KR20090002435A

KR20090002435A - 헬리코박터 파일로리균의 리보좀 단백질 ｌ１유래의 새로운접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드 및 조성물

Info

Publication number: KR20090002435A
Application number: KR1020070064230A
Authority: KR
Inventors: 함경수; 박윤경; 김양미
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2007-06-28
Filing date: 2007-06-28
Publication date: 2009-01-09
Also published as: KR100935029B1

Abstract

본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 균의 리보좀 단백질 L1 (ribosomal protein L1, RPL1) 아미노말단 부위에서, 양친화성 (amphipathic)과 항생 활성을 갖는 HP(2-20) 펩타이드의 소수성 부위를 증가시킨 HPA3로부터, 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 세포의 막에 잘 결합하도록 하는 접힘 구조를 갖게 된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드 및 조성물은 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타내고 세포 독성이 없으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

헬리코박터 파일로리균, 리보좀 단백질 L1, 항생 펩타이드, 접힘 구조

Description

헬리코박터 파일로리균의 리보좀 단백질 Ｌ１유래의 새로운 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드 및 조성물{Novel synthetic antimicrobial hinge peptide derived from Ribosomal Protein L1 of Helicobacter pylori and composition therefrom}

도 1은 본 발명의 리보좀 단백질 L1(Ribosomal Protein L1) 유래의 새로운 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 설계한 도해를 나타낸 것이고,

A : 서열번호 1: HP (2-20)

B : 서열번호 2: HPA3

C : 서열번호 3: HPA3-Pro

도 2는 본 발명의 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 인간 적혈구 세포에 처리하여 세포 독성을 확인한 전자현미경 사진이고,

A : 음성 대조군 (무처리군)

B : 서열번호 3: HPA3-Pro

C : 서열번호 4: 멜리틴

도 3과 4는 본 발명의 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 NMR 구조분석법으로 3차원적 입체구조를 살펴봄으로써, 본 발명의 펩타이드의 중앙 부분의 접힘 구 조를 확인한 사진이다.

본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 균의 리보좀 단백질 L1 (ribosomal protein L1; 이하, RPL1) 아미노말단 부위에서, 양친화성 (amphipathic)과 항생 활성을 갖는 HP(2-20) 펩타이드의 소수성 부위를 증가시킨 HPA3로부터, 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 세포의 막에 잘 결합하도록 하는 접힘 구조를 갖게 된 항생 펩타이드 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis ) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).

항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스 (Pneumococcus sp .)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다 (Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin)과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 페니실린의 경우에 있어서 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzymes)를 활성화함으로써 세균을 죽이지만, 또한 세균이 이 효소의 활성을 억제하여 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis ., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데, 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis ., 152, 365-372, 1985), 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.

작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지로 구분되는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장 속도가 감소할 때 일어나는 외형적 (phenotypic) 내성이며 (Tuomanen E., Revs . Infect . Dis ., 3, S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은, 오토라이신 효소의 활성을 감소시키는 조절 (down regulation)이 일어나는 것인데, 이러한 조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이지만, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게, 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소의 결손으로 생긴 경우인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로, 이러한 자가분해 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상에서 발견되는 내성은 오토라이신 효소의 활성을 외형적으로 조절하는 과정으로 이루어진다 (Tuomanen et al., J. infect . Dis ., 158, 36-43, 1988).

상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 오토라이신 효소의 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.

한편, 세균은 박테리오신 (bacteriocin)이라는 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신들은 구조적 특 징에 따라 세 가지로 구분된다. 첫 번째는 란티바이오틱스 (lantibiotics)이며 두 번째는 비(非)란티바이오틱스 (nonlantibiotics)이고, 세 번째는 신호 펩타이드 (signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다 (Cintas et al ., J. Bad ., 180, 1988-1994, 1998). 곤충을 포함하여, 동물 역시 펩타이드 항생제를 자체적으로 생산할 수 있는데 (Bevins et al., Ann . Rev . Biochem ., 59, 395-414, 1990), 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-회전형 (helical)의 양친화성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한 (proline-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int . J. Antimicrob . Agents, 9, 269-280, 1998). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G., Annu . Rev . Microbiol ., 13:61, 1995). 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다.

