CN115894661B - 一种抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗菌肽及其应用，涉及生物抗菌技术领域。本申请中，基于动植物个体中直接提取的草鱼白细胞介素21序列进行修饰，得到抗菌肽，不仅原料来源更加科学广泛、缩短了制造周期、降低了制造成本、提高了产出率，还针对天然抗菌肽存在的生物活性较低、稳定性差的缺陷对草鱼白细胞介素21序列进行改造，通过对其结构进行优化，增加它的生物活性与稳定性，从而提高其抗菌能力及应用价值，使得抗菌肽逐步代替抗生素用于治疗鱼类疾病，这符合环保与无公害养殖潮流，具有重要的现实和战略意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物抗菌技术领域，具体而言，涉及一种抗菌肽及其应用。
背景技术
草鱼是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等，加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧。而传统的防治方法——抗生素的大量使用虽然在一定程度上治疗了鱼类的疾病，但对其的滥用也带来了负面效应，比如水产品品质下降、环境中药物残留增多、细菌耐药性增加，因此亟需寻找一种能够代替抗生素的药物。
抗菌肽(AP)作为一种新型的抗菌药物，具有小分子量、良好水溶性、广泛的抗菌谱、特殊的作用机制以及它不易产生耐药性等特点，且也能一定程度上抑制病毒、真菌以及寄生虫，成为“替抗”研究热点。由于鱼类生存的水生生物环境中微生物众多，所以抗菌肽是鱼类先天免疫的重要组成部分。然而生物活性较低、稳定性较差是天然抗菌肽一直存在的缺陷，所以需要对天然抗菌肽进行改造，通过对其结构进行优化，增加它的生物活性与稳定性，从而提高其抗菌能力及应用价值，使得抗菌肽逐步代替抗生素用于治疗鱼类疾病，这符合环保与无公害养殖潮流，具有重要的现实和战略意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌肽及其应用，以改善上述问题。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本申请提供了一种抗菌肽，包括：
基于草鱼白细胞介素21基因的氨基酸序列进行修饰后得到的抗菌肽，所述草鱼白细胞介素21基因的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
第二方面，本申请还提供了一种应用于鱼类细菌性疾病治疗的药物，该药物含有上述抗菌肽。
第三方面，本申请还提供了一种抗菌剂，该抗菌剂中包含有上述抗菌肽。
第四方面，本申请还提供了一种饲料添加剂，其特征在于，该饲料添加剂中包含有上述抗菌肽。
本发明的有益效果为：
一方面，本申请中，基于动植物个体中直接提取的草鱼白细胞介素21序列进行修饰，得到抗菌肽，不仅原料来源更加科学广泛、缩短了制造周期、降低了制造成本、提高了产出率，还针对天然抗菌肽存在的生物活性较低、稳定性差的缺陷对草鱼白细胞介素21序列进行改造，通过对其结构进行优化，增加它的生物活性与稳定性，从而提高其抗菌能力及应用价值，使得抗菌肽逐步代替抗生素用于治疗鱼类疾病，这符合环保与无公害养殖潮流，具有重要的现实和战略意义。
另一方面，本申请中所得抗菌肽可应用于鱼类细菌性疾病治疗的药物，治疗草鱼细菌性肠炎等疾病；还可用作饲料添加剂，从而提高鱼类生存率；还可用作抗菌剂，具有广泛抗菌谱，不易产生耐药性，还可抗真菌、病毒。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明实施例了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域图像普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为阳性对照的抗菌肽信息；
图2为CAMPR3分析抗菌肽氨基酸序列M4的数据分析图；
图3为生物信息学工具对抗菌肽氨基酸序列M4的数据分析图；
图4为第一次吸光度测定实验结果统计图；
图5为第二次吸光度测定实验结果统计图。
图6为平板实验的菌落生长情况图；
图7为平板实验的菌落数统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域图像普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
本发明提供了一种抗菌肽，该抗菌肽是基于草鱼白细胞介素21基因的氨基酸序列进行修饰后得到的抗菌肽，所述草鱼白细胞介素21基因的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
