发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗菌肽,该抗菌肽具有pH稳定性好的优点。
一种抗菌肽,该抗菌肽的序列为Lys-Trp-Arg-Arg-Lys-Trp-Lys-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO:1)。
上述抗菌肽可按SEQ ID NO:1所示序列采用多肽合成仪合成得到。
由于本发明所述的抗菌肽的pH稳定性好,因此适宜制成水溶液的杀菌剂,该杀菌剂每升含有SEQ ID NO:1所示序列的抗菌肽3~7μmol。
本发明所述的杀菌剂每升还含有乙醇80~120mL和甘油10mL。其中,所述的乙醇既有消毒作用又可增加作用在皮肤上清凉感觉;所述的甘油可对皮肤进行滋润。
上述杀菌剂由以下方法制备成:
取SEQ ID NO:1所示序列的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇和甘油搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟,即得杀菌剂。
本发明所述的抗菌肽具有广谱杀菌作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(金葡菌)或绿脓杆菌均有较强的杀灭作用。本发明所述的抗菌肽还具有安全无刺激的优点,相比于乙醇,本发明所述抗菌肽所制成的杀菌剂对细胞的刺激性小。
具体实施方式
下述实施例1~4所用抗菌肽委托上海吉尔多肽有限公司按SEQ ID NO:1~4所示序列合成。
实施例1
1、杀菌剂样品的制备
取3μM SEQ ID NO:1所示序列的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇120mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
2、杀菌剂对照品及其制备
对照品1:取3μM序列为Lys-Arg-Trp-Trp-Lys-Trp-Trp-Arg-Arg(SEQ ID NO:2)的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇120mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品2:取3μM序列为Lys-Trp-Lys-Trp-Trp-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys(SEQ ID NO:3)抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇100mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品3:取3μM序列为Arg-Trp-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO:4)抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇120mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品4:体积浓度为75%的医用乙醇。
3、细菌灭活率检测实验
取1mL样品和对照品1~4分别加入盐酸调节pH至3后,每一种杀菌剂中分别加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(金葡菌)及绿脓杆菌悬液,配成细菌浓度为109cfu/mL的菌液。在5s和1min后,取出菌液,梯度稀释后涂琼脂板计数。实验中以1mL去离子水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细菌存活数计算各组的细菌灭活率。结果如下表1和2所示。
表1 5s内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
35.31 |
28.12 |
17.12 |
20.23 |
30.12 |
金葡菌 |
38.12 |
30.13 |
15.25 |
16.13 |
28.43 |
绿脓杆菌 |
38.84 |
27.12 |
13.22 |
16.09 |
34.52 |
表2 1min内的细菌灭活率
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
92.53 |
79.21 |
34.23 |
29.12 |
90.12 |
金葡菌 |
93.56 |
70.32 |
37.75 |
19.04 |
87.34 |
绿脓杆菌 |
92.13 |
63.35 |
30.95 |
28.45 |
94.14 |
4、生物安全性检测
取1mL样品和对照品1~4分别加入盐酸调节pH至3后,加入至培养有眼角膜上皮细胞的24孔培养板中(每孔中含有约105眼角膜上皮细胞),静置5s后,取出溶液,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验中以1mL水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细胞存活数计算各组的细胞存活率。结果见下表3。
表3 各组溶液中的细胞存活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
细胞存活率 |
99.88 |
98.34 |
99.12 |
99.78 |
10.14 |
实施例2
1、杀菌剂样品的制备
取5μM SEQ ID NO:1所示序列的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇80mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
2、杀菌剂对照品及其制备
对照品1:取5μM序列为Lys-Arg-Trp-Trp-Lys-Trp-Trp-Arg-Arg(SEQ ID NO:2)的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇120mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品2:取5μM序列为Lys-Trp-Lys-Trp-Trp-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys(SEQ ID NO:3)抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇80mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品3:取5μM序列为Arg-Trp-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO:4)抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇80mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品4:体积浓度为75%的医用乙醇。
3、细菌灭活率检测实验
取1mL样品和对照品1~4分别加入盐酸调节pH至5后,加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(金葡菌)及绿脓杆菌悬液,配成细菌浓度为109cfu/mL的菌液。在5s和1min后,取出菌液,梯度稀释后涂琼脂板计数。实验中以1mL去离子水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细菌存活数计算各组的细菌灭活率。结果见表4和表5。
