KR20110092501A - 하이브리드 항균 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

하이브리드 항균 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이브리드 항균 펩타이드 HAN18 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 HAN18 펩타이드는 박테리아 및 곰팡이에 대해 강력한 성장억제능을 가지고, 이들의 N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들도 강력한 미생물 성장 억제 활성을 가진다. 또한, 본 발명의 HAN18 펩타이드 및 N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들은 암세포에 대해 강력한 세포독성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 강력한 항균, 항진균 및 항암 효능을 가져 다양한 분야(예컨대, 의약, 의약외품, 생물살균제, 등)에 매우 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

하이브리드 항균 펩타이드 및 이의 용도{Hybrid Antimicrobial Peptides and Uses Thereof}
본 발명은 하이브리드 항균 펩타이드 HAN18 및 이의 용도에 관한 것이다.
항균 펩타이드(Antimicrobial peptides)는 숙주 방어 시스템에 중요한 인자들 중 하나이다. 항균 펩타이드는 미생물에 대한 폭넓은 스펙트럼 활성을 가지며 진핵세포에서 숙주 방어에 중요한 기능을 수행한다. 항균 펩타이드는 모든 클래스의 생명체(예컨대, 포유동물, 양서류, 곤충, 등)에서 발견되어졌는데(1-3), 이는 항균 펩타이드가 진화적으로 선천성 면역 반응의 보존성 구성성분일 수 있다는 것을 의미한다. 항균 펩타이드의 타겟에 있어서, 원핵세포와 진핵세포 간의 기본적 차이점이 존재할 수 있다. 이러한 항균 펩타이드는 신규한 치료제로서 강력하고 광범위한 스펙트럼을 가진 항생제이다(4).
한편, 항균 펩타이드는 독특하고 다양한 그룹의 분자들로, 그들의 아미노산 조성 및 구조에 따라 서브그룹들로 분류된다(5). 항균 펩타이드는 길이, 전체적인 전하량 및 형태(conformation)의 측면에서 매우 다양하지만, 그들 대부분은 양이온 및 양친매성을 가진다(6). 일반적으로, 향균 펩타이드는 10-40 아미노산 길이로 짧으며, 다음의 2차 구조에 따라 임의적으로 분류될 수 있다: α-헬리스(helice), β-쉬트(sheet), 연장된 헬리스 및 루프. 이들 펩타이드는 산성 조건(environments)에서 두 개 이상의 양성-전하를 띠는 잔기들(아르기닌, 라이신 또는 히스티딘)을 포함하고 많은 소수성 잔기들(일반적으로 >50%)을 가진다(7-9). 진화적으로 보존된 항균 펩타이드들은 통상적으로 양성 전하를 가지며, 소수성 및 친수성 부위(side)를 모두 가져 수용 환경에서 용해될 수 있고 지질-풍부 막에도 용해될 수 있다(10).
천연에서 분리된 세크로핀 A(Cecropin A)는 37-잔기의 선형 양이온성 펩타이드로, 이에 의한 박테리아 박멸 기작은 명확하게 알려져 있지 않지만, 작용 부위가 세포막일 것으로 생각되고 있다. 제노퍼스 라비스(Xenopus laevis)로부터 유래한 마가이닌(Magainin) 2는 25개의 펩타이드로 막의 투과성에 영향을 미친다. 마가이닌 2는 산성 인지질에 결합하여 양친매성 헬릭스를 이루어 동적 펩타이드-지질 초분자 복합체로 구성된 동공을 형성하여 세포질 내로 전이된다(11). 멜리틴(Melittin)은 봉독(apitoxin)의 주요 활성 성분으로 포스포리파제 A2에 대한 강력한 자극제이다. 멜리틴의 주요 성분은 52%의 봉독 펩타이드이다. 멜리틴은 항-염증성 인자인 코티솔보다 100배 이상 강력하다. 또한, 멜리틴은 강력한 염증 반응에서 세포 파괴를 억제한다. 아파민(Apamin)은 부신에서 코티솔의 생산을 증가시킨다. 또한, 아파민은 신경 독소로 기능한다. 아돌라핀(Adolapin)은 2-5%의 펩타이드를 포함하고 사이클로옥시게나제를 억제함으로써 항-염증제 및 항-진통제로 기능한다.
