산 마그네슘 2 nig

상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4>환의 제조

<실시예 1>의 펩타이드 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리를 0.5 g

상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다. <l-5>과립의 제조

<실시예 1>의 펩타이드 150 nig

대두 추출물 50 mg

포도당 200 mg

전분 600 nig 상기의 성분을 흔합한 후, 30% 에탄올 100 mg을 첨가하여 섭씨 60°C에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<실시예 8> 생체 내 (//? wVo)에서 펩타이드에 의한항 염증 효과 확인 <8-1>마우스사육

ICR 마우스를 주식회사 셈타코 바이오 코리아에서 분양올 받아 받았다. 분양 받은 모든 마우스를 각각의 케이지에 그룹별로 나누어서 5일 동만 안정화를 시킨 후 본 실험에 들어갔다. 본 실험에서 모든 마우스는 12:12h로 dark- light 사이클을 유지 시켰으며， 사육장의 은도는 22 土 2^°C에서 습도를 40-50%로 유지한 상태에서 사육을 하였다.

<8-2> 염증이 유도된 마우스에서 펩타이드에 의한 면역 반웅 억제 측정 확인

염증이 유도된 마우스에서 펩타이드에 의한 면역 반웅 억제를 측정하기 위하여， 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로, ICR 마우스 ((주 ) 셈타코 바이오 코리아)에 염증을 유도하기 위하여， Pseudowonas aeruginosa (mult i drug-resist ant P. aeruginosa 4007 cells, MDRPA, 6xl0⁷cfu/ml)균을 lOOul 처리하였다. 처리 30분 후， 균이 감염된 상기 마우스에 서열번호 4펩타이드를 0.25및 0.5 mg/kg로 각각 처리하였다. 염증이, 유도된 부위에 펩타이드를 처리한 마우스와 펩타이드만을 처리한 마우스 그리고 염증이 유도된 마우스의 조직을 각각 적출하여 생리식염수인 PBS를 이용하여 세척을 하였고, 4%파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)를 사용하여 상온에서 24시간 동안 조직을 고정시켰다. 고정시킨 모든 조직을 에탄올의 농도를 높여가며 조직의 수분을 탈수 시킨 다음 (각각 2시간동안 반웅), 3번에 xylene을 치환하여 각각 1시간 동안 반웅을 하고 난 후 파라핀 블록을 제작 하였다. ^' 제작된 파라핀 블록의 샘플은 마이크로틈 (Microtome, Thermo-scientific)을 이용하여 4 μιτι씩 섹션을 하고， 상은에서 수분을 완전히 제거시켰다. 조직에 Heamatoxyline & Eosin염색과 조직에 면역조직화학 방법을 통해 조직의 변화와 항 염증 사이토카인 (Cytokine)또는 TLR4 수용체 작용여부를 확인하기 위한 것으로， 섹션 해놓은 각각의 조직을 xyline에서 파라핀 (paraffin)을 제거시켰다. 다음 단계로 조직의 수분을 완전히 제거 하기 위해 에탄올의 농도를 높여가면서 (반웅시간 2분) 가수분해하였다. 가수분해된 조직에 1½3111 0乂 1^1 & £0 11을 이용하여 염색을 시켰다. 또한， 각각의 조직에 5% 소혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)으로 블록킹 (blocking)을 하여 조직 사이의 빈 공간을 채워주며， 항염증 반웅을 보이는 항체인 anti-TLR-4 mouse (ABfrontier, AB24192), anti -TNF- α， mono, mouse (ABfrontier, AB1793) , anti-IL-Ιβ , poly, mouse (ABfrontier, AB1413)를 이용하여 조직에 부착하도록 상온에서 20분간 반웅시켰다. 그런 다음， 조직이 떨어지지 않도록 TBST 완충제를 이용하여 나머지 액들을 제거 시켜주며, 녹색 형광이 부착되어있는 2차 항체 (Got anti -mouse IgG (HRP) LF-SA5001-conjugated)를 부착시켰다. 상기 각각의 조직을 형광현미경을 이용하여 관찰 /확인 한다 (1x71, Olympus, Tokyo, Japan) .