소화성 궤양이 스트레스와 위산 과다생성에 의해 발생한다는 가설이 있어왔으나, 최근에 이러한 소화성 궤양이 헬리코박터 파일로리균에 의한 것이라고 밝혀지면서 (Blaser, MJ., Trends Microbiol ., 1, 255-260, 1991) 헬리코박터 파일로리 균에 대한 관심이 집중되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 그람 음성균에 속하는데 성장 속도가 매우 느리고 나선형 몸체와 편모를 가지는 혐기성 미생물이다. 헬 리코박터 파일로리균이 생산하는 많은 단백질 중 RPL1이라는 단백질은 230개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 단백질의 아미노말단 부위가 세크로핀과 유사한 구조를 갖는 것이 밝혀졌는데, 특히 8개의 아미노산이 세크로핀과 같은 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 아미노말단 부위는 완벽한 양친화성 나선모양 구조를 가지는데 (Putsep, K. et al., Nature, 398, 671-672, 1999), 이러한 양친화성 펩타이드는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 미생물의 세포막 지질과 결합하여 미생물의 세포막을 파괴하거나, 세포막의 전위를 변화시켜 미생물을 파괴한다는 작용 기작이 보고되어 있다. 이 외에도 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위는 역시 항균활성을 가진다는 보고가 있다 (Putsep K. et al., Nature, 398, 671-672, 1999).

따라서 양친화성 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며, 이를 이용해 세균에 대한 항생제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 지금까지 보고된 양친화성 펩타이드로는 서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드, 서열번호 4로 기재되는 멜리틴 (melittin, ME) 펩타이드 등이 있다.

헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성 활성을 갖고 항생 활성을 나타내는 펩타이드인 서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드는 세포 독성은 없으면서 항균활성과 함께 항진균 효과가 있다고 보고되었다 (Biochem . Biophys . Res . Commun ., 2002, 291, 1006-1013, Biochim . Biophys . Acta. 2002, 1598, 185-194).

또한, 서열번호 4로 기재되는 멜리틴 펩타이드는 벌독의 성분 중 고형분의 50% 이상을 차지하는 펩타이드로서 카르복시 말단이 아미노화 (amidation) 되어 있고, 진핵세포에 대하여 세포독성이 매우 높아 고등동물세포를 낮은 농도에서도 잘 파괴하고, 미생물인 그람 음성균 및 그람양성균에 대해서도 항균 활성이 높다고 보고되었다 (Habermann, E., Science, 177: 314, 1972; Steiner, H., et al., Nature, 292: 246, 1981; Tosteson, M. T., et al., Biochemistry, 228: 337, 1987).

그 이외 HP (2-20)과 유사한 아미노산 서열이 있는 세크로핀 계열의 양친화성 펩타이드는 초파리에게서 처음 발견되었고, 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은창자에서도 발견되었는데, 이 중 세크로핀 A (cecropin A, CA)는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것으로 보고되었다 (Boman, H. G. and Hultmark, D., Annu . Rev . Microbiol., 41: 103, 1987).

또한 상기 양친화성 펩타이드의 활성에 관한 연구와 더불어, 그들이 갖는 아미노산 서열 및 단백질 구조 등의 특성을 살펴보면, 그 서열상의 특성이 항균 활성과 매우 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있다. 따라서 상기 양친화성 펩타이드의 아미노산 서열을 이용하여 그 서열의 특정부위에서 유사한 아미노산으로 치환하거나, 일부 서열들을 재조합하여 접합 펩타이드 (conjugation peptide)를 제조하고, 펩타이드 서열의 일부 기능 부위를 서로 도치시킴으로써 항균, 항진균 또는 항암 활성이 탁월한 새로운 합성 펩타이드를 제조할 수 있다 (Chan, H. C., et al., FEBS Lett., 259: 103, 1989; Wade, D., et al., Int . J. Pept . Prot . Res ., 40: 429, 1992).