최근에, 항균 펩타이드에 대한 많은 연구들은 증가된 항균 활성 및 포유동물 세포에 대한 낮은 세포독성을 가지는 천연의(naturally occurring) 항균 펩타이드에 대한 짧은 유사체 개발에 집중되어 왔다(12). Katsumi는 선택성을 조절하기 위해 펩타이드의 물리화학적 변수들, 예를 들어 순전하(net charge), 나선성(helicity), 잔기 당 소수성(H), 소수성 모멘트(μ) 및 양성 전하를 띠는 극성 헬릭스 면에 의해 정해지는 각을 변형시켜 최적화하고자 시도하였다(13).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 신규한 항균 펩타이드를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세크로핀(Cecropin) A 및 마가이닌(Magainin) 2 펩타이드 서열을 이용하여 신규한 하이브리드 항균 펩타이드인 HAN18를 합성하였고, 합성된 HAN18 펩타이드가 정상세포에 대한 세포독성이 매우 낮으며 강력한 항균, 항진균 및 항암 효능을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-미생물용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항암용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 미생물 성장 억제 또는 파괴용 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 펩타이드를 제공한다:
일반식 1
Xaa1-Lys-Lys-Ile-Pro-Xaa2-His-Xaa3
상기 일반식에서, Xaa1는 1-5개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내며, 상기 Xaa1은 Lys, Trp, Leu 및 Phe로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 이루어진 서열이고; Xaa2는 0-3개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내며, 상기 Xaa2는 Lys, Phe 및 Leu으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 이루어진 서열이고; 및 Xaa3은 1-5개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내며, 상기 Xaa3은 Leu, Arg, Lys 및 Phe으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 이루어진 서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명자들은 신규한 항균 펩타이드를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세크로핀(Cecropin) A 및 마가이닌(Magainin) 2 펩타이드 서열을 이용하여 신규한 하이브리드 항균 펩타이드인 HAN18를 합성하였고, 합성된 HAN18 펩타이드가 정상세포에 대한 세포독성이 매우 낮으며 강력한 항균, 항진균 및 항암 효능을 가진다는 것을 확인하였다.
본 발명의 HAN18 항균 펩타이드는 히알라포라 세크로피아(Hyalaphora cecropia)로부터 유래한 세크로핀(cecropin) A와 제노퍼스 라비스(Xenopus laevis)로부터 유래한 마가이닌(Magainin) 2의 서열을 이용하여 합성된 하이브리드 펩타이드이다. 합성한 펩타이드는 정제 및 분석과정을 거쳐 함량과 순도를 점검한 뒤 여러 생물학적 테스트를 거쳐 천연의 항균 펩타이드와 유사한 효능을 가지는 펩타이드를 선정하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 각 항균 펩타이드의 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 결실, 대체 또는 변형을 유도할 수 있다. 이러한 결실, 대체 또는 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 항균 펩타이드보다 열안정성이 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로 변형될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.
상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 세크로핀 A의 아미노산 서열은 세크로핀 A의 N-말단 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상술한 N-말단 아미노산 서열은 KWKLFKKI이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 마가이닌 2의 아미노산 서열은 마가이닌 2의 변형된 N-말단 아미노산 서열이며, 보다 바람직하게는 Gly-Ile-Gly(GIG)를 Pro(P)로, Ser(S)을 Leu(L)으로 치환 또는 변형시킨 아미노산 서열로 PKFLHLAKKF이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 미생물 성장 억제 활성을 가진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 미생물은 박테리아 또는 곰팡이를 포함한다.
