WO2015108333A1 - Ｃｍ－ｍａ 펩타이드로부터 유래된 유사체 펩타이드 ｃｍａ３ 및 이의 용도 - Google Patents

Ｃｍ－ｍａ 펩타이드로부터 유래된 유사체 펩타이드 ｃｍａ３ 및 이의 용도 Download PDF

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박윤경
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Definitions

  • the present invention relates to novel analog antibiotic peptides derived from CM-MA peptides and their use.
  • Bacterial infection is one of the most common and deadly causes of human disease, and unfortunately the abuse of antibiotics has led to bacterial antibiotic resistance. Indeed, the rate at which bacteria are resistant to new antibiotics occurs much faster than the rate at which new antibiotic analogs are developed.
  • bacterial species such as Enterococcus faecal is, Mycobacterium tuberculosis, and Pseudomonas aeruginosa, which can pose a life threat, are known to date. Resistance to all antibiotics has been raised (Stuart B. Levy, Scientific American, 1998, 46-53). ''
  • Tolerance to antibiotics is a distinct phenomenon from resistance to antibiotics, first discovered in Pneumococcus sp. In the 1970s and providing an important clue to the mechanism of action of penicillin. 00111352 et al. , Nature, 1970, 227, 138-140). Tolerant species stop growing in the presence of the usual concentration of antibiotics but do not die as a result. Resistance is due to the fact that when antibiotics inhibit cell wall synthase, the activity of bacterial autolytic enzymes, such as autolysin, does not occur, which is why penicillin does not endogenous hydrolytic enzymes. By activation They kill bacteria and they also inhibit their activity, resulting in survival during antibiotic treatment.
  • bacteria that are resistant to antibiotics and Fighting requires the development of new antibiotics, as well as the development of new antibiotics that act independently of autolysine activity. There is also a need to provide antibiotics to effectively treat such new antibiotics for bacterial infection and inflammation.
  • bacteria can kill neighboring bacteria by synthesizing peptides or small organic molecules. These bacteriocins are structurally classified into three classes. The first is lantibiotics, the second is nonlantibiotics and the third is secreted by signal peptides (Cintas et al., J. Bad., 1998, 180 , 1988-1994). Animals including insects also produce naturally occurring peptide antibiotics (Bevins et al., Ann. Rev.
  • the first is a cysteine-rich ⁇ -sheet peptide
  • the second is an ⁇ -helical amphiphilic molecule
  • the third is a proline-rich peptide.
  • These antimicrobial peptides are known to play an important role in host defense and the innate immune system (Boman, HG, Cell, 1991, 65, 205; Boman, HG, Annu. Rev. Microbiol., 1995, 13, 61).
  • These antimicrobial peptides have various structures according to amino acid sequences. The most of these structures are cysteine residues such as the antimicrobial peptides found in the stratum and do not have cysteine residues and form an amphiphilic alpha helical. .
  • amphiphilic peptides reported to date include magainin 2 (MA), cecropin A cecropin A, CA) and melittin (ME) peptides. Cecropin-type amphiphilic peptides were first found in fruit flies, and later in silkworm pupa and small intestine of pigs. Cecropin A was reported to have high antimicrobial activity but minimal antifungal and anticancer activity (Boman , HG and Hu It mark, D., Annu. Rev.
  • An object of the present invention is to provide a novel antibiotic peptide exhibiting excellent antimicrobial activity and low cytotoxicity, synthesized from a CA-MA antibiotic peptide conjugated with cecropin A (CA) and maganin (magainin 2, MA). It is.
  • the present invention provides an antibiotic peptide consisting of an amino acid sequence having any one of the following i) to V) in the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • V) 15th amino acid is substituted with glutamine.
  • the present invention also provides an antibiotic containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition containing the antibiotic tempide as an active ingredient.
  • the present invention provides a food additive containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a feed additive containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial biopesticide containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides an antimicrobial composition for antimicrobial containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial method in a subject comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the antibiotic peptide.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the preparation of antibiotics.
  • the present invention also provides the antibiotic peptide in the preparation of a cosmetic composition. It provides use.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the manufacture of a food additive.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the preparation of a feed additive.
  • the present invention provides a use of the antibiotic peptide for the production of antimicrobial biological pesticides.
  • the present invention provides a use of the antibiotic peptide in the preparation of an anti quasi drug composition.
  • Antibiotic peptides having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 7 synthesized from a CA-MA antibiotic peptide conjugated with cecropin A (CA) and magainin (magainin 2, MA) were identified in Gram-positive and Gram-negative bacteria.
  • CA-MA antibiotic peptide conjugated with cecropin A (CA) and magainin (magainin 2, MA) were identified in Gram-positive and Gram-negative bacteria.
  • CA cecropin A
  • magainin 2, MA magainin
  • the antibiotic peptide of the present invention can be usefully used as an active ingredient of antibiotics, cosmetic compositions, food additives, feed additives and biological pesticides. have.
  • Figure 1 is a control antibiotic peptide CA-MA and experimental antibiotic peptide CMA1,
  • CMA1 CMA2
  • A CMA3
  • CMA4 CMA5
  • O CMA6
  • Figure 1B confirms the formation of the secondary structure of the peptide in 30 mM dodecyl sulfate sodium solution.
  • Figure 2 is a control antibiotic peptide CA-MA and experimental antibiotic peptadin After attaching TAMRA to the C-terminus of CMA3, the effect of E. coli was confirmed.
  • Figure 3 is a diagram confirming the destruction ability against the E. coli membrane of the control antibiotic peptide CA-MA and experimental group antibiotic peptide CMA3.
  • the present invention provides an antibiotic peptide composed of an amino acid sequence having a mutation of any one of the following i) to V) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • V) 15th amino acid is substituted with glutamine.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a CA-MA antibiotic peptide conjugated with cecropin (cecropin A, CA) and maganin (magainin 2, MA) having an affinity.
  • the antibiotic peptide is most preferably a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • the substitution may be performed to lower cytotoxicity by increasing / decreasing the electrode and to increase or maintain antimicrobial activity against gram negative bacteria and gram positive bacteria.
  • the antibiotic peptide preferably has antimicrobial activity against Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria, but is not limited thereto.
  • the Gram-negative bacteria are all Gram-negative bacteria known in the art as Gram-negative bacteria, including Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Leptospira and Rickettsia.
  • at least one selected from the group consisting of E. coli (Escherichia), Pseudomonas (Pseudomonas), and Salmonel la (Salmonel la) is more preferable, and more specifically, Escherichia coli (Escherichia col i) Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium) is one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the Gram-positive bacteria are Staphylococcus, Listeria, Staphylococcus, Corynebacterium ((: 0 ⁇ 1 1) 3 (; [ ⁇ 111), Lactobacillus Gram-positive bacteria, including the genus Lactobacillus and Bacillus, are preferably all Gram-positive bacteria known in the art.
  • Staphylococcus, Listeria and Staphylococcus It is more preferably at least one selected from the group consisting of, more specifically, the group consisting of Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Staphylococcus epidermidis It is most preferably one or more selected from, but is not limited thereto.
  • the antibiotic peptide preferably exhibits low cytotoxicity against human derived cells, but is not limited thereto.
  • the template was randomly relocated to the 13th to 17th amino acids and replaced with phenylalanine for histidine (CMA1), alanine for histidine (CMA2), and the fifth phenylalanine for lysine and 7th.
  • Lysine was substituted with histidine, and the amino acid sequence was randomly relocated from 13th to 17th, and then phenylalanine was substituted with histidine, CMA3 was substituted, and 4 leucine was substituted with histidine and 5 phenylalanine with leucine. After randomly relocating the amino acid sequence of No. 17, alanine was substituted with histidine at 17 and CMA4 was replaced with histidine at fenalalanine at 13.
  • CMA6 was designed by substituting glutamine for amino acid histidine, amino acid No. 15 of the control CA-MA antibiotic peptide, to synthesize CMA1 to CMA6 peptides consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NOS: 2 to 7. 1).