실제로 상기의 양친화성 펩타이드를 응용하여 항암효과가 있는 합성 펩타이드 mag A 및 mag G 등이 제조되었고, 그 효능이 보고된 바 있다 (Ohsaki, et al ., Cancer Res., 52: 3534, 1992). 그 외에도, 마가이닌 2 및 멜리틴 펩타이드들의 양친화성 부위, 유연성 부위 및 소수성 부위 등의 아미노산을 상호 결합시켜 항진균 활성을 나타내는 합성 펩타이드들이 개발되었으며, 이들은 특히 박테리아 및 곰팡이 속 균주에 작용함이 특허 등록된 바 있다 (대한민국 특허등록 제0204501호). 또한 본 발명자들은 기존의 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 트립토판으로 치환하여 소수성을 증가(서열번호 2)시킴으로써 항생효과가 증진됨을 확인하여 항생 펩타이드로써 특허 등록된 바 있다 (대한민국 특허등록 제0459808호).

항생 펩타이드 구조의 대부분은 일직선상의 나선 구조로 구성되어 있음으로써 세포의 막을 공격하는 특징을 갖는데, 이때 일직선상의 나선구조의 적절한 부위에 접힘 구조를 줌으로써 세포의 막에 더욱더 잘 결합하도록 조절하는 것이 가능해진다. 즉 세균이나 곰팡이의 막 표면의 소수성 또는 전하를 이용하여 이들의 막에서 w＼결합을 더욱 잘하도록 유도하는 것이다.

이에 본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드를 합성하였으며, 상기 펩타이드의 항균 효과, 항진균 효과 및 세포독성 (용혈활성)이 없음을 확인하여 상기 펩타이드 유도체가 항생제로 이용될 수 있는 항생 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항생제에 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위한 새로운 기전의 항생제로서 세포독성이 없고 우수한 항균, 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 중 9번째 아미노산이 프롤린으로 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드를 제공한다.

상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HP (2-20)의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 소수성 아미노산인 트립토판으로 치환시킴으로써 소수성 부위가 증가한 양친화성 구조를 가진다. 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산은 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)균의 리보좀 단백질 L1 (ribosomal protein L1, 이하 RPL1)의 아미노말단 부위로 양친화성을 갖고 항생 활성을 나타낸다 (표 1 및 도 1 참조).

본 발명의 펩타이드는 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성법에 의해 제조가 가능하며, 서열번호 2로 기재되는 펩타이드의 9번째 아미노산이 글루타민산에서 프롤린으로 치환됨에 따라 서열번호 2로 기재된 펩타이드에 비해 소수성 부위와 유연성이 증가되며, 접힘 구조를 나타낸다(도 3과 도 4 참조). 상기 접힘 구조는 항생 펩타이드가 미생물의 세포막에 결합시 결합력을 향상시킴으로서 항생 효과를 증진시킬 수 있다. 상기 세포막은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막을 나타낸다.

펩타이드의 아미노산 서열

펩타이드	아미노산서열
서열번호 1: HP (2-20)	AKKVFKRLEKLFSKIQNDK-NH₂
서열번호 2: HPA3	AKKVFKRLEKLFSKIWNWK-NH₂
서열번호 3: HPA3-Pro	AKKVFKRLPKLFSKIWNWK-NH₂
서열번호 4: 멜리틴	GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH₂

본원 발명의 펩타이드의 항생 효과를 확인하기 위하여 항균 및 항진균 활성을 측정하였다.