본 명세서의 용어 “항균(antimicrobial)”은 본 발명의 펩타이드가 박테리아, 곰팡이, 기생충(parasites) 등을 포함하는 미생물의 성장 또는 증식을 억제, 예방 또는 파괴시킨다는 것을 의미한다. 본 명세서의 용어 “예방(prevention)”는 미생물의 성장을 방해하는 것을 의미한다. 본 명세서의 용어 “항진균(antifungal)”은 본 발명의 펩타이드가 곰팡이의 성장을 억제하거나 또는 곰팡이를 파괴시킨다는 것을 의미한다. 본 명세서의 용어 “미생물(microbe)”은 단세포성 및 사상균류(예컨대, 효모 및 곰팡이), 단세포성 및 사상조류, 단세포성 및 다세포성 기생충 뿐 아니라 계통발생학적 영역(phylogenic domains)인 박테리아 및 고세균을 포함하는 생물체를 포함한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 박테리아는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아이다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 그람-음성 박테리아는 대장균, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)를 포함하고, 본 발명의 그람-양성 박테리아는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 메가테리움(B. megaterium), 바실러스 안트라시스(B. anthracis), 바실러스 아밀로리쿼페이션스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 시리어스(B. cereus), 바실러스 글로비가이(B. globigii), 바실러스 인페르누스(B. infernus), 바실러스 라배(B. larvae), 바실러스 라테로스포루스(B. laterosporus), 바실러스 무실라기노서스(B. mucilaginosus), 바실러스 나토(B. natto), 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa), 바실러스 슈도안트라시스(B. pseudoanthracis), 바실러스 푸미러스(B. pumilus), 바실러스 스패리쿠스(B. sphaericus), 바실러스 스포로써모듀란스(B. sporothermodurans), 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus), 바실러스 튜린겐시스(B. thuringiensis), 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 코아굴런스(B. coagulans), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis) 또는 스타필로코커스 사프로피티쿠스(S. saprophyticus)를 포함하며, 보다 더 바람직하게는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 메가테리움 또는 스타필로코커스 아우레우스이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스타메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola), 크리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola), 칸디다 보고리엔시스(Candida bogoriensis), 칸디다 그로펜기세리(Candida gropengisseri), 칸디다 아피콜라(Candida apicola), 칸디다 페트롤리움(Candida petrollium), 토룰롭시스 마그놀리애(Torulopsis magnoliae), 토룰롭시스 아피콜라(Torulopsis apicola), 토룰롭시스 봄비콜라(Torulopsis bombicola), 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola) 또는 비커하미엘라 도메리퀴애(Wickerhamiella domericqiae)를 포함하며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에, 크리코스포론 베이겔리 또는 칸디다 알비칸스이다.
본 발명에 따르면, 세포에 본 발명의 펩타이드를 18-24시간 동안 처리한 후 세포의 성장을 살펴보면, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서 강력한 항-미생물 활성이 나타났다. 보다 상세하게는, 본 발명의 HAN18 펩타이드의 최소억제 농도(MIC)가 0.78-12.5 μM로 측정되었으며, HAN18의 N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들도 우수한 항-미생물 활성을 나타냈다(참조: 도 2-도 6).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미생물 성장 억제 또는 파괴용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 명세서의 용어 “항암(anti-cancer 또는 anti-tumor)”는 본 발명의 펩타이드가 종양의 성장을 억제하거나 또는 종양을 파괴시킨다는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 암세포 성장을 억제하거나 또는 암세포를 파괴한다. 본 발명의 펩타이드는 정상세포인 NIH 3T3 섬유아세포에 대해서는 낮은 세포독성을 나타냈으며, 암세포, 유방암 세포주인 MDA-MB-361, 면역암세포주인 JurKat 또는 신장 암세포주인 K-562에 대해 높은 세포독성을 나타내 이들의 성장을 강력하게 억제하였다(참조: 도 7-도 9).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물을 이용하여 치료할 수 있는 암은 유방암, 신장암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 뇌암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 약제학적 유효량을 처리하는 단계를 포함하는 미생물 성장 억제 또는 파괴용 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 조성물을 이용하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물은 항균 활성(antimicrobial activity)을 가진다. 본 명세서의 용어 “억제(inhibition)”는 미생물의 성장을 감소 또는 방해하거나, 또는 미생물의 감염성 인자 발현 또는 기능을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서의 용어 “파괴(killing)”는 본 발명의 조성물에 의해 미생물이 실질적으로 파괴되는 것을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 미생물의 성장을 30%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 감소시키며, 보다 더 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 감소시키고, 가장 바람직하게는 95% 이상 감소시킨다.