  • the inventors of the control group (CA-MA) and the experimental group (CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5, CMA6) peptides in human red blood cells (hRBC) toxicity to hemolysis and HaCaT cells As a result, when the peptide was treated with 200 yM concentration in hRBC and HaCaT cells, not only did hemolysis be induced in the experimental group compared with the control group, but also showed a significant increase in cell survival rate. It was confirmed that the CMA3 peptide was the best (see Table 4).
  • the present inventors performed a circular dichroism to confirm the secondary structure of the control and experimental antibiotic peptides, and as a result, all peptides were added in a 30 mM sodium dodecyl sulfate (SDS) solution. It was confirmed that the ⁇ -helical structure, which is a secondary structure, was shown (see FIG. 1).
  • the present inventors specifically confirmed the antimicrobial activity of the antibiotic peptide of the present invention, the control group CM ⁇ ⁇ peptide and experimental group CMA3 peptide are all located in the cell membrane of E. coli (see Fig. 2), the cell membrane of E. coli It was confirmed that a large hole was formed to show antibacterial activity (see FIG. 3).
  • the CMA 1 to CMA6 peptides which are analogue antibiotic peptides derived from the CM-MA antibiotic peptides of the present invention, exhibit strong antimicrobial activity and low cytotoxicity against human-derived cells. It can be usefully used as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antibiotic containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial method in a subject comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the antibiotic peptide.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the preparation of antibiotics.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a CA-MA antibiotic peptide conjugated with cecropin and marganinol having an affinity.
  • the antibiotic peptide is most preferably a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • the substitution may be performed to lower cytotoxicity by increasing / decreasing the electrode and to increase or maintain antimicrobial activity against gram negative bacteria and gram positive bacteria.
  • the antibiotic peptide preferably has antimicrobial activity against Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria, but is not limited thereto.
  • the Gram-negative bacteria are Gram-negative bacteria including E. coli, Pseudomonas genus, Salmonella genus, Raptospira genus, Rickettsia genus, and are all Gram-negative bacteria known in the art. More preferably any one or more selected from the group, More specifically, it is most preferably one or more selected from the group consisting of E. coli, Pseudomonas aeruginosa, and Salmonella typhimurium, but is not limited thereto.
  • the Gram-positive bacteria are all Gram-positive bacteria known in the art as Gram-positive bacteria, including the genus Staphylococcus, Listeria, Staphylococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, and Bacillus. It is more preferably at least one selected from the group consisting of the genus Staphylococcus, Lystria and Staphylococcus, more specifically Staphylococcus aureus, Listeria monocytogens and Staphylococcus epidermidis. Most preferably one or more selected from the group, but is not limited thereto.
  • the antibiotic peptide preferably exhibits low cytotoxicity against human derived cells, but is not limited thereto.
  • CMA 1 to CMA6 peptides exhibit strong antimicrobial activity and low cytotoxicity to human-derived cells, and thus, the antibiotic peptides of the present invention are effective as antibiotics. It can be usefully used as a component.
  • Peptides of the present invention can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations. Parenteral administration may refer to administration via the route of administration other than oral administration such as rectal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intranasal (nasa l), inhalation, ocular, and subcutaneous.
  • the antibiotic peptide of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
  • the antibiotic peptide of the present invention can be administered in various parenteral formulations, and when formulated, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. that are commonly used.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, Lyophilized preparations, suppositories are included.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl acrylate, etc. may be used.
  • As a base of suppositories wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, uririnji, glycerogelatin and the like can be used.
  • antibiotic peptide of the present invention can be used in combination with a variety of carriers (carrier) accepted as a drug, such as physiological saline or organic solvent, carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran to increase the stability or absorption
  • carriers such as physiological saline or organic solvent
  • carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran
  • ant ioxidants, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers such as ascorbic acid or glutathin may be used as pharmaceuticals.
  • the effective dose of the antibiotic peptide of the present invention is 1 to 2 mg / kg, preferably 0.5 to 1 mg / kg, and may be administered once to three times a day.
  • the total effective amount of the novel peptide of the present invention may be administered to the patient in a single dose by infusion or the like for a relatively short period of time, such as a bolus type assay.
  • the mult iple dose may be administered by a long term administered fract ionated treatment protocol. Since the concentration is determined by taking into consideration various factors such as the age and health of the patient as well as the route of administration and the number of treatments of the drug, in consideration of this point, the present invention is a person having ordinary skill in the art. Appropriate effective dosages for the specific uses of the novel peptides as antibiotics will be determined.
  • the present invention also provides a cosmetic composition containing the antibiotic tempide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the manufacture of a cosmetic composition.
  • the antibiotic template of the present invention can be usefully used as an active ingredient of a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition of the present invention includes components commonly used in cosmetic compositions in addition to the antibiotic peptide, and includes conventional auxiliaries such as sulfates, stabilizers, solubilizers vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • the peptide of the present invention may be added to the cosmetic composition usually contained in an amount of 0.01 to 50% by weight, preferably 1 to 10% by weight.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion (skin), nutrition lotion (milk lotion), nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder .
  • the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanta, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide. This can be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent as a carrier component Solubilizers or emulsifiers are used, such as water, ethanol, isopropane, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol,
  • the carrier component is water, ethane or liquid diluent such as propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbide esters and suspending agents such as polyoxyethylene sorbitan esters.
  • ethane or liquid diluent such as propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbide esters and suspending agents such as polyoxyethylene sorbitan esters.
  • Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tragacanta and the like can be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • the present invention also provides a food additive containing the antibiotic tempide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the manufacture of a food additive.
  • the antibiotic peptides of the present invention exhibit strong antimicrobial activity and low cytotoxicity to human-derived cells, and thus, the antibiotic peptides of the present invention are effective ingredients of food additives. It can be usefully used.
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention is used as a food additive, the peptide may be added as it is or used with other food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The amount of active ingredient depends on its purpose of use Can be determined appropriately.
  • the peptide of the present invention is used as a food additive, the peptide may be added as it is or used with other food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The amount of active ingredient depends on its purpose of use Can be determined appropriately. In general, the peptide of the present invention
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of stability, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the present invention provides a feed additive containing an antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a use of the antibiotic peptide in the preparation of a feed agent.
  • Analogue antibiotic peptides derived from CM-MA antibiotic peptides of the present invention CMA 1 to CMA6 peptides exhibit strong antimicrobial activity and low cytotoxicity to human-derived cells, so the antibiotic peptides of the present invention are active ingredients of feed additives. It can be usefully used.
  • Feed composition of the present invention replaces the existing antibiotics and inhibit the growth of harmful food pathogenic bacteria to improve the health of the animal body, improve livestock and weight gain and quality, and has an effect of increasing the milk yield and immunity.
  • Feed composition of the present invention can be prepared in the form of fermented feed, compound feed, pellet form and silage.
  • the fermented feed may be prepared by fermenting an organic material by adding various microorganisms or enzymes other than the peptide of the present invention, and the blended feed may be prepared by mixing various types of normal feed and the peptide of the present invention.
  • Pellet Form feed may be prepared by applying heat and pressure to the blended feed, etc. in a pellet machine
  • Silejja can be prepared by fermenting the green feed with the microorganism according to the present invention.
  • Wet fermented feed collects and transports organic substances such as food waste, mixes excipients for sterilization and moisture control at a certain ratio, and ferments at a temperature suitable for fermentation for more than 24 hours, so that the water content is about 70%. It can manufacture by adjusting.
  • Fermented dry irrigated feed may be prepared by adjusting the wet fermented feed to contain about 30% to 40% of water by further drying.
  • the present invention also provides an antiseptic composition containing the antibiotic peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial composition for antimicrobial containing the antibiotic ptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the antibiotic peptide for the production of antimicrobial biological pesticides.
  • the present invention provides a use of the antibiotic peptide in the manufacture of an anti quasi drug composition.