항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration; 이하, MIC)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스태필로코쿠스 에피더미디스 (Staphlococcus epidermidis) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 그람 음성균으로써 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사 (Psedomonas aeruginosa), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 및 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris)를 그 대상으로 하였다. 서열번호 3으로 기재되는 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드와 대조군으로 HP (2-20) 펩타이드, HPA3 펩타이드 및 멜리틴(Melittin) 펩타이드를 사용하여 각 균주의 MIC 값을 측정한 결과, 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드는 대조군인 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 32배, HPA3 펩타이드에 비해서는 4배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드에 비해서는 균주에 따라 2배 높게 나타나거나 비슷한 항균활성을 가짐을 확인하였다(표 2 참조).

또한, 본원 발명의 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세르비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 각 균주의 MIC 값을 MTT 분석법으로 측정하였다. 그 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 대조군인 HP (2-20) 펩타이드에 비해 16배, HPA3 펩타이드에 비해서는 2배 이상의 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드에 비해서도 곰팡이에 따라 16배 이상의 항진균 활성을 나타내었다(표 3 참조).

상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 탁월한 항균 및 항진균 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 중 9번째 아미노산이 프롤린으로 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 상동성은 적어도 95% 인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드에서 각각의 아미노산을 구조가 유사한 다른 아미노산으로 치환하거나, 아미노 말단의 아미노기 또는 카르복시 말단의 카르복실기를 다른 기능기로 치환시킨 항균 및 항진균성 펩타이드를 포함할 수 있다. 특히, 합성된 펩타이드 중 17번째 아미노산과 19 번째 아미노산인 트립토판을 다른 소수성 아미노산으로 치환하여도 높은 항균, 항진균 활성을 나타낼 수 있다. 상기 다른 소수성 아미노산은 바람직하게는, 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라진, 발린 및 루이신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 9번째 아미노산인 프롤린은 '글라이신-이소루이신-글라이신'이라는 아미노산 세 개가 연결된 구조의 펩타이드로 치환될 수 있다. 본 연구자들은 상기 '글라이신-이소루이신-글라이신'의 아미노산 세 개가 연결된 구조의 펩타이드를 Cecropin A (1-8)-Magainin 2 (1-12)에 대한 접합 펩타이드의 제조시 중간 위치에 첨가하였었고, 상기 구조가 접힘 구조를 유도한 것을 확인할 수 있었다 (Oh, DH et al ., Biochemistry, 39, 11855-11864, 2000).

아울러, 본 발명은 상기 본원 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 조성물을 제공한다.

본원 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 대조군으로 HP (2-20) 펩타이드, HPA3 펩타이드 및 멜리틴(Melittin) 펩타이드를 사용하여 본원 발명의 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 4 참조).

상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균 및 항진균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

상기 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 펩타이드들의 합성 및 분리정제

세포막에 대한 결합력 향상을 위한 본원 발명의 항생 펩타이드를 합성하기 위해, 펩타이드 제조업체에 의뢰하여 ((주) 애니젠, 한국), 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법 (Merrifield, RB., J. Am . Chem . Soc ., 85, 2149, 1963)에 따라, Fmoc (9-fluorenylmethoxy carbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하여, 서열번호 2로 기재되는 HPA3 펩타이드의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킨 서열번호 3으로 기재되는 HPA3-Pro 펩타이드를 합성하였다(표 1 및 도 1). 그 외에도 대조군으로 표 1에서 기재하고 있는 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 4의 펩타이드들을 합성하였다.

구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin 을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin 을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬 (chain)의 연장은 DCC (N-hydroxybenzo triazole (HOBt)- dicyclo-hexycarbodiimide) 법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 (coupling) 시킨 후, NMP (20% piperidine /N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM (dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O- triisopropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르 (diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배 (acetonitrile gradient)에서 정제형 역상 (reverse phase, RP)-HPLC column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15, 19.0mm ×30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HCl로 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02 N HCl에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 상기의 방법으로 조성된 펩타이드들의 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법 (Hill, et al ., Rapid Commun . Mass Spectrometry, 5: 395, 1991) 을 이용하여 분자량을 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 비교한 결과, 그 값이 일치하는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명의 접힘 구조를 갖는 펩타이드는 MALDI 분석 결과, 분자량 (HPA3-Pro: 2417.2) 이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다.

