KR101667278B1

KR101667278B1 - 미국산 굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101667278B1
Application number: KR1020150115018A
Authority: KR
Inventors: 서정길; 이기영; 남보혜; 정민경; 조상만
Original assignee: 군산대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-14
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2016-10-18

Abstract

본 발명은 미국산 굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수한 미국산 굴의 아가미로부터 유래하는 것으로서 항균 활성이 우수한 펩타이드(American Oyster Defensin, AOD)를 가지고 유사체를 디자인한 것으로서, 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인 하였다. 또한 절감된 아미노산에 불구하고 여전히 항균 활성이 우수하면서, 용혈활성도 보이지 않아 세포 독성이 없는 항균 펩타이드이다. 이뿐만이 아니라 상기 항균 펩타이드는 막 투과성이 낮고, DNA 결합력이 강하여, 막을 직접 공격하기 보다는 막 내에서 DNA에 결합하여 항균 활성을 나타내게 된다. 또한 이러한 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수하기 때문에 이를 항균용 약학 조성물로 하여 항생제 등으로 활용하는 것이 가능하게 된다.

Description

미국산 굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물{Antibacterial peptide derived from American oyster defensin and antibacterial pharmaceutical composition containing the same}

본 발명은 미국산 굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.

항균 펩타이드가 병원균에 작용하는 기작은 기존 항생제들의 작용기전과 매우 다르다. 이들은 주로 미생물의 세포표면에 결합한 후, 세포막에 pore를 형성함으로써 세포막의 정상적 투과특성을 교란하여 병원체를 빠른 속도로 죽게 한다(Pharmacol. Rev. 55: 27-55, 2003). 또한 이들은 병원체의 내독성 인자로 인해 초래되는 패혈증을 방지할 수 있다고 알려져 있으며(Biochim. Biophys. Acta. 1562: 32-36, 2002), 고등동물체내에서 후천성면역반응을 매개하는 신호분자로서도 작용한다고 보고되었다(J. Leukoc. Biol. 60: 415-422, 1996). 이러한 특성으로 인해 항균 펩타이드는 항생제 내성균을 제어할 수 있는 신규 항생제나 새로운 생체면역활성인자로 이용할 수 있을 것으로 주목 받고 있다. 이에 그 동안 기존 항생제를 대체할 수 있는 항생물질을 찾기 위해 다양한 생물체에서 펩타이드성 항생물질이 분리되어 시험 되었다. 그러나 실제 제품화되어 사용되고 있는 사례는 극히 드문데, 이는 펩타이드 항생제가 생체내에 주입되었을 때의 안정성이나 인체에 대한 안전성의 문제가 제기되었기 때문이다.

이러한 난점을 해결하기 위해서는 항균 또는 항진균 활성을 갖는 펩타이드들의 아미노산 서열과 구조를 비교 분석하여 인체에는 위해를 가하지 않으면서 효율적으로 미생물을 사멸시킬 수 있는 구조를 알아내야 한다. 이를 위해서는 지금까지 보고된 것 이상의 다양한 항균 활성 펩타이드의 아미노산 서열과 구조에 대한 정보가 필요한 실정이다.

또한 이러한 문제 이외에도 발견되는 항균 펩타이드를 상용화하기 위해서는 펩타이드의 구조가 복잡하지 않으면서 아미노산 서열도 12-15 개를 넘지 않아 쉽게 합성이 가능하면서 항균 활성도 우수하게 유지되어야만 하지만, 이러한 구조의 항균 펩타이드를 발견하기 위한 노력은 많이 부족한 실정이다.

한편, American Oyster Defensin(AOD)은 미국산 굴의 아가미에서 정제된 arthropod defensin family에 속하는 펩타이드로서 6 개의 Cys을 포함해서 총 38개의 아미노산으로 구성되고, 4265.0 Da의 분자량을 가지며, 강한 항균활력을 가지고 있는 항균 펩타이드이다. 하지만, 이렇게 우수한 항균 활성에도 불구하고 상기 미국산 굴의 펩타이드(AOD)를 항균 펩타이드로 상용화하기에는 아미노산의 수가 너무 많다는 문제점이 있다.