  • the antiseptic composition includes a cosmetic preservative or a pharmaceutical preservative.
  • the food preservatives, cosmetic preservatives and pharmaceutical preservatives are additives used to prevent the deterioration, decay, discoloration and chemical changes of the pharmaceutical products include fungicides and antioxidants, and inhibits the growth of microorganisms such as bacteria, bears and yeasts.
  • functional antibiotics such as inhibiting or sterilizing the growth of rot microorganisms in medicine. Ideal conditions for these preservative compositions are toxic. It should not be, and it should be effective even in small amount.
  • the extract or fraction may be added as it is, or used together with other quasi-drugs or quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use.
  • the quasi-drug composition of the present invention is not limited thereto, but preferably, a disinfectant cleaner, a shower article, a Gagrin, a wet tissue, a detergent soap hand wash, a humidifier layering agent, a mask ointment, a patch, or a filter filler can be known.
  • the inventors of the present invention describe the liquid phase solidification method of Meri f ield, RB.,
  • the peptide having a carboxyl terminus of ⁇ 2 form of the peptide designed in the present invention used Rink Amide MBHA-Resin as a starting material, and the peptide having a carboxyl terminus of 0H form a Fmoc-amino acid -Wang Resin as a starting material. It was.
  • the extension of the peptide chain by the coupling of Fmoc-amino acids was performed by DCC (-hydroxybenzo trzole (HOB t) ⁇ di eye 1 o-hexycar bod iimi de) method.
  • DCC -hydroxybenzo trzole (HOB t) ⁇ di eye 1 o-hexycar bod iimi de
  • Fmoc-amino acid at the amino terminal of each peptide After coupling, the Fmoc group was removed with NMP (20% piper idine / N-methyl pyrolidone) solution, washed several times with NMP and DCM (d ichor omethane) and dried with nitrogen gas.
  • TFA trifluoroacetic acid, phenol, thioanisole, H20 and triisopropylsilane were common at ratios of 85: 5: 5: 5: 2.5 (v / v), respectively.
  • the combined solution was added and reacted for 2 to 3 hours to remove the protecting group and to separate the peptide from the resin, followed by precipitation of the peptide with diethylether to obtain this.
  • the obtained crude peptide is a reverse phase (RP) -HPLC column (Delta Pak, C18300A, 15, 19.0 mm ⁇ 30 cm, Waters) in an acetonitrile gradient containing 0.05% TFA. , USA).
  • the present inventors measured the minimum growth concentration (MIC) value, which is the minimum concentration of the peptide that cells are not split.
  • the strains described in the following [Table 2] were purchased, cultured in medium of each composition to the mid-log phase, and then diluted to a cell concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / 100 / ⁇ microorganisms. Titrate plates (Nunc, USA) were inoculated. Then, the CMAl, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 or CMA6 peptides synthesized in ⁇ Example 1> were added to the plate by diluting 1 / 2-fold from 96 months (wel l) and then 12 hours at 37 ° C.
  • micro-titrate folate reader (Merck El isa reader, Germany) was used to measure the absorbance at a wavelength of 620 nm to determine the MIC value for each strain.
  • the parent peptide CM-MA was subjected to the same method as above to determine the MIC value for each strain.
  • Staphylococcus epidermidis CTC 3096 (Staphylococcus epidermidis)
  • CMAl, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 and CMA6 peptides showed almost similar antimicrobial activity in both Gram-negative and Gram-positive bacteria compared to the control CA-MA (Table 3).
  • the human erythrocytes are diluted with phosphate buffer solution (PBS, pH 7.0) to concentration with 83 ⁇ 4, and the CM-MA, CMAl, CMA2, CMA3, CMA4 CMA5 or CMA6 peptides synthesized in Example 1, respectively.
  • PBS phosphate buffer solution
  • CM-MA, CMAl, CMA2, CMA3, CMA4 CMA5 or CMA6 peptides synthesized in Example 1 Treated at a concentration of 12.5, 25.0 50.0, 100.0 or 200.0 ⁇ / well, it was reacted at 37 ° C for 1 hour. Then, the amount of hemoglobin contained in the supernatant obtained by centrifugation at 1,000 g was confirmed by measuring the absorbance at 414 nm wavelength.
  • Absorbance A represents the absorbance of the reaction solution treated with each peptide measured at wavelength 414 ran;
  • Absorbance B represents the absorbance of a reaction solution treated with PBS measured at a wavelength of 414 ran
  • Absorbance C shows the absorbance of the reaction solution treated with V Triton X-100 measured at a wavelength of 414 nm.
  • the CA ⁇ MA peptide the parent peptide
  • CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 or CMA6 peptides did not show a destructive ability to erythrocytes even at 200 ⁇ M concentration
  • the antibiotic peptide of the present invention confirmed that the cytotoxicity to erythrocytes is reduced compared to the parent peptide (Table 4).
  • toxicity was measured using a human keratinocyte cell line (HaCaTcelll ine, Dr. NE.Fusenig, Heidelberg, Germany). Measured.
  • a human keratinocyte cell line HaCaT cel ll ine
  • DMEM medium containing 10% FBS Fetal Bovine Serum
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the CM-MA, CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 or CMA6 peptides synthesized in Example 1 were treated at concentrations of 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 or 200.0 ⁇ / well, respectively, in a 53 ⁇ 4 C02 incubator for 24 hours. I replied.
  • Example 5 Circular Dichroism Spectrum Measurement In order to confirm whether the peptide prepared by the method of ⁇ Example 1> is induced to a secondary structure of ⁇ -helical structure was measured using a circular dichroism method (circular dichroism) method.
  • eobs represent the milligrees of the signal
  • the antimicrobial activity is similar to the control group and NH of the C-terminal region of CMA3, which is a peptide selected as having no toxicity at high concentrations.
  • Tetramethylrhodamine (TAMRA)- was attached to and confirmed by confocal microscopy.
  • TAMRA was attached to NH of the C-terminal region of CA-MA or CMA3 synthesized in Example 1, isolated, and treated with 1/2 value E. coli of minimum concentration inhibition (MIC) for 10 minutes. The reaction was carried out at ° C. After reaction, only pure E. coli was obtained using a centrifuge (4000 rpm), and the supernatant was removed. Then, 50 ⁇ l of saline (PBS) was added to remove cell aggregation, and then, the LSM510 confocal microscope was used to confirm the position of the peptide on the E. coli membrane.
  • PBS saline
  • the diluted strain was treated with CMA3 or the comparative bacterium CA-MA peptide synthesized in ⁇ Example 1> at a half MIC concentration, respectively, and then reacted at 37 ° C for 10 minutes. Then, it was added to the strain with 5% glutaraldehyde (fixed at 4 ° C) for 2 hours, washed with a buffer and then stepwise using ethanol Dehydrated. After dehydration, cr iti cal point dry and golden coating were observed on a scanning electron microscopy (SEM). As a result, as shown in FIG. 3, the CMA3 peptide was destroyed while forming a hole in the E. coli membrane, similar to the case of treating CA-MA with E. coli, showing effective antimicrobial activity (FIG. 3).
  • SEM scanning electron microscopy
  • the airtight cloth was filled to prepare a powder.
  • the peptide of the present invention was dissolved in an appropriate volume of main sodium chloride BP, and the pH of the resulting solution was adjusted to pH 7.6 using dilute hydrochloric acid BP, and the volume was adjusted and mixed well using main sodium chloride BP.
  • the solution was filled into a 5 type I ampoule of clear glass, encapsulated under an upper grid of air by dissolving the glass, and sterilized by autoclaving at 120 ° C. for at least 15 minutes to prepare an injection solution.
  • the antimicrobial softening longevity containing the tempide of the present invention can be blended as described in the following [Table 5] and can be prepared according to the manufacturing method in the conventional cosmetic field. [Table 5]
  • an antimicrobial nutrient for longevity comprising the peptide of the present invention
  • it can be formulated according to the preparation method in the conventional cosmetic field by combining as described in the following [Table 6].