< 실시예 2> 항균활성 측정

실시예 1의 방법으로 제조된 본원 발명의 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도 (MIC) 값을 측정하였다.

우선, 항균 활성 측정을 위하여 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 (KCTC 1918), 스태필로코쿠스 에피더미디스 (KCTC 1917)와 스태필로코쿠스 아우레우스 (KCTC 1621)를, 그람 음성균으로써 대장균 (KCTC 1682), 살모넬라 티피무리움 (KCTC 1926), 슈도모나스 에루기노사 (KCTC 1637)와 프로테우스 불가리스 (KCTC 2433)를 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아, 각 균주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨; Sigma, USA)에서 중간-로그 상 (mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지 (Difco, USA)로 1×10⁴ 세포/100 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트 (Nunc, USA)에 접종하였다. 실시예 1에서 합성한 본원 발명의 펩타이드 및 표 1의 펩타이드들을 각각 25 μM/웰 (well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 6 시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기 (Merck Elisa reader, 독일)를 이용하여 620 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성

펩타이드	생육 최소저해농도 (μM)
	그람 양성균			그람 음성균
	S. 아우레우스	B. 서브틸리스	S. 에피더미디스	대장균	S. 티피무리움	P. 불가리스	P. 에루기노사
서열번호 1: HP (2-20)	25	12.5	12.5	12.5	3.13	25	12.5
서열번호 2: HPA3	3.13	1.56	3.13	3.13	0.39	3.13	3.13
서열번호 3: HPA3-Pro	0.78	0.39-0.78	1.56	1.56	0.19	1.56	1.56
서열번호 4: 멜리틴	1.56	0.78	3.13	1.56-0.78	0.39	3.13	1.56

그 결과, 본 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 대조군인 서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 32배 이상 높은 항균 활성을 나타내었고, 서열번호 3로 기재되는 HPA3 펩타이드에 비해서는 4배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 서열번호 4로 기재되는 멜리틴 펩타이드에 대해서는 비슷하거나 2배 이상의 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 결과적으로, 본원 발명의 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 기존의 양친화성 펩타이드에 비해 매우 우수한 항균 활성을 나타내었다.

< 실시예 3> 항진균 활성 측정

실시예 1의 방법으로 제조된 본원 발명의 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, MTT 분석에 의한 MIC 값을 측정하였다.

우선, 96-웰 플레이트에 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (TIMM 1768), 트리코스포론 베이겔라이 (KCTC 7707) 및 사카로마이세스 세르비지애 (KCTC 7296)의 각종 진균을 포함한 PDB 배지 (20% 포테이토 인퓨전 프럼, 2% 박토 덱스트로즈; Difco, USA) 100 ㎕씩을 분주한 다음, 본 발명의 항생 펩타이드를 각각 50 μM/웰 (well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가하여 다시 16시간 이상 배양하였다. 이어서, PBS에서 pH 7.4의 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액 (3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,; Amersham life science, USA) 10 ㎕를 모든 웰에 첨가하여 다시 5 내지 6시간 배양하였다. 그 후, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔 (formazan)을 0.04 N HCl-이소프로판올 (isopropanol) 용액 100 ㎕로 잘 용해시킨 후 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 발색되는 정도로 MIC 값을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

항생 펩타이드의 항진균 활성

펩타이드	생육 최소저해농도 (μM)
펩타이드	C. 알비칸스	T. 베이겔라이	S. 세르비지애
서열번호 1: HP (2-20)	25	12.5	25
서열번호 2: HPA3	6.25	3.13	3.13
서열번호 3: HPA3-Pro	3.13	1.56	1.56
서열번호 4: 멜리틴	12.5	3.13	25

그 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드의 항진균 활성을 HP (2-20) 펩타이드와 비교하였을 때, C. 알비칸스, S. 세르비지애 및 T. 베이겔라이의 경우에는 대조군 HP (2-20) 펩타이드 보다 8 내지 16배 정도 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드 보다는 2 내지 16배 정도 더 높은 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다. 결과적으로, 본원 발명의 펩타이드는 병원성 진균 모두에서 기존의 양친화성 펩타이드에 비해 매우 우수한 항진균 활성을 나타내었다.