본 발명의 미생물 성장을 억제하는 방법은 조합 또는 시너지 치료를 위해 항생제의 첨가를 추가적으로 포함할 수 있다. 전형적으로, 투여될 바람직한 항생제는 박테리아, 즉 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아에 따라 결정될 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 시너지 효과를 위해 유용한 항생제는 아미노글라코시드(예: 토브라마이신, 아미카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 등), 페니실린(예: 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 나프실린, 옥사실신, 클록사실린, 다이클록사실린, 암피실린, 아목시실린, 티카르실린, 카르베니실린, 메즐로실린, 아즐로실린, 피레라실린, 등), 세팔로스포린(예: 세프타지다임, 세파졸린, 세파클러, 세팔로틴 세파만돌, 세폭시틴, 세퓨록심, 세포니시드, 세피네타졸, 세포테탄, 세프로질, 등), 플루로퀴놀론(예: 시프로플록사신), 카프바페넴(예: 이미페넴, 메로페넴, 파니페넴, 등), 테트라사이클린(예: 독시사이클린, 미노사이클린, 테트라사이클린, 등) 또는 마크롤라이드(예: 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 아지트로마이신, 등)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 하이브리드 항균 펩타이드 HAN18 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명에 따르면, 본 발명의 HAN18 펩타이드는 박테리아 및 곰팡이에 대해 강력한 성장억제능을 가지고, 이들의 N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들도 강력한 미생물 성장 억제 활성을 가진다.
(c) 또한, 본 발명의 HAN18 펩타이드 및 N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들은 암세포에 대해 강력한 세포독성을 나타낸다.
(d) 따라서, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 강력한 항균, 항진균 및 항암 효능을 가져 다양한 분야(예컨대, 의약, 의약외품, 생물살균제, 등)에 매우 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 하이브리드 항균 펩타이드인 HAN18의 합성 과정을 나타낸다.
도 2는 그람-양성 박테리아에 대한 본 발명의 HAN18 및 이의 유사체 펩타이드의 MIC(minimal inhibitory concentration)를 측정한 결과로, 낮은 농도에서 그람-양성 박테리아의 성장이 효과적으로 억제될 수 있음을 보여준다.
도 3은 그람-음성 박테리아에 대한 본 발명의 HAN18 및 이의 유사체 펩타이드의 MIC를 측정한 결과로, 낮은 농도에서 그람-음성 박테리아의 성장이 효과적으로 억제될 수 있음을 보여준다.
도 4는 효모 및 곰팡이에 대한 본 발명의 HAN18 및 이의 유사체 펩타이드의 MIC를 측정한 결과로, 낮은 농도에서 이들의 성장이 효과적으로 억제될 수 있음을 보여준다.
도 5는 칸디다 알비칸스의 콜로니 형성에 대한 하이브리드 항균 펩타이드인 본 발명의 HAN18 펩타이드의 효과를 나타낸다. A, 대조군; B, 처리군.
도 6은 본 발명의 HAN18 펩타이드의 처리에 따른 칸디다 알비칸스의 형태학적 변화를 관찰한 전자현미경 결과이다. A, HAN18 펩타이드를 처리하지 않은 칸디다 알비칸스; B, HAN18 펩타이드를 처리한 칸디다 알비칸스.
도 7은 유방암 종양세포인 MDA-MB-361에 대한 본 발명의 HAN18 및 이의 유사체 펩타이드의 세포독성을 테스트한 결과이다.
도 8은 면역암세포주인 JurKat에 대한 본 발명의 HAN18 및 이의 유사체 펩타이드의 세포독성을 테스트한 결과이다.
도 9는 신장 암세포주인 K-562에 대한 본 발명의 HAN18 및 이의 유사체 펩타이드의 세포독성을 테스트한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법 및 실험결과
하이브리드 항균 펩타이드의 디자인 및 합성
여러 가지 생물정보학 관련 프로그램을 활용하여 본 발명의 펩타이드를 합성하였다. 본 발명의 하이브리드 항균 펩타이드를 제조하기 위해, 히알라포라 세크로피아(Hyalaphora cecropia)로부터 유래한 세크로핀(cecropin) A와 제노퍼스 라비스(Xenopus laevis)로부터 유래한 마가이닌(Magainin) 2의 서열을 이용하였다. 먼저, 세크로핀 A의 N-말단 부위와 마가이닌 2의 C-말단 부위를 조합한 하이브리드 형(CA-MA)을 제조하였으며, 제조된 하이브리드 형의 서열에서 Gly-Ile-Gly(GIG)를 Pro(P)로, Ser(S)을 Leu(L)으로 치환시킨 펩타이드를 제작하여 HAN18이라 명명하였다(도 1).