  • an antibacterial essence comprising the tempide of the present invention
  • it may be blended as described in the following [Table 1] and prepared according to a manufacturing method in a conventional cosmetic field.
  • an antibacterial facial cleanser (cleansing product) containing the peptide of the present invention can be prepared according to the preparation method in the general cosmetic field by combining as described in the following [Table 8].
  • an antibacterial massage creamol containing the peptide of the present invention is prepared according to the preparation method in the general cosmetic field as described in Table 10 below.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments and preparation examples, and can be variously modified and changed by ordinary skilled persons, and can be applied to cosmetics of various uses including other color cosmetics. It can be used in the manufacture of a medicament, that is, an ointment that can be applied thinly to the human body according to its efficacy, which is included in the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims.
  • Antibiotic peptide of the present invention is excellent in antimicrobial activity and at the same time human cells Since it shows low cytotoxicity against, it can be usefully used as an active ingredient of antibiotics, cosmetic compositions, food additives, feed additives and biological pesticides.

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Abstract

본 발명은 CM-MA 펩타이드로부터 유래된 신규한 유사체 항생 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 양친화성을 갖는 세크로핀(cecropin A, CA)과 마가이닌(magainin 2, MA)을 접합한 CA-MA 항생 펩타이드를 주형으로 하여, 서열번호 2 내지 서열번호 7로 기재되는 신규한 항생 펩타이드를 합성하였고(CMA 1 내지 CMA 6), 상기 합성된 항생 펩타이드는 그람양성균 및 그람음성균에 대한 항균활성을 나타내면서 인간 적혈구세포 및 인간 정상 세포주(HaCaT)에 대하여 낮은 세포독성을 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드는 항균용 항생제, 화장료 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제 및 생물 농약의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
CM-MA 펩타이드로부터 유래된 유사체 펩타이드 CMA 3 및 이의 용도
【기술분야】
본 발명은 CM-MA 펩타이드로부터 유래된 신규한 유사체 항생 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. [배경기술】
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데， 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다. 실제로， 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면， 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecal is),마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 에투지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 1998, 46-53) . 、'
항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데， 1970년대에 뉴모코커스 (Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하 ¾다00111352 et al. , Nature, 1970， 227， 138-140) . 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데， 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydro lytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.
세균이 여러 가지 항생제에 대해 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz , Rev. Infec . Dis . , 1985, 7， 368-386) . 아울러， 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 모든 저항성을 보이는 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz , J . Infect . Di s . , 1985, 152, 365-372) , 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다. 작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두가지 경로로 이루어지는데， 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적 (phenotypic) 내성이며 (Tuotnanen E. , Revs . Infect . Dis . , 1986 , 3， S279-S291) , 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은 오토라이신 활성의 하부조절 (down regulat ion)이 일어난다는 것인데, 이러한 하부조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이며， 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것인데， 확실하지 않은 여러 가지 이유로 인해서 이러한 자살 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상적인 내성은 오토라이신의 활성을 조절함으로써 이루어진다 (Tuomanen et al . , J . infect . Dis . , 1988, 158, 36-43) .
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 세균들과 싸우기 위해서는 새로운 항생제의 개발이 필요하며， 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한， 그러한 새로운 항생제를 세균의 감염과 염증치료에 효과적으로 치료하기 위한 항생제을 제공하는 것이 필요하다. 한편， 세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데， 이러한 박테리오신 (bacteriocin)들은 구조적으로 세 부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스 (lantibiotics)이며 두 번째는 비란티바이오틱스 (nonlantibiotics)이고 세 번째는 신호 펩타이드 (signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다 (Cintas et al. , J. Bad. , 1998, 180, 1988-1994) . 곤충올 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데 (Bevins et al. , Ann. Rev. Biochem. , 1990, 59， 395-414) , 상기의 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트 (sheet) 펩타이드이고， 두 번째는 α-회전형 (helical)의 양친화성 분자이며， 세 번째는 프를린이 풍부한 (proline-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al .， Int . J. Antimicrob. Agents, 1998， 9， 269-280) . 이들 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G. , Cell, 1991, 65, 205； Boman, H. G.， Annu. Rev. Microbiol. , 1995, 13， 61). 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데， 이들 구조 중 가장 많은 것은 곤층에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다.
이러한 펩타이드 중에서도 양친화성 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며， 이를 이용해 세균에 대한 항생제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 지금까지 보고된 양친화성 펩타이드로는 마가이닌 2(magainin 2， MA), 세크로핀 A cecropin A, CA) 및 멜리틴 (melittin, ME) 펩타이드 등이 있다. 세크로핀 계열의 양친화성 펩타이드는 초파리에서 처음 발견되었고， 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은 창자에서도 발견되었는데， 세크로핀 A는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것^로 보고되었으며 (Boman, H. G. and Hu It mark, D.， Annu. Rev. Microbiol. , 1987, 41, 103), 또한 마가이닌 2 펩타이드는 세포독성이 없으면서 항균활성과 함께 항진균， 항암 및 항-원생생물 효과가 있다고 알려져 있다 (Zasloff, M. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 5449) . 아울러， 이러한 두 펩타이드의 일부 서열들을 재조합시킨 접합 펩타이드 (conjugation peptide)를 제조하여 항균 항진균 또는 항암 활성이 탁월한 새로운 합성 펩타이드를 제조할 수 있음이 알려져 있다 (Chan, H. C. , et al. , FEBS Lett. , 1989, 259, 103； Wade, D. , et al. , Int. J. Pept. Prot. Res. ,1992, 40, 429). 이에， 본 발명자들은 항균활성을 가지는 것으로 기존에 보고된 펩타이드로부터 항균활성이 증진된 신규한 합성 펩타이드를 제조하기 위하여 노력한 결과, 양친화성을 갖는 세크로핀 (cecropinA, CA)과 마가이닌 (magainin 2 MA)을 접합한 CA-MA항생 펩타이드를 주형으로 하여， 서열번호 2내지 서열번호 7로 기재되는 신규한 항생 펩타이드를 합성하였고 (CMA 1 내지 CMA 6)， 상기 합성된 항생 펩타이드는 그람양성균 및 그람음성균에 대한 항균활성을 나타내면서 인간 적혈구 및 인간 정상 세포주 (HaCaT)에 대하여 낮은 세포득성을 나타내므로, 상기 합성된 항생 펩타이드는 항생제, 화장료 조성물， 식품 첨가제, 사료 첨가제， 생물 농약 및 의약외품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 세크로핀 (cecropin A, CA)과 마가이닌 (magainin 2， MA)을 접합한 CA-MA 항생 펩타이드로부터 합성된， 우수한 항균활성 및 낮은 세포독성을 나타내는 신규한 항생 펩타이드를 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법]
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 i )내지 V)중 어느 하나의 변이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 제공한다:
i ) 4 번째 아미노산이 히스티딘으로 치환;
i i ) 5 번째 아미노산이 라이신 또는 루이신으로 치환;
i i i ) 7 번째 아미노산이 히스티딘으로 치환
iv) 13 번째 내지 17 번째 아미노산의 순서를 변경할 후， 이들 아미노산 중 하나의 아미노산이 히스티딘으로 치환; 및
V) 15 번째 아미노산이 글루타민으로 치환.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.
또한， 본 발망은 상기 항생 템타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제를 제공한다. ,
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항생 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 항생제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 화장료 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 식품 첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 사료 첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 항균용 생물 농약의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
아을러， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 항균용 의약외품 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
세크로핀 ( cecropin A , CA)과 마가이닌 (magainin 2， MA)을 접합한 CA-MA 항생 펩타이드로부터 합성된 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드는 그람양성균 및 그람음성균에 대하여 우수항 항균활성을 나타내고， 인간 적혈구 및 인간 정상세포주에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 본 발명의 항생 펩타이드는 항생제， 화장료 조성물， 식품 첨가제 , 사료 첨가제 및 생물 농약의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 대조군 항생 펩타이드인 CA-MA 및 실험군 항생 펩타이드인 CMA1 ,
CMA2 , CMA3 , CMA4 , CMA5 및 CMA6의 2차 구초 형성 여부를 확인한 도이다;
國은 CMA1 , ᄆ은 CMA2 , A은 CMA3 , ᅀ은 CMA4 , 暴은 CMA5 , 및 O은 CMA6임;
도 1A는 10 mM 인산 나트륨 용액에서 상기 펩타이드의 2차 구조 형성 여부를 확인함; 및
도 1B는 30 mM 황산 도데실 나트륨 용액에서 상기 펩타이드의 2차 구조 형성 여부를 확인함.