본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1374267호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1은 신규한 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 전복으로부터 분리된 항생 펩타이드에 관한 것으로서 대장균 또는 황색포도상구균에 대하여 항균 활성이 뛰어난 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 특허문헌 1에서는 전복에서 분리한 항균용 펩타이드에 관한 내용만이 개시되어 있을 뿐, 미국산 굴로부터 정제되는 펩타이드(AOD)로부터 유래되는 항균 펩타이드에 관하여는 어떠한 개시 또는 암시조차 되어 있지 않다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-1374267호

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 미국산 굴로부터 유래하며 항균 활성이 우수한 펩타이드(American Oyster Defensin, AOD)를 가지고 상용화가 가능할 정도로 아미노산의 수를 절감하면서 항균 활성도 우수한 항균 펩타이드 유사체(analogue)를 디자인하여 제공하는 것이다. 또한 이렇게 우수한 항균 활성을 가지면서도 용혈활성이 없어 세포 독성이 없으면서 활성이 개선되고 새로운 항균범위를 가지는 항균 펩타이드를 제공하는 것이 목적이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균용 약학 조성물은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하며, 상기 항균 펩타이드는 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수한 미국산 굴의 아가미로부터 유래하는 것으로서 항균 활성이 우수한 펩타이드(American Oyster Defensin, AOD)를 가지고 유사체를 디자인한 것이며, 또한 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인 하였다. 또한 절감된 아미노산에 불구하고 여전히 항균 활성이 우수하면서, 용혈활성도 보이지 않아 세포 독성이 없는 항균 펩타이드이다. 이뿐만이 아니라 상기 항균 펩타이드는 막 투과성이 낮고, DNA 결합력이 강하여, 막을 직접 공격하기 보다는 막 내에서 DNA에 결합하여 항균 활성을 나타내게 된다. 또한 이러한 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수하기 때문에 이를 항균용 약학 조성물로 하여 항생제 등으로 활용하는 것이 가능하게 된다.

도 1은 미국산 굴로부터 유래한 항균 펩타이드(American Oyster defensing, AOD)의 일차구조와 절지동물 디펜신 계열(arthropod defensin family)에 속하는 디펜신(defensing)의 일차구조와의 시퀀스 얼라인먼트(sequence alignment)을 나타내는 것이다.
도 2는 미국산 굴로부터 유래한 항균 펩타이드(AOD)의 유사체로서, 실시예에 따라 디자인 된 항균 펩타이드 유사체들의 E. coli D31과 B. subtilis에 대한 ultrasensitive radial diffusion assay를 나타내는 것이다.
도 3은 미국산 굴로부터 유래한 항균 펩타이드(AOD)의 유사체로서, 실시예에 따라 디자인 된 항균 펩타이드 유사체와 piscidin 1의 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 나타내는 것이다.
도 4는 미국산 굴로부터 유래한 항균 펩타이드(AOD)의 유사체로서, 실시예에 따라 디자인 된 항균 펩타이드 유사체와 amphotericin B의 E. coli ML35p에 대한 내막투과성을 나타내는 것이다.
도 5는 미국산 굴로부터 유래한 항균 펩타이드(AOD)의 유사체로서, 실시예에 따라 디자인 된 항균 펩타이드 유사체들의 DNA에 대한 결합력(DNA-Binding ability)을 나타내는 것이다.

이에 본 발명자들은 American Oyster Defensin(AOD)에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하면서 상용화가 가능한 항균용 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 항균용 펩타이드 및 이를 함유하는 항균용 약학 조성물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되어 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 미국산 굴의 아가미로부터 항균 활성이 우수한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)로부터 유래한 것인데, 상기 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)는 미국산 굴의 아가미에서 발견되었으며, 항균력이 우수한 펩타이드이다. 하지만, 상기 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드(AOD)는 총 38개의 아미노산으로 이루어져 있기 때문에 상용화가 어렵다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드(AOD)에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하게 유지되면서 상용화도 가능한 항균 펩타이드를 개발한 것이다.