上述抗菌肽的修饰方法包括以下步骤：
步骤S1、抗菌区域序列分析。利用生物信息学工具CAMPR3对草鱼白细胞介素21序列进行分析，首先对该序列的抗菌能力进行预测，再预测获得其中具有抗菌特性的序列片段。
步骤S11、使用CAMPR3对草鱼IL-21氨基酸序列抗菌能力进行分析。在CAMPR3软件中输入已知的草鱼IL-21氨基酸序列，并选择页面中AMP Prediction工具的PredictAntimicrobial Peptides选项先对该序列的抗菌能力进行预测。为了更准确更有效识别出IL-21氨基酸序列中具有抗菌肽特性的片段，接着利用AMP Prediction工具中的PredictAntimicrobial region within Peptides预测获得IL-21氨基酸序列中具有抗菌特性的序列片段IIKSLKSISNESRKKV。
步骤S12、使用HeliQuest与ProtParam对步骤S1分析获得的序列片段IIKSLKSISNESRKKV进行理化特性的分析。其中HeliQuest的主要功能是对α-螺旋肽进行分析与筛选，ProtParam的主要功能是对肽序列进行理化特性的分析。尝试对氨基酸序列进行点突变(增强疏水性的突变：色氨酸(W)、增强电负性的突变：赖氨酸(K))，综合系列突变抗菌肽的数据，得到数据最优抗菌肽，具体表现为将原序列第9个氨基酸S和第11个氨基酸S突变为W，第12个氨基酸R突变为K，即IIKSLKSIWNEWKKKV。并根据PEP-FOLD3分析得到的三维结构，将点突变后的序列与阳性对照多肽进行合并及部分氨基酸序列的删除，具体表现为在点突变后序列的C端加上阳性对照多肽序列，即IIKSLKSIWNEWKKKVIGGIISFFKRLF，并删除第15-19个、第26-28个氨基酸，得到最终的氨基酸序列IIKSLKSIWNKWKKIISFFK。最后，使用CAMPR3、HeliQuest、AMP Prediction、Antimicrobial Peptide Scanner vr.2、AxPEP、PEP-FOLD3等生物信息学工具对氨基酸序列IIKSLKSIWNKWKKIISFFK的抗菌能力进行分析，得分数据越接近1表明其潜在抗菌能力越强，分析的具体结果如图2和图3所示，图2为CAMPR3分析抗菌肽氨基酸序列M4的数据分析图，图3为生物信息学工具对抗菌肽氨基酸序列M4的数据分析图。本步骤成功进行后，得到具有潜在抗菌能力的抗菌肽，该序列是序列表中的SEQ IDNo.2，并将其命名为M4。
步骤S2抗菌实验验证M4的功能：通过吸光度测定实验与平板实验分别验证步骤S12所得抗菌肽的抗菌能力，并与阳性对照抗菌肽的抗菌能力进行比较分析，本实施例中所用的阳性对照抗菌肽的详细信息如图1所示，图1为阳性对照的抗菌肽信息。
步骤S21、吸光度测定实验。
步骤S211、吸光度测定实验原理。
吸光值即OD值表示被检测物吸收掉的光密度，故可以通过检测菌液的吸光值大致评估菌液中菌体的浓度，从而反映其生长状态。如在此过程中采用抗菌肽等处理细菌，如抗菌肽有效则菌液的OD值将减少，如无效，则菌液OD值与对照菌液OD值无显著差异，因此可以通过吸光值的测定评估抗菌肽的抗菌能力。
步骤S212、吸光度测定实验设计。
步骤S2121、本实验所用抗菌肽均由吉尔生物公司合成，保存于-80℃冰箱中。使用时从-80℃冰箱中取出M4和阳性抗菌肽PC并暂时置于冰盒上。抗菌肽于台式高速冷冻离心机中以4℃，12000rpm的条件离心10min。然后每条抗菌肽中加入1mL蒸馏水(浓度为1mg/mL)，涡旋震荡5s，让抗菌肽充分溶解。
步骤S2122、实验用菌为电子科技大学比较免疫学实验室分离、纯化并保存的嗜水气单胞菌。从超低温冰箱中取出存有嗜水气单胞菌菌液的试管，置于冰盒上。无菌环境下提取5μL菌液至洁净的BD管中，并加入TSB培养基溶液5mL。充分混匀后将BD管置于恒温培养振荡器中30℃、180rpm的条件下过夜培养。
步骤S2123、于无菌条件下取TSB培养基溶液各600μL到两个1.5mL EP管中，再将EP管中的培养基溶液加到比色皿中，置比色皿于双光束紫外可见分光光度计中，对仪器进行校零。取出过夜培养的嗜水气单胞菌液，同样在无菌条件下取600μL嗜水气单胞菌菌液测量菌液的OD值，并根据测量值用培养基溶液将其按一定的比例稀释至1OD左右(菌浓度大约为109CFU/mL)。
步骤S2124、第一次吸光度测定实验。
在无菌环境按以下分组均匀混合菌和抗菌肽：
阴性对照组体系为嗜水气单胞菌菌液+蒸馏水；阳性对照组为嗜水气单胞菌菌液+5mg/mL阳性抗菌肽溶液；抗生素组为嗜水气单胞菌菌液+庆大霉素溶液；孵育体系为50μL嗜水气单胞菌菌液/PBS溶液+50μL庆大霉素/抗菌肽/蒸馏水；实验组为嗜水气单胞菌菌液+三个浓度梯度(1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL)的M4，每组各设置3个重复。