그 결과， 도 4에 나타낸 바와 같이， 박테리아를 처리한 부분에서 면역세포가 밀집 되는 현상을 확인하였다. 이와 대조로 펩타이드를 처리한 곳에서는 농도가 증가함에 따라 염증 반웅은 줄어드는 것을 확인 하였다 (도 4).

<8-3>염증이 유도된 마우스의 각기관별 조직의 변화확인

염증이 유도된 마우스 조직의 변화를 확인하기 위하여， 하기와 같은 방법을 수행하였다.

구체적으로， ICR 마우스에 염증을 유도하기 위하여 GFP가 라벨링된 대장균 (E.Coli)을 감염 시키고 한 시간이 지난 후， 상기 염증이 유도된 마우스의 조직을 적출하여 표면을 절단하였다. 적출된 각각의 조직을 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다 (1x71, 을림푸스, 도코, 일본).

그 결과， 도 5에 나타낸 바와 같이， 항균 펩타이드를 0.25 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 농도로 처리한 마우스 군에서 염증이 억제되는 것을 확인하였으며， 항균 펩타이드를 높은 농도 (0.5 mg/kg)로 처리한 마우스 군의 조직에서 염증이 현저하게 줄어드는 것을 확인함으로써， 서열번호 4 항균 펩타이드에 의해 조직에 감염된 미생물에 대한 강한 항균활성을 보이므로 피부염 유발을 예방할 수 있음올 확인하였다 (도 5).

<8-4> 염증이 유도된 마우스에서 항 염증관련 단백질 증가여부확인 염증이 유도된 마우스에서 항 염증 관련 단백질 증가 여부를 확인하기 위하여， 하기와 같은 방법을 수행하였다. _.

구체적으로， ICR 이우스에 Pseudomonas aeruginosa (multidrug— resistant P. aeruginosa 4007 cells, MDRPA, 6xl0⁷cfu/ml )균을 이용하여 염증을 유도 시켰다. 염증이 유도된 상기 마우스에 각기 다른 농도의 서열번호 4 항균 펩타이드를 처리하여 조직을 적출한 후, 상기 조직의 단백질을 추출하였다. 그런 다음, 상기 추출된 단백질을 Bradford 방법으로 농도를 정량화 시키고, 전체 단백질을 SDS-PAGE 전기영동으로 15% 아크릴아마이드 겔에서 3시간 동안 수행하였다. 그런 다음， PVDF 멤브래인 (Bio-Rad, USA)에서 전기영동 된 단백질을 90V로 1시간 동안 4^°C에서 이동시킨 후 각각의 1차 항체를 5¾ 스킴 밀크 (skim milk); 항- GAPDH( Santa Cruz Biotechnology, LF-PA0018) , 항- TLR2, 모노 (mono), 마우스 (mouse) (ABfront ier， AB24192), 항—NF- KB, 폴리， 마우스 (Santa Cruz Biotechnology, SC-71675) , 항- TNF- α , 모노， 마우스 (ABfront ier, AB1793) , 항- IL-1 β , 폴리 , 마우스 (ABfront ier， AB1413) 및 항- Cathelicidin, 폴리， 마우스 (ABfront ier， AB93357), 4°C에서 1일 동안 부착을 시켰다. 1차 항체가 부착된 멤브래인 (membrane)을 TBST 완층제를 이용하여 세척을 하였고, 다음으로 2차 항체 (Goat ant i -rabbit IgG (HRP) LF-SA5002 and Goat ant i -mouse IgG (HRP) LF-SA5001_conjugated)를 1차 항체가 부착 되어있는 멤브레인에 상온에서 2시간 반웅하여 부착을 하였다. 2차 항체까지 부착이 된 멤브레인을 TBST 완충제를 사용하여 부착되지 않은 이물질을 완전히 제거 한 후 2차 항체에 부착되어있는 HRP 발색 작업 (western blot detect ion kit, ABfrontier, LF-QC0103)수행을 통해 항염증 단백질의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과， 도 6에 나타낸 바와 같이， 염증이 유도된 마우스의 조직에서 신호전달 단백질 (IL-6, TLR-4, NF-kB) 및 사이토카인 (TNF- α , IL-Ιβ)이 과 발현하는 것올 확인하였고, 각각의 농도로 서열번호 4 항균 펩타이드를 처리한 마우스군의 조직에서 상기 펩타이드 처리 농도가 증가함에 따라 염증 관련 단백질이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서， 서열번호 4 항균 펩타이드가 항 염증 억제에 강한 작용을 한다는 것을 확인하였다 (도 6).