상기 항균 펩타이드는 펩타이드 내에 이황화(S-S) 결합을 포함하며, N-말단에는 아세틸기가 결합할 수 있다. 또한 상기 항균 펩타이드는 C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로는 본 발명에 따른 상기 항균 펩타이드는 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드(AOD)에 대한 유사체(analogue)로서 미국산 굴로부터 유래한 펩타이드(AOD)의 C-말단의 루프 지역(loop region)을 바탕으로 디자인된 것이다. 즉, AOD의 C-말단의 루프 지역(loop region)을 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체 디자인의 모체 시퀀스(parent sequence)로 선택된 것이다. 이러한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 각각 9 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 분자 내에 1 개의 이황화 결합(S-S bridge)를 가지고 있으며, N-말단에 아세틸화(acetylation), C-말단의 아미드화(amidation) 또는 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법이 본 발명에 따른 항균 펩타이드의 디자인에 적용된 것이다.

이렇게 디자인된 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수하면서, 상용화가 가능한 것으로서, 용혈활성도 보이지 않아 세포 독성의 문제도 없는 항균용 펩타이드이다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 막 투과성이 낮고, DNA 결합력이 강하여, 막을 직접 공격하기 보다는 막 내에서 DNA에 결합하여 항균 활성을 나타내게 된다. 즉, 목적(target)이 되는 DNA에 결합하여 전사와 번역을 방해함으로써 항균 활성을 나타내는 것이다.

상기 항균 펩타이드는 B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans, A. hydrophila, E. coli, S.enterica, S. sonnei, P. aeruginosa 및 C. albicans로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 상기 항균 펩타이드의 N-말단에는 아세틸기가 결합하는 경우에는 프로테아제(protease)에 대한 저항성을 향상시키는 효과가 보다 향상될 수 있다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 상기 항균 펩타이드의 C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합하는 경우에는 프로테아제(protease)에 대한 저항성 향상과 net-charge를 향상시키는 효과가 보다 향상될 수 있다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 바람직한 일실시예로서 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 아세틸기가 결합하고, C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합한 경우의 효과를 보다 구체적으로 살펴보면 용혈활성이 전혀 나타내지 않으면서 막 투과성도 높지 않다.

또한 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 바람직한 일실시예에 해당하는 것으로서, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드의 효과를 보다 구체적으로 살펴보면 용혈활성이 전혀 나타내지 않으면서 막 투과성도 높지 않을 뿐만 아니라, DNA에 대한 결합력이 현저히 우수하여 막 내에 존재하는 DNA에 결합하는 방식으로 우수한 항균 활성의 효과를 달성하게 된다.

이러한 본 발명에 따른 상기 항균용 약학 조성물은 본 발명의 또 다른 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유함으로써, 항균 활성의 약리효과를 달성하게 된다.

상기 항균 펩타이드는 미국산 굴의 아기미에서 발견된 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)로부터 유래한 것으로서, 상기 항균 펩타이드는 펩타이드 내에 이황화(S-S) 결합을 포함하며, N-말단에는 아세틸기가 결합할 수 있다. 또한 상기 항균 펩타이드의 C-말단에는 아미노기(-NH₂)가 결합하는 것일 수 있다.

한편, 상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.

또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다.

또한 상기 항균 펩타이드는 항균 활성을 보이는 B. subtilis, S. epidermidis, S. mutans, A. hydrophila, E. coli, S.enterica, S. sonnei, P. aeruginosa 또는 C. albicans로부터 대표적으로 유발되는 질병인 식중독, 칸디다즘, 장티푸스, 콜레라 등의 질병을 예방 또는 치료하는 것이 가능하기 때문에 이러한 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하여 상기 질병들의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<재료 및 방법>

시약 및 재료

항균활성 측정을 위한 tryptic soy broth (TSB)와 agarose type I (Low EEO Agar)는 Merck사 (Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 합성물의 정제과정에서 사용된 HPLC용 물과 아세토니트릴(CH₃CN)은 Tedia사(Ohio, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.