도 2는 대조군 항생 펩타이드인 CA-MA 및 실험군 항생 펩타아드인 CMA3의 C-말단에 TAMRA를 부착한 후 대장균에 처라하여 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 3은 대조군 항생 펩타이드인 CA-MA 및 실험군 항생 펩타이드인 CMA3의 대장균 막에 대한 파괴능을 확인한 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 i ) 내지 V) 중 어느 하나의 변이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 제공한다.
i ) 4 번째 아미노산이 히스티딘으로 치환;
i i ) 5 번째 아미노산이 라이신 또는 루이신으로 치환;
i i i ) 7 번째 아미노산이 히스티딘으로 치환
iv) 13 번째 내지 17 번째 아미노산의 순서를 변경할 후, 이들 아미노산 중 하나의 아미노산이 히스티딘으로 치환; 및
V) 15 번째 아미노산이 글루타민으로 치환.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 양친화성을 갖는 세크로핀 (cecropin A, CA)과 마가이닌 (magainin 2 , MA)올 접합한 CA-MA 항생 펩타이드이다.
상기 항생 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기 치환은 전극의 증 /감을 이용하여 세포독성을 낮추며， 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 항균활성을 증가 또는 유지하기 위해 수행될 수 있다.
상기 합성올 위한 방법으로 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법 (W. H. Freeman and Co. , Proteins ; structures and molecular pr inciples , 1983)으로 합성하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 액상 고상법 (Solut ion Phase Pept ide synthesis) , 고상 고상법 (sol idᅳ: phase pept ide syntheses) , 단편 웅축법 및 F-moc 또는 T-B0C 화학법으로 합성하는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로는 액상 고상법 (Merrifield, RB. , J.Am. Chem. Soc. , 85, 2149, 196)으로 합성하는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 항생 펩타이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대해 항균 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 음성균은 대장균 속 (Escherichia), 슈도모나스 속 (Pseudomonas), 살모넬라 속 (Salmonella)， 랩토스피라 속 (Leptospira) , 리케치아 속 (Rickettsia)올 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하몌 구체적으로 대장균 속 (Escherichia), 슈도모나스 속 (Pseudomonas) 및 살모넬라 속 (Salmonel la)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 대장균 (Escherichia col i ) , 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimur ium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속 (Staphylococcus), 리스테리아 속 (Listeria), 스타필로코커스 속 (Staphylococcus)， 코리네박테리움 속((：0^1 1)3(；【^^111) , 락토바실러스 속 (Lactobacillus) 및 바실러스 속 (Bacillus)을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하몌 구체적으로 스타필로코커스 속 (Staphylococcus), 리스테리아 속 (Listeria) 및 스타필로코커스 속 (Staphylococcus)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes) 및 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 양친화성을 갖는 세크로핀 (cecropinA, CA)과 마가이닌 (magainin 2， MA)을 접합하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CA-MA 항생펩타이드를 합성하였다. 또한， 이를 주형으로 하여 13 번째 내지 17 번째 아미노산을 무작위로 위치를 변화한 후 펜닐알라린을 히스티딘으로 (CMA1), 알라닌을 히스티딘으로 치환하였으며 (CMA2), 또한 5 번째의 페닐알라닌을 라이신과 7 번째 라이신을 히스티딘으로 치환하였으며， 13 번째 내지 17 번째에 아미노산 서열을 무작위로 위치를 변환 후 페닐알라닌을 히스티딘으로 치환하여 CMA3으로， 그리고 4번의 루이신을 히스티딘과 5번의 페닐알라닌을 루이신으로 치환하였고， 13번에서 17번의 아미노산 서열을 무작위로 위치를 변환 후 17번에 알라닌을 히스티딘으로 치환하여 CMA4로， 13번에 펜닐알라닌을 히스티딘으로 치환하여 CMA5로 설계하였다. 또한 대조군인 CA-MA 항생펩타이드의 15번 아미노산인 히스티딘을 글루타민으로 치환하여 CMA6을 설계함으로써， 서열번호 2 내지 서열번호 7로 기재되는 아口ᅵ노산 서열로 구성된 CMA1 내지 CMA6 펩타이드를 합성하였다 (표 1 참조).
또한， 본 발명자들은 상기 합성한 CA-MA항생 펩타이드 및 실험군인 CMA1,
CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 및 CMA6가 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 나타내는 항균 활성을 확인한 결과， 실험군 펩타이드가 CA-MA 펩타이드와 거의 유사한 최소농도억제 (MIC)값을 나타내는 것을 확인하였다 (표 2 및 표 3 참조). 또한， 본 발명자들은 대조군 (CA-MA)과 실험군 (CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5, CMA6)의 펩타이드를.인간 적혈구세포 (human red blood cell, hRBC)에서 용혈작용여부와 HaCaT세포에서 독성여부를 확인한 결과， hRBC 및 HaCaT 세포에 200 yM 농도의 펩타이드를 처리하였을 때， 대조군에 비해 실험군에서 용혈작용이 유발되지 않았을 뿐만 아니라， 세포 생존율이 현저하게 상승하는 효과를 나타내는 것을 확인하였고，실험군 중에서 CMA3펩타이드가 가장 우수한 것을 확인하였다 (표 4 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 대조군 및 실험군 항생 펩타이드의 2차 구조를 확인하기 위하여 원이색법 (circular dichroism)을 수행한 결과, 30 mM 황산 도데실 나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에서 모든 펩타이드가 2차 구조인 α -나선형 구조를 나타내는 것을 확인하였다 (도 1 참조) .
또한， 본 발명자들은 본 발명의 항생 펩타이드가 나타내는 항균 활성을 구체적으로 확인한 결과， 상기 대조군인 CMᅳ ΜΑ 펩타이드 및 실험군인 CMA3 펩타이드는 모두 대장균의 세포막에 위치하여 (도 2 참조)， 대장균의 세포막에 큰 구멍을 형성하여 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3 참조) .
따라서， 본 발명의 CM-MA 항생 펩타이드로부터 유래된 유사체 항생 펩타이드인 CMA 1 내지 CMA6 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서， 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 본 발명와 항생 펩타이드는 항균용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항생 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 항생제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 양친화성을 갖는 세크로핀과 마가이닌올 접합한 CA-MA항생 펩타이드이다. 상기 항생 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기 치환은 전극의 증 /감을 이용하여 세포독성을 낮추며， 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 항균활성을 증가 또는 유지하기 위해 수행될 수 있다.
상기 항생 펩타이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대해 항균 활성을 갖는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 음성균은대장균 속, 슈도모나스 속, 살모넬라 속， 랩토스피라 속， 리케치아 속을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며， 구체적으로 대장균 속, 슈도모나스 속 및 살모넬라 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 대장균， 슈도모나스 에루지노사 및 살모넬라 타이피뮤리움으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다 .