表4 5s内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
98.13 |
78.34 |
29.56 |
20.34 |
30.12 |
金葡菌 |
99.22 |
78.67 |
38.59 |
14.32 |
28.43 |
绿脓杆菌 |
97.67 |
56.87 |
28.37 |
17.67 |
34.52 |
表5 1min内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
99.99 |
81.23 |
39.40 |
20.23 |
90.12 |
金葡菌 |
99.99 |
84.73 |
39.48 |
18.34 |
87.34 |
绿脓杆菌 |
99.99 |
83.49 |
43.94 |
20.83 |
94.14 |
4、生物安全性检测
取1mL样品和对照品1~4分别加入盐酸调节pH至5后,加入至培养有眼角膜上皮细胞的24孔培养板中(每孔中含有约105眼角膜上皮细胞),静置5s后,取出溶液,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验中以1mL水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细胞存活数计算各组的细胞存活率。结果见下表6。
表6 各组溶液中的细胞存活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
细胞存活率 |
99.23 |
99.83 |
98.23 |
98.32 |
10.14 |
实施例3
1、杀菌剂样品的制备
取7μM SEQ ID NO:1所示序列的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇100mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
2、杀菌剂对照品及其制备
对照品1:取7μM序列为Lys-Arg-Trp-Trp-Lys-Trp-Trp-Arg-Arg(SEQ ID NO:2)的抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇100mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品2:取7μM序列为Lys-Trp-Lys-Trp-Trp-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys(SEQ ID NO:3)抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇100mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000mL,搅拌5分钟即得。
对照品3:取7μM序列为Arg-Trp-Arg-Trp-Trp-Arg-Trp-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO:4)抗菌肽溶于500mL去离子水中后,加入乙醇100mL和甘油10mL搅拌均匀,再加入去离子水至1000m,搅拌5分钟即得。
对照品4:体积浓度为75%的医用乙醇。
3、细菌灭活率检测实验
取1mL样品和对照品1~4分别加入氢氧化钠调节pH至10后,加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(金葡菌)及绿脓杆菌悬液,配成细菌浓度为109cfu/mL的菌液。在5s和1min后,取出菌液,梯度稀释后涂琼脂板计数。实验中以1mL去离子水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细菌存活数计算各组的细菌灭活率。结果见下表7和表8。
表7 5s内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
96.34 |
70.23 |
23.49 |
23.21 |
30.12 |
金葡菌 |
98.23 |
71.54 |
23.98 |
15.67 |
28.43 |
绿脓杆菌 |
97.99 |
80.92 |
28.32 |
24.09 |
34.52 |
表8 1min内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
99.99 |
87.23 |
34.93 |
15.93 |
90.12 |
金葡菌 |
99.99 |
82.09 |
38.87 |
28.89 |
87.34 |
绿脓杆菌 |
99.99 |
80.34 |
32.19 |
30.16 |
94.14 |
4、生物安全性检测
取1mL样品和对照品1~4分别加入盐酸调节pH至10后,加入至培养有眼角膜上皮细胞的24孔培养板中(每孔中含有约105眼角膜上皮细胞),静置5s后,取出溶液,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验中以1mL水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细胞存活数计算各组的细胞存活率。结果见下表9
表9 各组溶液中的细胞存活率
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
细胞存活率 |
99.97 |
99.45 |
99.75 |
99.45 |
10.14 |
实施例4
1、杀菌剂样品的制备
与实施例2相同。
2、杀菌剂对照品及其制备
与实施例2相同。
3、细菌灭活率检测实验
取1mL样品和对照品1~4分别加入氢氧化钠调节pH至7后,加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(金葡菌)及绿脓杆菌悬液,配成细菌浓度为109cfu/mL的菌液。在5s和1min后,取出菌液,梯度稀释后涂琼脂板计数。实验中以1mL去离子水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细菌存活数计算各组的细菌灭活率。结果见下表10和表11。
表10 5s内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
90.34 |
63.94 |
33.23 |
18.93 |
30.12 |
金葡菌 |
89.23 |
50.28 |
30.83 |
25.98 |
28.43 |
绿脓杆菌 |
91.73 |
63.98 |
23.50 |
22.30 |
34.52 |
表11 1min内的细菌灭活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
大肠杆菌 |
99.99 |
90.23 |
45.82 |
22.24 |
90.12 |
金葡菌 |
99.99 |
82.39 |
40.10 |
32.93 |
87.34 |
绿脓杆菌 |
99.99 |
88.32 |
40.35 |
31.93 |
94.14 |
4、生物安全性检测
取1mL样品和对照品1~4分别加入盐酸调节pH至7后,加入至培养有眼角膜上皮细胞的24孔培养板中(每孔中含有约105眼角膜上皮细胞),静置5s后,取出溶液,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验中以1mL水溶液为空白组,进行相同处理,并依照其中的细胞存活数计算各组的细胞存活率。结果见表12
表12 各组溶液中的细胞存活率(%)
|
样品 |
对照品1 |
对照品2 |
对照品3 |
对照品4 |
细胞存活率 |
99.78 |
99.23 |
99.10 |
98.97 |
10.14 |