用全波长酶标仪在600nm波长测定0h的OD值后，将96孔板放入恒温振荡摇床，30℃孵育，每隔一段时间进行OD值测定，根据OD值判断抗菌肽的抗菌功能。
步骤S2125、第二次吸光度测定实验。
为了确定M4的最小抑菌浓度(MIC)及更好地比较M4和PC在相同质量浓度时的抗菌效果，对实验分组进行以下更改：
阳性对照组为嗜水气单胞菌菌液+1mg/mL阳性抗菌肽溶液；实验组为嗜水气单胞菌菌液+三个浓度梯度(1mg/mL、0.3mg/mL、0.1mg/mL)的M4；其余条件与第一次吸光度测定实验相同。
步骤S2126、吸光度测定实验结果分析。
两次吸光度测定实验结果见图4和图5，图4为第一次吸光度测定实验结果统计图，图5为第二次吸光度测定实验结果统计图。第一次吸光度测定实验中抗菌肽组OD值从0小时开始不断上升，16小时后上升缓慢，到达平台期。M4肽在浓度为0.01mg/mL和0.1mg/Ml时OD值变化与阴性对照组相差不大，在浓度为1mg/mL时起始吸光度较阴性对照组大，最终浓度却比其小，较大浓度(5mg/mL)的阳性对照组也是如此。抗生素组OD值基本没有变化。第二次吸光度测定实验中，M4肽在浓度为1mg/mL和0.3mg/mL时在4小时内表现出OD值下降，随后上升，在21小时后到达OD值上升的平台期，且起始OD值比阴性对照组高，最终OD值比阴性对照组低。M4肽在0.1mg/mL时OD值变化趋势与阴性对照组相差不大，1mg/mL的阳性多肽亦是如此。虽然OD值没有下降的趋势，但是对比OD值的增长值，1mg/mL的M4与5mg/mL的阳性对照组较阴性对照组小，也能说明M4和阳性对照多肽起到了抑制细菌增长的效果。第三次测定中，通过对比OD的增长值，M4在1mg/mL和0.3mg/mL浓度时增长值较阴性对照组小，浓度为0.1mg/mL时与阴性对照组相差不大，1mg/mL的阳性多肽亦是如此，于是可以说明最小抑菌浓度为0.3mg/mL，同时阳性对照多肽和M4相比，相同浓度时明显M4的抗菌效果更好。
步骤S22、平板实验。
步骤S221、平板实验原理。
在平板实验中，可采用嗜水气单胞菌和抗菌肽共同孵育后涂布到固体平板，经适当温度培养后比较菌落数目，从而比较抗菌肽的抗菌能力。
步骤S2211、平板实验设计。
步骤S2212、实验组为1mg/mL的M4，阴性对照组体系为嗜水气单胞菌菌液+ddH2O，阳性对照组为嗜水气单胞菌菌液+5mg/mL阳性抗菌肽溶液，每组4个重复。抗生素组为嗜水气单胞菌菌液+庆大霉素溶液。孵育体系为50μL的嗜水气单胞菌菌液/PBS溶液+50μL的庆大霉素/抗菌肽/蒸馏水，混合均匀。
将孵育体系放入恒温振荡摇床，30℃孵育30min，使得嗜水气单胞菌菌液和抗菌肽溶液充分接触。点燃酒精灯，在酒精灯旁用酒精溶液清洗接种环，再放于酒精灯火焰外焰上灼烧，然后放置在一旁冷却。用移液枪从每个孵育体系中取出100μL混合菌液涂布到TSA固体培养基，置于30℃培养箱中孵育28h，进行菌落计数。
步骤S2213、平板实验结果分析。
典型的菌落生长情况图与菌落数统计图见图6和图7，图6为平板实验的菌落生长情况图，图7为平板实验的菌落数统计图，各组菌落数目M4上的菌落数目明显少于阴性对照组，可以说明M4是有抗菌效果的。
另一方面，本申请中所得抗菌肽可应用于鱼类细菌性疾病治疗的药物，治疗草鱼细菌性肠炎等疾病；还可用作饲料添加剂，从而提高鱼类生存率；还可用作抗菌剂，具有广泛抗菌谱，不易产生耐药性，还可抗真菌、病毒。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域图像的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域图像的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种抗菌肽，其特征在于：基于草鱼白细胞介素21基因的氨基酸序列进行修饰后得到的抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
2.一种应用于鱼类细菌性疾病治疗的药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求1所述的抗菌肽。
3.一种抗菌剂，其特征在于，所述抗菌剂中包含有如权利要求1所述的抗菌肽。
4.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中包含有如权利要求1所述的抗菌肽。
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