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속, 리스테리아 속， 스타필로코커스 속， 코리네박테리움 속, 락토바실러스 속 및 바실러스 속을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하며 , 구체적으로 스타필로코커스 속， 리스꿰리아 속 및 스타필로코커스 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스， 리스테리아 모노사이토젠스 및 스타필로코커스 에피더미디스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 항생 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 CM-MA 항생 펩타이드로부터 유래된 유사체 항생 펩타이드인 CMA 1 내지 CMA6 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서， 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 본 발명의 항생 펩타이드는 항균용 항생제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장， 정맥， 복막， 근육， 동맥, 경피， 비강 (nasal ) , 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항생 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우， 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
즉， 본 발명의 항생 펩타이드는 실제의 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제， 결합제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수용성제, 현탁제， 유제， 동결건조제제， 좌제가 포함된다. 비수용성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸을레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골， 트읜 (tween) 61 , 카카오지, 리우린지， 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한， 본 발명의 항생 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체 (carr ier)와 흔합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스， 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트， 아스코르브 산 (ascorbic acid) 또는 글루타치은과 같은 황산화제 (ant ioxidants) , 킬레이트화제 (chelat ing agents) , 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabi l izers)들이 약제로 사용 ¾ 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 mg/kg이고， 바람직하게는 0.5 내지는 1 mg/kg 이며， 하루 1 회 내지 3 회 투여될 수 있다. 본 발명의 항생제에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 총 유효량은 볼루스 (bolus)형태 흑은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입 ( infusion)등에 의해 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mul t iple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 ( fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때， 이 분야의 통상적인 지식올 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 항생제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항생 템타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 화장료 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 CM-MA 항생 펩타이드로부터 유래된 유사체 항생 펩타이드인 CMA 1 내지 CMA6 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서， 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항생 템타이드는 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 상기 항생 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며， 예켠대 황산화제， 안정화제， 용해화제 비타민， 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제， 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0. 1 내지 50 중량 %， 바람직하게는 1 내지 10 중량 %의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며， 예를 들어, 용액， 현탁액, 유탁액， 페이스트， 겔， 크림， 로션， 파우더, 비누, 계면활성제—함유 클렌징, 오일， 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 (스킨) , 영양 화장수 (밀크로션)， 영양 크림 , 맛사지 크림， 에센스, 아이크림， 클렌징 크림， 클렌징 포음, 클렌징 워터, 팩， 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트， 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유， 식물성 유, 왁스， 파라핀， 전분， 트라가칸타， 셀를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트, 실리카， 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스， 탈크, 실리카， 알루미늄 히드록시드， 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본， 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매， 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고， 예컨대 물， 에탄올, 이소프로판을， 에틸 카보네이트， 에틸 아세테이트， 벤질 알코을， 벤질 벤조에이트， 프로필렌글리콜，
1 , 3-부틸글리콜 오일， 글리세롤 지방족 에스테르， 폴뫼에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물， 에탄을 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제， 에특실화 이소스테아릴 알코올， 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소 결정성 셀를로오스, 알루미늄 메타히드록시드， 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코을 설페이트， 지방족 알코올 에테르 설페이트， 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트， 이미다졸리늄 유도체， 메틸타우레이트， 사르코시네이트， 지방산 아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인， 지방족 알코올， 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄을아미드， 식물성 유， 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 항생 템타이드를 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 식품 첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 CM-MA 항생 펩타이드로부터 유래된 유사체 항생 펩타이드인 CMA 1 내지 CMA6 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서， 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 본 발명의 항생 펩타이드는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우， 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 흔합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 펩타이드는 원료에 대하여
15 중량부이하， 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나， 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며， 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류， 소시지， 빵， 쵸코렛， 캔디류， 스넥류, 과자류， 피자， 라면，기타 면류，껌류，아이스크림류를 포함한 낙농제품，각종스프，음료수,차， 드링크제， 알코을 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 또한， 본 발명은 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 사료 참가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 CM-MA 항생 펩타이드로부터 유래된 유사체 항생 펩타이드인 CMA 1 내지 CMA6 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서， 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 본 발명의 항생 펩타이드는 사료 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고， 가축와 증체량과 육질을 개선시키며， 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료， 배합사료， 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며， 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 흔합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레자는 청예사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물올 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후， 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여 , 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 방부 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 항생 핍타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다 .
또한， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 항균용 생물 농약의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
아울러， 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 항균용 의약외품 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 CM-MA 항생 펩타이드로부터 유래된 유사체 항생 펩타이드인 CMA 1 내지 CMA6 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서， 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 본 발명의 항생 펩타이드는 항균용 생물 농약， 방부 조성물 및 의약외품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 방부 조성물에는 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제， 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 의약품의 변질， 부패， 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제， 산화방지제가 이에 포함되며 세균 곰광이， 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며 , 미량으로도 효과가 있어야 한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우， 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 흔합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제， 샤워품， 가그린， 물티슈， 세제비누ᅳ 핸드워시, 가습기 층진제， 마스크 연고제， 패치， 또는 필터 충진제알수 있다. 이하ᅳ 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>펩타이드의 합성 및 분리정제
본 발명자들은 메리필드 (Merr i f ield)의 액상 고상법 (Merri f ield, RB.，
J .Am. Chem. Soc . , 85, 2149, 196)에 따라， 모체 펩타이드인 CA-MA로 기재된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에 4번을 히스티딘으로， 5번을 라이신과 루이신 그리고 7번에 히스티딘으로 치환하였으몌 13번에서 17번에 아미노산을 무작위로 위치를 변환 후 히스티딘으로 치환하였다. 또한 CA-MA로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드에 15번을 그루타민으로 치환하여 합성을 하였다 (표 1) .
구체적으로 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실 말단이 ΝΗ2형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며， 카르복실 말단이 0H 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산 -Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.
Fmoc-아미노산의 커플링 (coupl ing)에 의한 펩타이드 사슬 (chain)의 연장은 DCC ( -hydr oxybenzo tr i zole( HOB t )一 d i eye 1 o-hexycar bod i i m i de )법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc—아미노산을 커플링 (coupling) 시킨 후, NMP(20% piper idine/N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(d ichor omethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA trifluoroacetic acid), 페놀 (phenol), 싸이오아니졸 (thioanisole), H20 및 트리이소프로필실레인 (triisopropylsilane)을 각각 85： 5： 5： 2.5： 2.5(v/v)의 비율로 흔합한 용액을 가하고 2 내지 3 시간 동안 반웅시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후， 디에틸에테르 (diethylether)로 펩타이드를 침전하여 이를 수득하였다. 상기 수득한 크루드 (crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배 (acetonitrile gradient)에서 정제형 역상 (reverse phase, RP)-HPLC 컬럼 (Delta Pak, C18300A,15,19.0 mmX30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HC1로 110°C에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02 N HC1에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정한 후， 펩타이드의 순도 및 분자량을 확인하기 위하여 MALDI질량 분석법 (Hill, et al ., Ra id Commun. Mass Spectrometry, 5： 395, 1991)을 수행하였다.
그 결과， 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같이， 서열번호 1 내지 서열번호 7로 기재되는 아미노산을 나타내는 펩타이드를 95¾ 이상의 순도로 합성하였고， 이의 분자량은 예상한 분자량과 동일한 분자량올 나타내는 것을 확인하였다 (표 1).
【표 1】
본 발명에서 합성한 펩타이드의 서열， 분자량 및 보유 시간
펩타이드 아미노산 서열 서열번호 분자량 보유 시간
명칭
CA-MA KWKLFK I GIG FLHSAKKF-NH2 서열번호 1 2401.0 23.6
CMA1 WKLFK IGIGKHFLSA F-NH2 서열번호 2 2402.2 20.9
CMA2 W LF KIGIG FLSAHK F-NH2 서열번호 3 2404.2 22.3
CMA3 W LK HIGIG HFLSAKKF-NH2 서열번호 4 2393.2 17.8
CMA4 WKHL KIGIGKFLSAHK F-NH2 서열번호 5 2390.8 79.1
CMA5 W HL IGIGKHFLSAK F-NH2 서열번호 6 2392.6 17.6
Figure imgf000020_0001
<실시예 2>항균 활성 측정
본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 항균 활성을 비교하기 위하여， 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도 (MIC) 값을 측정하였다.