【산업상 이용가능성】

상술한 바와 같이, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물은 탁월한 항균활성을 나타내고 용혈작용 및 세포독성이 없으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드.

【청구항 2】 _.

제 1항에 있어서， 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 3】

제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 그람 양성균， 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.

[청구항 ⁴】

제 3항에 있어서， 상기 그람 양성균은 스태필로코쿠스 아우레우스 (5 D/?y/ococ /s aureus) 및 바실리우스 서브틸리스 0¾c///i/s subtil is) ⁰Λ 것을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 5】

제 3항에 있어서, 상기 그람 음성균 ^장균 Escherichia coli) 및 슈도모나스 에루기노사 (/¾«/(¾wwas aeruginosa) 91 것을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 6】

제 3항에 있어서， 상기 항생제 내성균은 그람 양성균인 스태필로코쿠스 아우레우스 (5i<¾o/?y/oa?c « aureus) 및 그람 음성균인 슈도모나스 에루기노사 (^et/OTOTas aeruginosa)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 7】

서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펨타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.

【청구항 8】

제 7항에 있어서， 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열에서 12번째 아미노산인 페닐알라닌을 프를린으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 템타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물ᅳ

【청구항 9】

제 7항에 있어서， 상기 펩타이드는 그람 양성균， 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균 활성올 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.

【청구항 10】

제 9항에 있어서, 상기 그람 양성균은 스태필로코쿠스 아우레우스 (5 a)/?y/ococ /s aureus) 및 바실리우스 서브틸리스 0¾c/7 /s subtilis)⁰ 것을 특징으로 하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.

【청구항 11】

제 9항에 있어서， 상기 그람 음성균은 ^장균 Escherichia coli) 및 슈도모나스 에루기노사 (/¾«¾/»o?as aeruginosa)^ 것을 특징으로 하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 초성물.

【청구항 12]

제 9항에 있어서， 상기 항생제 내성균은 그람 양성균인 스태필로코쿠스 아우레우스 aureus) 및 그람 음성균인 슈도모나스 에루기노사 (/¾ec¾7½ as aeruginosa) ^ϋΛ 것을 특징으로 하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.

【청구항 13】

서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제 .

【청구항 14】

약학적으로 유효한 양의 제 1항의 항균 펩타이드 또는 제 7항의 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법.

【청구항 15】

약학적으로 유효한 양의 제 1항의 항균 펩타이드 또는 제 7항의 항균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균에 기인한 질환 예방 또는 치료 방법.

【청구항 16】

제 15항에 있어서， 상기 병원성 세균은 스태필로코쿠스 아우레우스 (S apA o ?c«/s ai/r«/s), ^^균 (Escherichia coli) , 및 슈도모나스 에루기노사 (/¾«/o as aeruginosa) 1 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 기인한 질환 예방 또는 치료 방법.

【청구항 17】

항균제로 사용하기 위한 제 1항의 펩타이드.

【청구항 18】

항균용 건강식품으로 사용하기 위한 제 1항의 펩타이드. 【청구항 19]

제 1항의 펩타이드를 항균제의 제조에 이용하는 용도. 【청구항 20】

제 1항의 펩타이드를 항균용 건강식품의 제조에 이용하는 용도.