또한, HAN18 펩타이드의 항균 활성을 조사하기 위해, N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체(N-1 내지 N-5, 또는 C-1 내지 C-5)를 합성하였다. 본 발명에서 선정되어 합성된 펩타이드들은 (주)애니젠(Anygen, Korea)에서 자동 고체상 펩타이드 합성기(automated solid-phase peptide synthesizer, Pioneer Applied Biosystems, USA)로 합성하였다.
합성된 펩타이드들은 5% 아세트산에 녹인 후 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 시스템(Gilson 512)에 장착된 C18 역상 컬럼(Reversed Phase Column; 218TP54 Vydac Co. USA)을 통하여 용출시켰다. 용액 A(Sol A)는 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)가 포함된 HPLC 물(Tedia, USA)을 사용하였고, 용액 B(Sol B; Tedia, USA)는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴을 사용하였다. 용액 A(95%) 및 용액 B(5%)로 10분간 평형을 유지한 후, 0.5 ml/min의 속도로 용액 B를 5%-65%로 60분 동안 농도구배(linear gradient)를 걸었다. 용출된 분획들의 흡광도를 214 nm에서 측정하였으며, 정제된 펩타이드는 Speed-Vac으로 완전히 건조하였다. 정제된 펩타이드의 순도는 95% 이상이었고, 이들의 아미노산 서열 및 분자량을 표 1에 기재하였다.
합성된 펩타이드의 아미노산 서열 및 분자량.
펩타이드 서열 MALDI-MS
분석치 이론치
HAN18 KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 2299.8 2298.5
N-1 WKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 2171.9 2171.8
N-2 KLFKKIPKFLHLAKKF-NH2 2132.5 2132.7
N-3 LFKKIPKFLHLAKKF-NH2 2058.9 2058.6
N-4 FKKIPKFLHLAKKF-NH2 1931.4 1930.4
N-5 KKIPKFLHLAKKF-NH2 1783.5 1783.3
C-1 KWKLFKKIPFLHLAKK-NH2 2171.5 2171.8
C-2 KWKLFKKIPKFLHLAK-NH2 2152.6 2152.8
C-3 KWKLFKKIPLHLA-NH2 2024.4 2024.6
C-4 KWKLFKKIPKFLHL-NH2 2024.4 2024.6
C-5 KWKLFKKIPH-NH2 1911.2 1911.4
하이브리드 항균 펩타이드들의 항균 활성
미량희석법(microdilution method)을 이용하여 본 발명의 하이브리드 항균 펩타이드들의 그람-양성 균주 및 그람-음성 균주들에 대한 항균 효능을 테스트하였다(도 2 및 도 3). 본 발명에서 이용된 그람-양성 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)이며, 그람-음성 균주는 대장균(E. coli), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)이다. 항균 테스트에 이용된 모든 균주들은 생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)로부터 분양받아 사용하였다.
각각의 균주들은 영양 아가 배지(Beef extract 3g, peptone 5g 및 박토 아가(bacto agar, Sigma Co., 미국) 15 g/증류수 1,000 ㎖)에서 30℃로 18-24시간 동안 배양하였다. 배양액을 새로운 영양 아가 배지로 옮겨 2 X 104 CFU/㎖이 되도록 희석하였다. 정제된 펩타이드는 무균상태인 멸균된 증류수로 녹여 2배씩 연속적으로 희석하였다. 미생물 배양액 100 ㎕를 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트(Costar 3790, Corning, USA)의 각 웰에 분주한 후, 준비된 농도의 항균 펩타이드를 웰에 첨가하였다. 항균 펩타이드의 항균 활성을 보기 위해, 30℃에서 18시간 동안 배양시킨 후, ELISA 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정함으로써, 최소억제 농도(Minimal Inhibition Concentration, MIC)를 확인하였다.