구체적으로, 하기 [표 2]에 기재된 균주를 구입하여， 각각의 조성의 배지에서 중간 -로그 상 (mid- log phase)까지 배양한 다음, 5x 105세포 /100 /^의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트 (Nunc , USA)에 접종하였다. 그런 다음， 상기 <실시예 1>에서 합성한 CMAl , CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 또는 CMA6 펩타이드를 각각 96 월 (wel l )로부터 1/2배씩 회석하여 플레이트에 첨가한 후 37°C에서 12시간 동안 배양하였 il , 마이크로 타이트레이트 폴레이트 판독기 (Merck El isa reader , 독일)를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주에 대한 MIC 값을 결정하였다. 대조군으로는， 모체 펩타이드인 CM-MA를 상기와 동일한 방법을 수행하여 각 균주에 대한 MIC 값을 결정하였다.
[표 2】
본 발명에서 사용한 균주 및 이의 입수처
구분 균주명 출처 기탁번호 그람 음성균 대장균 미국 세포주은행 ATCC 19115
{Escherichia coli)
슈도모나스 에루지노사 미국 세포주은행 ATCC 15692 (Pseudo onas aeruginosa)
살모넬라 타이피뮤리움 한국 세포주은행 TCC 1926 { Salmonella typhi murium)
그람양성균 스타필로코커스 아우레우스 미국 세포주은행 ATCC 25923
( Staphylococcus aureus)
리스테리아 모노사이토젠스 미국 세포주은행 ATCC 19115 {Listeria monocytogenes)
스타필로코커스 에피더미디스 한국 세포주은행 CTC 3096 ( Staphylococcus epidermidis) 그 결과， 하기 [표 3]에서 나타난 바와 같이 CMAl, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 및 CMA6 펩타이드는 대조군인 CA-MA에 비해 그람 음성균 및 그람 양성균 모두에서 거의 유사한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다 (표 3).
【표 3】
그람 음성균 및 그람 양성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성
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<실시예 3>용혈 활성 측정
상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 세포독성을 비교하기 위하여， 합성한 펩타이드들의 적혈구 용혈 활성을 측정하였다.
구체적으로， 인간 적혈구를 8¾와농도가 되도록 인산염 완충용액 (PBS, pH 7.0)으로 희석하고，상기 <실시예 1<에서 합성한 CM-MA, CMAl, CMA2, CMA3, CMA4 CMA5또는 CMA6 펩타이드를 각각 12.5, 25.0 50.0, 100.0또는 200.0 μΜ/웰의 농도로 처리하여， 37°C에서 1 시간 동안 반웅하였다. 그런 다음， 1,000 g로 원심 분리하여 수득한 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 량을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 세포 파괴 정도의 기준이 되는 대조군으로， 1% 트리톤 X-100(sigma, USA)을 처리하여 37°C에서 1 시간 동안 반웅한 후 수득한 상등액의 흡광도를 측정하였고， 트리톤 X-100와 적혈구 용혈활성을 100%로 하여， 하기 [수학식 1 ]을 사용하여 상기 펩타이드의 용혈활성을 계산하였다.
Figure imgf000022_0001
(상기 식에 있어세
흡광도 A는 414 ran 파장에서 측정한 각 펩타이드를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타내며;
흡광도 B는 414 ran 파장에서 측정한 PBS를 처리한 반웅 용액의 흡광도를 나타내며; 및
흡광도 C는 414 nm 파장에서 측정한 V 트리톤 X— 100를 처리한 반웅 용액의 흡광도를 나타낸다. ) 그 결과， 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이 모체 펩타이드인 CAᅳ MA 펩타이드는 200 μ Μ 농도를 처리하였을 때 인간 적혈구에 대하여 6%의 용혈작용이 유발되는 것을 확인한 것에 비해， CM-MA , CMA1 , CMA2 , CMA3 , CMA4 , CMA5 또는 CMA6 펩타이드는 200 μ Μ 농도에서도 적혈구에 대한 파괴능을 나타내지 않는 것을 확인하여， 본 발명의 항생 펩타이드는 모체 펩타이드에 비해 적혈구에 대한 세포독성이 감소하는 것을 확인하였다 (표 4) .
【표 4】
항생 펩타이드의 용혈 활성 측정
펩타이드
% 적혈구 파괴능 (각 펩타이드 농도, μΜ)
명칭
200 100 50 25 12.5
CA-MA 6 2 1 0 0
CMA1 0 0 0 0 0 CMA2 0 0 0 0 0
CMA3. 0 0 0 0 0
CMA4 0 0 0 0 0
CMA5 0 0 0 0 0
CMA6 0 0 0 0 0
<실시예 4 정상세포주에서 세포독성 확인
상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드들의 정상 세포주에서의 세포독성올 확인하기 위해， 사람의 각질 형성 세포주 (HaCaT cel l l ine, Dr . NE. Fusenig, Heidelberg, Germany)을 이용하여 독성을 측정하였다.
구체적으로， 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM배지에서 배양된 사람의 각질 형성 세포주 (HaCaT cel l l ine)를 3 X 103씩 96 웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후， 상기 <실시예 1<에서 합성한 CM-MA, CMA1 , CMA2, CMA3 , CMA4 , CMA5또는 CMA6펩타이드를 각각 12.5， 25.0, 50.0, 100.0또는 200.0 μ Μ/웰의 농도로 처리하여， 24 시간 동안 5¾ C02인큐베이터에서 반웅하였다. 배양 후， 인산 완충액 생리식염수 (phosphate buffered sal ine; PBS)에 5 mg/ml MTTCThiazolyl Blue Tetrazol ium Bromide)를 녹인 반웅 용액 20 ul를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반웅하였다. 그런 다음，상층액을 제거하고， 200 ul의 DMS0를 넣어 형성된 MTT 크리스탈을 녹여， 560 nm에서 파장을 확인하여 세포 생존능을 확인하였다.
그 결과， 하기 [표 5]에서 나타난 바와 같이 200 μ Μ 모체 CM-MA 펩타이드를 처리했을 때， HaCaT 세포는 1.4%의 세포 생존력을 나타내어 CM-MA 펩타이드가 매우 높은 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 반해， CMA1 , CMA4 및 CMA5 펩타이드는 각각 51.1%, 64.5% 및 78.9%의 세포 생존력을 나타내어 낮은 세포 독성을 가지는 것을 확인하였고， 특히 CMA3펩타이드는 200 μ Μ 농도에서 92.4%의 세포 생존력올 나타내므로， 대조군인 CA-MA 펩타이드에 비해 세포 독성올 거의 보이지 않는 것을 확인하였다 (표 5) .
<실시예 5>원이색법 스펙트럼 측정 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 2차 구조인 α-나선형 구조를 유도하는지 확인하고자 원이색법 (circular dichroism)방법을 이용하여 측정하였다.
구체적으로， 10 mM인산나트륨 (sodium phosphate, pH 7.4)또는 30 mM황산 도데실 나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에 상기 <실시예 1>에서 합성한 CM-MA, CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMA5 또는 CMA6 펩타이드를 30 μΜ로 첨가하껴 0.1 cm 길이 (paht-length)의 셀에 가한 후， jasco 810 분광광도계 (spectrophotometer)에 은도를 25°C로 고정하여 원이색법 스펙트럼을 측정하였다. 상기 원이색법 스펙트럼올 위한 α-나선형 구조 계산식은 하기 [수학식 2]를 사용하였다.