항균 펩타이드의 디자인

미국산 굴로부터 발견된 펩타이드인 AOD의 유사체(analogues) 디자인을 위해서 AOD의 C-말단에 위치한 loop region을 모체 펩타이드로 선택하였다. 디자인 된 각 유사체들은 9 개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자 내에 1 개의 이황화 결합(S-S bridge)를 포함하는 기본 구조에 N-말단의 아세틸화(acetylation), C-말단의 아미드화(amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법을 활용하여 디자인되었다.

항균 펩타이드의 합성 및 정제

디자인된 펩타이드는 펩트론(주)(대전)에서 순도 95 % 이상으로 합성 및 정제되어 공급되었다. 유사체들은 펩타이드 합성기 ASP48S (펩트론, 대전 한국)를 사용한 F-moc 고상합상법에 의해서 합성되었고, Shiseido Capcell-Pak C18 column(250 mm × 4.6 mm, 10 μm)을 이용한 RP-HPLC로 정제되었다. 정제 조건은 0.1 %(v/v) trifluoroaceticacid를 포함하는 H₂O-CH₃CN의 용매시스템으로 3-40 %의 농도구배조건으로 220 nm에서 유속 1 ml/min으로 수행되었다. 정제된 펩타이드의 분자량 측정은 liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS; HP1100 series; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 정제된 펩타이드들은 0.01 % 초산에 1,000 ug/mL의 농도로 녹여져서 이후의 실험에 사용되었다.

항균활성측정방법 및 사용균주

실험에 사용된 균주는 그람 양성균 1종(B. subtilis), 그람 음성균 5종(E. coli D31, A. hydrophila, S. enterica, Shigella sonnei, P aeruginosa) 및 yeast 1종(Candida albicans)을 사용하였다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay(URDA)법을 이용하였다. URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양 온도에서 18 시간 동안 pre-culture 후 colorimeter(ProductNo.52-1210, BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도를 84%T(≒ 1 x 108 CFU/ml)가 되게 맞추었다. 그 후, 9.5 ml의 0.03 % TSB, 1 % TypeⅠ agarose 및 10 mM phosphate buffer(PB)(pH 6.5)를 포함하는 underlay gel에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 ml을 넣고 잘 섞은 후에 plate에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 plate에 punch를 사용하여 직경 2.5 mm의 well을 뚫은 후에 5 μl의 각 추출물 및 정제 단계의 샘플을 도입시켰다. 모든 샘플은 0.01 % 아세틱산 5 μl를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다. Sample이 배지에 스며들면 3 시간 동안 1 차 배양한 후, 그 위에 10 ml의 6 % TSB, 1 % 타입Ⅰ 아가로스 및 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)를 포함하는 overlay gel을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18 시간 동안 2 차 배양하였다. 다음날 well 주위에 생긴 clear zone의 크기를 측정하여 항균활성을 확인하였다. 대조군으로는 미국산 잡종 농어의 비만세포에서 유래한 항균 펩타이드로서 항균력은 우수하나 용혈활성이 강력한 piscidin 1을 사용하였다.

용혈활성 ( Hemolysis ) 측정

인간의 적혈구를 이용하여 용혈활성을 측정하였다. 사람의 혈액에 동량의 phosphate buffered saline(PBS, 50 mM sodium phos-phate, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 넣고 혼합한 후 8000 x g, 4 ℃, 1 분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이러한 세척과정을 3 회 반복한 후 얻어진 적혈구를 3 % hematocrit이 되도록 PBS를 첨가하였다. 용혈활성을 측정하기 위해서 3 % hematocrit 90 μl를 e-tube에 도입시키고 10 μl의 각 농도의 추출물 또는 정제물질을 포함하는 sample액을 첨가하였다. 각각의 e-tube를 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 4 ℃에서 10 분간 13,000 x g로 원심분리를 하였다. 얻어진 각각의 상층액에서 70 μl를 취해서 96-well mico-rotiter plate로 옮긴 후 405 nm에서 헤모글로빈 유출 정도를 측정하였다. 적혈구의 100 % 용혈을 위한 실험대조구로는 triton X-100(0.1 %)을 사용하였으며, 다음 식을 사용하여 용혈활성 정도를 계산하였다.