< 실시예 4> 세포 독성 측정

실시예 1의 방법으로 제조된 접힘 구조를 갖는 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 접힘 구조를 갖는 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다.

우선, 인간 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액 (PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰부터 1/2의 농도로 표 1에 서열번호 1 내지 4로 기재된 펩타이드들을 각각 연속적으로 희석하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈량을, 414 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 비교 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100 (sigma, USA) 을 인간 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였다. 상기 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하고, 하기 수학식 1에 따라 본원 발명의 펩타이드 및 표 1의 펩타이드들의 적혈구 파괴능을 계산하였다.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 ㎚ 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 ㎚ 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 ㎚ 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.

상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

항생 펩타이드의 용혈활성 측정

펩타이드	% 적혈구 파괴능 (각 펩타이드의 농도, μM)
펩타이드	12.5	6.25	3.13	1.56	0.78	0.39	0.19	0.09
서열번호 1: HP (2-20)	0	0	0	0	0	0	0	0
서열번호 2: HPA3	0	0	0	0	0	0	0	0
서열번호 3: HPA3-Pro	0	0	0	0	0	0	0	0
서열번호 4: 멜리틴	100	100	94	76	24	2	0	0

또한, 정상의 사람 혈액으로부터 적혈구만을 분리하여 이들 적혈구에 본 발명의 펩타이드를 최소생육저해농도의 60%만을 처리하고 필터에 거른 후 고정 처리하고 이들의 적혈구가 파괴되는지를 확인하기 위해 무처리군을 음성 대조군으로 하여 본원 발명의 서열번호 3의 펩타이드 처리군과 서열번호 4의 펩타이드 처리군의 전자현미경 관찰을 수행하였다.

그 결과, 본원 발명의 서열번호 3으로 기재되는 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있다(표 4와 도 2).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 접힘 구조를 포함함으로써 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내고, 진균에 대해서도 높은 항진균 활성을 나타내는 서열번호 3으로 기재되는 접힘 구조를 갖는 항생 펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드와 조성물은 세포독성을 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Novel synthetic antimicrobial hinge peptide derived from Ribosomal Protein L1 of Helicobacter pylori and composition therefrom <130> 7P-06-10 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 1 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln 1 5 10 15 Asn Asp Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3 <400> 2 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPA3-Pro <400> 3 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Pro Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mellitin <400> 4 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25

Claims

서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HPA3의 9번째 아미노산인 글루타민산을 프롤린으로 치환시킴으로써 접힘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드.
제 1항에 있어서, HPA3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HP (2-20)의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 소수성 아미노산인 트립토판으로 치환시킴으로써 소수성 부위가 증가한 양친화성 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
제 1항에 있어서, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에 비해 소수성과 유연성 부위가 증대된 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
제 3항에 있어서, 유연성 부위는 항생 펩타이드와 세포막의 결합력 향상을 위한 접힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드.
제 4항에 있어서, 세포막은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막인 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드.
제 1항에 있어서, 프롤린은 '글라이신-이소루이신-글라이신'의 아미노산 세 개가 연결된 구조의 펩타이드로 치환되는 것을 특징으로 하는 서열번호 3으로 기재된 항생 펩타이드.
서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 중 9번째 아미노산이 프롤린으로 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드.
제 7항에 있어서, 상기 상동성은 적어도 95% 인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.
제 1항 또는 제 7항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
제 1항 또는 제 7항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균용 조성물.
제 1항 또는 제 7항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.