【수학식 2】
Figure imgf000024_0001
(상기 식에 있어서，
eobs는 신호의 밀리도 (milidegrees)를 나타내며;
1은 셀 크기 (cm)의 광학 길이 (optical path-length)를 나타내고; 및 c는 첨가한 펩타이드의 농도 (mol/« )를 나타낸다.) 그 결과， 도 1에서 나타난 바와 같이 10 mM 인산나트륨 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 구조를 형성하지 않은 반면， 30 mM SDS 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 정도의 차이를 보이지만 모든 펩타이드에서 2차 구조인 α-나선형 구조를 형성하는 것을 통해， 본 발명의 항생 펩타이드는 미생물인 박테리아 막과 유사한 황상 도데실 나트륨 상에서 α-나선형 구조를 형성하는 것을 확인하였다 (도 1). <실시예 6>공초점 (confocal) 현미경 측정
상기 <실시예 1>의 방법으로 제조된 펩타이드의 대장균 막에 작용 여부를 확인하기 위하여 , 항균활성이 대조군과 유사하며 높은 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 선별된 펩타이드인 CMA3의 C-말단 부위의 NH에 테트라메틸로다민 ( tetramethylrhodamine , TAMRA)-를 부착하여 공초점 (confocal ) 현미경을 이용하여 확인하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 1>에서 합성한 CA-MA 또는 CMA3의 C-말단 부위의 NH에 TAMRA를 부착하여 분리하고 최소농도 억제 (MIC)의 1/2 값올 대장균에 처리한 후 10 분간 37°C에서 반웅을 하였다. 반웅 후， 순수 대장균만을 원심분리기 (4000 rpm)를 이용해 수득하고， 상층액을 제거하였다. 그런 다음， 생리식염수 (PBS) 50 μ ΐ를 첨가하여 세포의 뭉침 현상을 제거한 후 LSM510 공초점 현미경을 이용하여 대장균 막에서 펩타이드의 위치를 확인하였다.
ᅳ 그 결과， 도 2에서 나타난 바와 같이 TAMRA가 부착된 CMA3 및 CM-MA 펩타이드 모두 대장균 막에 위치하여 나타나는 것을 확인하였다 (도 2) .
<실시예 7 항생 펩타이드가 대장균에 미치는 효과 탐침
본 발명의 합성 펩타이드가 항균활성을 나타내는 정도를 구체적으로 확인하기 위하여, CMA3 합성 펩타이드가 대장균 막을 용해하는 것을 주사전자현미경 ( scanning electron mi croscopy, SEM)을 통해 획:인하였다. - 구체적으로， 대장균을 LB배지 ( 1%박토 트립톤， 0.5%박토 이스트 '추출물， 1% 염화나트륨)에서 중간 -로그 상 (mid-log phase)까지 배양한 다음, 100 mM 염화나트륨 (NaCl )을 포함하는 10 mM 농도의 인산나트륨 완충용액 (Na-phosphate buf fer , pH 7.4)에 108 세포 A 균체 농도로 희석하였다. 상기 희석한 균주에 상기 <실시예 1>에서 합성한 CMA3 또는 비교균인 CA-MA 펩타이드를 각각 1/2 MIC농도로 처리한 후 37°C에서 10 분간 반웅올 유발하였다. 그런 다음， 5% 글루타르알데히드 (glutar aldehyde)를 이용해 상기 균주에 첨가하여 4°C에서 2 시간동안 고정하고， 완충제로 세척을 실시한 후 에탄올을 이용해 단계적으로 탈수시켰다. 탈수 후， 인계점건조 (cr i t i cal point dry)를 하고 골든 코팅을 실시하여 주사전자현미경 (scanning electron mi croscopy, SEM)에서 관찰하였다. 그 결과， 도 3에서 나타난 바와 같이 CA-MA를 대장균에 처리한 경우와 유사하게 CMA3 펩타이드가 대장균 막에 구멍을 형성하면서 파괴하여， 효과적인 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3) . 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1>산제의 제조
본 발명의 펩타이드 20 mg
유당 20 mg
상기의 성분을 흔합한 후， 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2>정제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
r그 r ^r 100 nig
유 당 100 nig
스테아린산 마그네슘 2 nig
상기의 성분을 흔합한 후, 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡술제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 nig
결정성 셀를로오스 3 nig
락토오스 14.8 mg
스테아린산 마그네슘 0.2 nig
상기의 성분을 흔합한 후， 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 액제의 제조
본 발명의 펩타이드
이성화당
만니틀
정제수
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 꿰몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 흔합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
<1-5>주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 ! g/n
묽은 염산 BP H 7.6로 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1 m
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 펩타이드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고， 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 흔합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 타입 I 앰플 중에 충전시키고， 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고， 120°C에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<제조예 2> 화장품의 제조
<2-1>유연화장수 (스킨)
본 발명의 템타이드를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 [표 5]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다. 【표 5]
Figure imgf000028_0001
<2-2> 영양화장수 (로션)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 [표 6]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라쎄조할 수 있다.
【표 6】
Figure imgf000028_0002
<2-3> 에센스 본 발명의 템타이드를 포함하는 항균용 에센스를 제조하기 위해 하기 [표 기에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
【표 7]
Figure imgf000029_0001
<2-4>세안제 (클렌징품)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 세안제 (클렌징품)를 제조하기 하기 [표 8]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
【표 8】
성분 함량 (중량 «
본 발명의 템타이드 0. 1 ~ 30 %
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
P0E( 15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 0.2
Figure imgf000030_0001
<2-5>영양크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양크림을 제조하기
[표 9]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 ¾ 따라 제조한다.
【표 9】
배합성분 함량 (중량 ¾)
본 발명의 펩타이드 0. 1 ~ 30 %
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0 .
폴리솔베이트 60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄을아민 0.5
산탄검 0.5
토코페닐아세테이트 0. 1
향， 방부제 미량 .
정제수 To 100
<2-6>마사지크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 마사지크림올 제조하기 위해 하기 [표 10]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
【표 10]
배합성분 함량 (중량 %)
본 발명의 펩타이드 0. 1 - 30 %
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄을아민 0.5
밀납 2.0 토코페닐아세테이트 0. 1
폴리솔베이트 60 3.0
솔비탄세스퀴올레이트 2.5
세테아릴알코올 2.0
유동파라핀 30.0
산탄검 0.5
향, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-7>팩
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 팩을 제조하기 위해 하기 [표
11]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다. 【표 11】
Figure imgf000031_0001
이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예 및 제조예들에 의해 한정되지 않고， 통상의 기술자돌에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져을 수 있으며, 그외의 색채 화장품을 포함하는 다양한 용도의 화장품에 적용될 수 있는 것이고， 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉， 연고로 제조에 이용될 수 있고， 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.
【산업상 이용가능성】
본 발명의 항생 펩타이드는 우수한 항균활성과 동시에 인간 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로， 항생제, 화장료 조성물， 식품 첨가제， 사료 첨가제 및 생물 농약의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

[청구의 범위】
【청구항 11
서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 i)내지 V)중 어느 하나의 변이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드:
i) 4번째 아미노산이 히스티딘으로 치환;
ii) 5 번째 아미노산이 라이신 또는 루이신으로 치환;
iii) 7 번째 아미노산이 히스티딘으로 치환
iv) 13 번째 내지 17 번째 아미노산의 순서를 변경할 후， 이들 아미노산 중 하나의 아미노산이 히스티딘으로 치환; 및
V) 15번째 아미노산이 글루타민으로 치환.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 항생 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
[청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 항생 펩타이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대해 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
【청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 그람 음성균은 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhi murium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
【청구항 5】
제 3항에 있어서, 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토젠스 (Listeria monocytogenes) 및 스타필로코커스 에괴더미디스 (Staphylococcus epidermidi s)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 항생 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
【청구항 7】
제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
【청구항 8]
제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
【청구항 9】
제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제.
【청구항 10】
제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.
【청구항 11】
제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약.
【청구항 12】
제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물.
【청구항 13] 약학적으로 유효한 양의 제 1항의 항생 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 항균 방법.
【청구항 14]
제 1항의 항생 펩타이드를 항생제의 제조에 이용하는 용도.
【청구항 15】
제 1항의 항생 펩타이드를 화장료 조성물의 제조에 이용하는 용도.
【청구항 16】
제 1항의 항생 펩타이드를 식품 첨가제의 제조에 이용하는 용도.
【청구항 17】
제 1항의 항생 펩타아드를 사료 첨가제의 제조에 이용하는 용도.
【청구항 18】
제 1항의 항생 펩타이드를 항균용 생물 농약의 제조에 이용하는 용도. [청구항 19】
제 1항의 항생 펩타이드를 항균용 의약외품 조성물의 제조에 이용하는 용도.
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