% Hemolysis = [(Abs 405 nm in the peptide solution - Abs 405 nm in buffer) / (Abs 405 nm in 0.1 % Triton X-100 - Abs 405 nm in buffer)] x 100

세균의 내막 투과성( Cytoplasmic membrane permeabilization ) 측정

세균의 내막 투과성 측정은 nonmembrane-permeative chromogenic substrate인 O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 사용해서 E. coli ML35p에 세포질에 존재하는 β-galactosidase의 활성을 측정함으로써 수행되었다. 배양된 Mid-logarithmic phase의 E. coli를 10mM sodium phosphate buffer(NaPB), (pH 7.4)로 세척을 한 후에 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 buffer에 용해시킨다. 그 후, 측정할 펩타이드를 첨가한 뒤 유출된 E. coli의 β-galactosidase에 의한 ONPG의 O- nitrophenol로의 가수분해 정도를 420 nm에서 측정함으로써 수행되었다. Amphotericin B와 0.01 % 초산은 각각 대조군으로서 사용되었다.

DNA - Binding assay

펩타이드의 DNA-binding assay는 DNA와 펩타이드의 배양 후 agarose-gel electrophoresis에서 DNA migration을 저해하는 정도로서 확인하였다. 이를 위해서 1Kb DNA marker, λ-Hind III-digested DNA(50 ng)(Ro -che, Basel, Switzerland)와 각 펩타이드(1 ug)를 혼합해서 37 ℃에서 30 분 반응시킨 후 0.5 μg/mL ethidium bromide(EtBr)를 포함하는 1.0 % agarose gel에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.

실험예

< 실험예 1: 디자인된 AOD 유사체들>

1) American Oyster defensin (AOD)

AOD는 미국산 굴 (Crassostrea virginica)의 아가미에서 정제된 4265 Da의 분자량과 6 개의 Cys을 포함하는 arthropod defensin family에 속하는 항균 펩타이드이다. AOD는 다른 조개류에서 유래된 arthropod defensin과 높은 서열 유사성을 보였고, 3차 구조에서도 유사한 conformation을 나타내었다(도 1). 단편화된 길이의 활성이 증가된 유사체를 디자인하기 위해서 AOD의 C-말단의 loop region을 유사체 디자인의 parent sequence로 선택을 하였다.

2) AOD analogs(analogues)

AOD의 C-말단의 loop region을 바탕으로 디자인된 3 가지의 유사체(analogue) 펩타이드들에 대한 서열정보는 표 1에 나타내었다. 각 유사체들은 9 개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자 내에 1 개의 이황화 결합을 가지고 있으며, N-말단의 아세틸화(acetylation), C-말단의 아미드화(amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법이 유사체 디자인에 적용되었다. 또한 하기 표 1에 개시된 유사체들의 아미노산 서열은 본 출원에서 A1은 서열번호 1로, A2는 서열번호 2로, A3는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

< 실험예 2: AOD 의 유사체들의 항균활성>

AOD 유사체들과 대조군으로 piscidin 1(미국산 잡종 농어에서 유래된 항균 펩타이드)을 6종의 세균과 1종의 yeast에 대해서 항균활성을 URDA법을 사용해서 측정하였다(도 2). 항균활성 측정 결과, 유사체의 parent peptide인 A0는 모든 종에 대해서 항균활성을 전혀 나타내지 않았으나, 3 가지의 유사체들은 강한 항균활성을 나타내었다(표 2). 특히, A2와 A3은 piscidin 1의 활성과 유사한 정도의 항균활성을 나타내었다. 흥미로운 결과는 유사체들의 모체 펩타이드인 American Oyster defensing(AOD)은 C. albicans에 대해서 거의 항균활성을 나타내지 않았는데 A3는 C. albicans에 대해 항균활성을 나타내었다.

< 실험예 3: AOD 의 유사체들의 용혈활성 >

AOD 유사체의 독성을 확인하기 위해서 유사체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1의 사람의 적혈구(혈액형 B형)에 대한 용혈활성을 측정하였다(도 3).