또한, 디스크 확산법(Disc diffusion method)을 이용한 항균 펩타이드의 항균 효과는 영양 아가를 만들어 멸균하고 멸균된 페트리 디쉬에 4 mm 정도 부어서 굳힌 후 여기에 아가 및 각 시험용 균주를 각각 0.7%, 1% 첨가한 한천 배지를 4-5 mm 두께로 도말하였다. 그 표면에 종이 디쉬(8 mm Φ, TOYO)에 추출된 분획물을 50 ㎕씩 흡수시키고, 용매를 완전히 증발시킨 후 표면에 놓아 밀착시키고 떨어뜨려 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 균의 증식이 억제된 종이 디쉬의 생육저해환(Clear zone)을 조사하여 항균활성을 측정한다.
본 발명의 펩타이드들의 MIC 범위는 0.78-12.5 μM이었다. 도 2 및 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 HAN18 펩타이드가 매우 우수한 항균 활성을 나타냈으며, MIC는 0.78-6.25 μM이었다. 본 발명의 HAN18 펩타이드의 항균 활성에 미치지는 못할 지라도, N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들도 우수한 항균 효능을 보였다. 또한, HAN18의 C-말단 유사체들보다 N-말단 유사체들이 더욱 우수한 항균 활성을 나타냈다.
하이브리드 항균 펩타이드들의 항진균 활성
상술한 항균 활성 방법과 동일한 방법을 이용하여 본 발명의 하이브리드 항균 펩타이드들의 항진균 활성을 측정하였다(도 4-6). 본 발명에서 진균으로, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 크리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 사용하였다. 항진균 테스트에 이용된 모든 균주들은 생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받아 사용하였다.
먼저, 사카로미세스 세레비지애 또는 크리코스포론 베이겔리에서 실시한 항진균 테스트 결과, 본 발명의 펩타이드들의 MIC 범위는 12.5-200 μM이었다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 HAN18 펩타이드의 MIC는 두 균주 모두에서 12.5 μM이었다. 본 발명의 HAN18 펩타이드의 항진균 활성보다 낮은 활성을 보이지만, N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들도 우수한 항진균 활성을 나타냈으나, N-말단 또는 C-말단에서 결실 또는 대체된 부위가 많을수록 항진균 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 칸디다 알비칸스의 콜로니 형성에 대한 HAN18 펩타이드의 효과를 조사하였다. 칸디다 알비칸스를 약 2 X 103 세포/㎖가 되도록 YPD 배지에 희석하였다. 그런 다음, 항균 펩타이드를 최종 농도가 3 μM이 되도록 첨가하였다. 이 반응 혼합액을 YPD 아가 배지에 도말을 하고 28℃에서 3시간 동안 배양하였다. 다음 이 플레이트를 28℃에서 18-24시간 동안 추가적으로 배양하였다. 도 5에서 확인할 수 듯이, 본 발명의 HAN18 펩타이드 처리는 칸디다 알비칸스의 성장을 억제하였다.
또한, HAN18 펩타이드에 의해 성장이 억제된 칸디다 알비칸스의 형태학적인 변화를 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 항균 펩타이드를 처리한 칸디다 알비칸스를 2.5% 글루타르알데하이드 용액(0.1 M 카코딜레이트 완충액, pH 7.4, 4℃)에서 2시간 동안 고정시킨 후, 0.1 M 카코딜레이트 완충액으로 20분씩 3회에 걸쳐서 세척을 하였다. 이후, 1% 삼투성 산용액(1% osmotic acid in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.4)로 실온에서 2시간 동안 고정시키고, 에틸 알코올 용액으로 일련의 탈수 과정을 거친 후 골드 이온 입자(gold ion particle)로 코팅하여 DSM 940A 주사전자현미경(Hitachi S-4300, Japan)으로 관찰하였다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 군은 균주의 표면이 매끄럽고 정상적인 형태를 보였으나 본 발명의 HAN18 펩타이드를 처리한 군은 균주의 표면에 구멍이 뚫려 있는 비정상적인 형태를 나타냈는데, 이는 본 발명의 펩타이드가 균주의 세포막을 분해시켜 성장을 억제한다는 것을 의미한다.
HAN18 펩타이드의 세포독성 측정
본 발명의 HAN18 항균 펩타이드의 세포독성을 조사하기 위해, 대조군인 정상 세포로 NIH3T3 섬유아세포를, 유방암 세포주인 MDA-MB-361, 면역암세포주인 JurKat 및 신장 암세포주인 K-562를 배양하여 펩타이드 처리에 따른 세포성장을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma Co., USA) 어세이를 이용하여 측정하였다. MTT 어세이는 세포소기관 중 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)의 활성도를 측정하여 세포 생존을 측정한다. MTT 어세이는 용해성 노란색 MTT 졸리움(tetrazolium)이 숙신산 탈수소효소에 의해 불용성의 보라색 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원되는 정도를 흡광도로 측정하는 방법으로, 트립판 블루(trypan blue)에 의한 다이-익스클루젼(dye-exclusion) 방법보다 민감하여 세포사 진행과정의 초기시점에서 세포의 생존율을 보다 정확히 측정할 수 있는 장점이 있다. MTT는 수용액 속에서는 무색이지만 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 효소인 숙신산 탈수소효소에 의해서 물에 녹지 않는 보라색 색소로 전환되므로, 색소의 농도를 ELISA 비색계로 측정하여 살아있는 세포의 증식과 독성을 측정할 수 있다.
상술한 세포를 D-MEM(GIBCO Co, USA)에 10% FBS, 페니실린 G(25 unit/㎖), 스트렙토마신(25 ㎍/㎖), 펀지존(3 ㎕/㎖) 및 항생제(10 ㎕/㎖)를 첨가해 배양하고, 4 X 103 세포/㎖를 96 웰-플레이트에 각각 200 ㎕/웰씩 분주하여 세포가 웰 당 70% 정도 채워졌을 때 각각의 항균 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 24시간 경과 후, MTT가 포함된 배양액으로 교환하여 3시간 동안 추가적으로 배양시키고, DMSO(dimetylsulfoxide, Sigma Co., USA)로 포르마잔(Sigma Co., USA)을 용해시켜 ELISA 판독기(Bio-Tech, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포독성을 측정하였다.
도 7-9에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 HAN18 항균 펩타이드는 정상세포에 대해서 낮은 세포독성을 나타내지 않았지만, MDA-MB-361, JurKat 및 K-562에 대해 우수한 세포독성(90% 이상)을 나타냈다. 본 발명의 HAN18 항균 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드들도 정도의 차이는 있으나 상술한 세포주에 대해 매우 우수한 세포독성을 나타냈다. N-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드 중에서, N-1 내지 N-4가 상술한 세포주에 대해 우수한 세포독성(약 70% 이상)을 보였다. 또한, C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드는 테스트된 모든 세포주에서 N-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드보다는 약하지만 우수한 세포독성을 나타냈다. C-말단 부위가 결실 또는 대체된 HAN18 유사체 펩타이드 중에서, C-1 및 C-2가 상술한 세포주에 대해 약 70% 이상의 세포독성을 보였다. 따라서, 본 발명의 HAN18 항균 펩타이드 및 이의 유사체들은 암 또는 종양세포에 대해 아주 탁월한 세포독성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. 다음 일반식 1로 표시되는 펩타이드:
    일반식 1
    Xaa1-Lys-Lys-Ile-Pro-Xaa2-His-Xaa3
    상기 일반식에서, Xaa1는 1-5개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내며, 상기 Xaa1은 Lys, Trp, Leu 및 Phe로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 이루어진 서열이고; Xaa2는 0-3개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내며, 상기 Xaa2는 Lys, Phe 및 Leu으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 이루어진 서열이고; 및 Xaa3은 1-5개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내며, 상기 Xaa3은 Leu, Arg, Lys 및 Phe으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 이루어진 서열이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 미생물 성장 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 박테리아는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 암세포 성장을 억제하거나 또는 암세포를 파괴하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 제 1 항의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제 1 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미생물 성장 억제 또는 파괴용 약제학적 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 신장암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 뇌암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 1 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 약제학적 유효량을 처리하는 단계를 포함하는 미생물 성장 억제 또는 파괴용 방법.
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