용혈활성측정 결과, A0~A3는 사람의 적혈구에 대해서 용혈활성을 전혀 나타내지 않았으나, piscidin 1은 12.5 μg/mL의 농도부터 강한 용혈활성을 나타내기 시작하였다. 이러한 결과는 강력한 용혈활성을 가진 piscidin 1과는 대조적으로 A0~A3는 항균활성을 나타내는 농도보다도 훨씬 높은 농도에서도 사람의 적혈구에 대해서 독성이 없음을 나타내는 것이다.

< 실험예 4: Cytoplasmic membrane permeabilization 측정>

AOD 유사체들과 대조군으로 amphotericin B의 bacterial membrane에 대한 투과성을 확인하기 위해서 E. coli ML35p에 대한 내막투과성을 확인하였다. 그 결과, amphotericin B은 강한 세균의 내막 투과성을 나타낸 것과는 달리 AOD 유사체들은 약한 막 투과성을 나타내었다(도 4). 이러한 결과는 AOD 유사체들은 세균의 막을 직접적으로 공격해서 항균활성을 나타내는 기작은 아님을 의미하는 것이다.

< 실험예 5: DNA - Binding assay 측정>

AOD 유사체들의 DNA와의 결합력은 electrophoretic mobility shift assay(EMSA)법을 이용하여 측정하였다(도 5). 그 결과 A0와 A1은 DNA의 전기적 이동에는 영향을 주지 않았으나 A2와 A3은 DNA의 전기적 이동을 완전히 저해하였다. 이러한 결과는 net charge와 C-말단의 amidation은 DNA 결합력에 중요한 역할을 하는 것을 의미하는 것이다.

<결론>

본 발명자들은 새로운 항균 펩타이드를 선발하기 위해서 미국산 굴의 아가미로부터 정제된 항균 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)를 토대로 3가지의 유사체를 디자인하고 고상합성법으로 합성을 하였다. 유사체들은 AOD의 C-말단에 위치하고 있는 2 개의 Cys를 포함하는 loop region을 토대로 아미노산 치환(Gly-> Lys), N-말단의 아세틸화 및 C-말단의 아미드화를 이용해서 디자인되었다. 항균활성과 용혈활성 측정 결과, A1~A3(A1: 서열번호 1, A2: 서열번호 2, A3: 서열번호 3)는 강한 항균활성은 나타낸 반면 적혈구에 대한 용혈활성은 전혀 나타내지 않았다. 반면 유사체들은 항암활성은 나타내지 않았다. 유사체들의 kinetic study와 막 투과성 실험결과 유사체들은 사멸 작용을 나타내지 않았으며 약한 막 투과성을 나타내었다. 반면 A2와 A3는 강한 DNA 결합성을 나타내었다. 이러한 결과는 A1~A3는 세균의 막을 직접 목표로 하는 기작으로 항균작용을 나타내기보다는 막 속으로 투과해 들어가서 DNA와 같은 내막성 물질들과 결합함으로써 항균작용을 나타낸다는 것을 의미하는 것이다. 그러므로 본 실시예에 따라 디자인된 항균용 펩타이드는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생제 대체제 개발을 위한 후보물질로서 활용 가능함을 나타내는 것이다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Kunsan National University <120> Antibacterial peptide derived from American oyster defensin and antibacterial pharmaceutical composition containing the same <130> HPC-6214 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> American oyster defensin <400> 1 Cys Ala Gly Trp Arg Arg Leu Arg Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> American oyster defensin <400> 2 Cys Arg Trp Arg Leu Arg Leu Arg Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> American oyster defensin <400> 3 Cys Arg Arg Trp Arg Arg Arg Arg Cys 1 5

Claims

미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드.
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제1항에 있어서,
상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미니스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 이 콜라이(E. coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학 조성물.
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제5항에 있어서,
상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미니스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 이 콜라이(E. coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물.
미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 칸디다즘 예방 또는 치료용 약학 조성물.
미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 장티푸스 예방 또는 치료용 약학 조성물.
미국산 굴로부터 유래한 펩타이드인 American Oyster Defensin(AOD)의 유사체인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 약학 조성물.