CN113754750A - 一种抗菌肽及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽及其在水产养殖中的应用，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过生物信息学分析以及对于鲫NK‑lysin蛋白质三维空间结构的拟合，选择并人工合成了一段长度为18aa的小分子多肽caNKL2102‑119，研究发现该小分子多肽具有优异的抗菌和抗病毒活性，且不易产生耐药性，同时合成序列短，分子量小，化学合成难度小，生物活性高，在可杀死生物体内的病原菌的基础上，大大节约了规模化生产的成本，有望成为水产养殖中抗生素的有效替代品，具有较高的经济价值和生产应用价值，并且所述抗菌肽可抑制鲤春病毒血症病毒(SVCV)的复制，为水产抗病毒药物的制备提供了新思路，有利于相关水产病毒性疾病的防控。

Description

一种抗菌肽及其在水产养殖中的应用
技术领域
本发明属于抗菌肽技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其在水产养殖中的应用。
背景技术
抗生素的发现及临床应用为人类控制感染性疾病提供了强有力的手段。然而抗生素滥用导致的抗生素耐药性问题目前已成为威胁全球健康的最大隐患之一。研究表明，研制一种新型抗生素大约需要十年或更长的时间，而细菌产生耐药性的时间却不足两年，新药的研制速度远远跟不上细菌耐药性产生的速度。而一旦出现拥有多种抗性基因的“超级细菌”，人们将对其无药可用。事实上，抗生素耐药性问题与全球在人类农业和医学中过度使用抗生素以及抗生素抗性细菌的逐渐增加有关。这是由于畜禽等养殖动物占用了80％的抗生素消耗量，而剩余的20％用于人类医疗。近年来，水产养殖业逐渐成为促进社会经济发展的重要支柱，也因此水产养殖业成为了全球抗菌剂耐药性传播的关键领域之一。如何寻找新型抗菌剂，以对抗鱼、虾、蟹、贝类等食用水产品的细菌感染成为了亟需解决的问题。与此同时，畜禽及水产等养殖业中病毒病的流行迫使科学界正在不断寻找新的抗病毒分子。因此，在加强规范畜禽及水产等养殖业抗生素使用的同时，寻找全新类型的抗生素替代物是缓解抗生素耐药性问题的关键步骤，也是推进无抗养殖及促进畜禽产业转型升级的关键举措。
抗菌肽(AMP)因抗菌活性高、抗菌谱广、种类多、可供选择的范围广、靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。作为先天免疫系统的重要组成部分，AMP具有多种作用，包括广泛的抗菌活性和对先天性免疫途径的调节。例如，β-防御素是鱼类中唯一的防御素类型，已证明其对细菌和病毒感染均具有免疫作用。目前，抗菌肽在水产养殖业中的应用研究备受关注，诸如淡水小龙虾、红沼泽小龙虾、鳟鱼、比目鱼等养殖过程中，抗菌肽的应用均起到了重要作用。有报道称，抗菌肽可以对水生动物的生理功能、消化率、成活率及机体免疫力产生影响。而且抗菌肽的抗菌机理与抗生素完全不同，不易产生耐药性。作为一种绿色、安全、无残留的生物制剂，抗菌肽应用前景广阔。
鲫(Carassius auratus)，作为我国最常见的经济淡水鱼类，根据2019年渔业统计年鉴，其年产量已高达277万吨。但由于易受到嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌以及鲤疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)等病原微生物的感染，人工养殖鲫的可持续发展受到了相当大的威胁。加之目前限制使用抗生素或进行无抗生素养殖已成为全球共识，因此寻找全新类型的抗生素替代物成为亟需解决的问题。
然而目前有关抗菌肽的应用研究还存在些许问题：比如抗菌肽的天然提取资源有限，工艺复杂，成本昂贵；化学合成肽类则成本太高，产业化困难；而基因工程方法存在抗菌肽的抗菌、抗病毒能力使其难以用常用的细菌、病毒作表达体系，抗菌肽分子量较小且容易被蛋白酶水解，分离纯化工艺复杂，基因表达产量还不高等。因此，通过研究设计出结构简单、生物活性高的抗菌肽是抗菌肽研究开发领域的当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新型抗菌肽，本发明基于鲫NK-lysin的结构分析，从中特殊选取了一段具有高生物活性的抗菌肽caNKL2102-119，通过人工体外合成并验证了其具有优异的抗菌和抗病毒活性，并且该抗菌肽合成序列短，分子量小，化学合成难度小，生物活性高，有望成为水产养殖中抗生素的有效替代品，具有极高的生产应用价值。
本发明的目的之一在于提供了一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示。
进一步地，所述抗菌肽来源于鲫的NK-lysin蛋白。
本发明的目的之二在于提供了所述抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用。
进一步地，所述抗菌肽通过与细菌的细胞膜结合并对细胞膜产生去极化活性，破坏细胞膜的完整性，诱导细菌死亡。
进一步地，所述细菌感染包括：大肠杆菌感染和/或金黄色葡萄球菌感染和/ 或嗜水气单胞菌感染。
进一步地，所述抗菌肽的最小抑菌浓度为3-6μg/mL。
本发明的目的之三在于提供了所述抗菌肽在制备抗病毒感染药物中的应用。
进一步地，所述抗病毒感染为抗鲤春病毒血症病毒感染。
进一步地，所述抗菌肽通过抑制鲤春病毒血症病毒的复制，达到抗鲤春病毒血症病毒感染的作用。
本发明的目的之四在于提供了所述抗菌肽在制备用于治疗水产养殖中细菌性感染和/或病毒性感染所致疾病的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过生物信息学分析以及对于鲫NK-lysin蛋白质三维空间结构的拟合，选定了caNK-lysins2中“saposin B”功能域的氨基酸序列作为合成肽的靶标，通过人工合成的方法获得了一段长度为18aa的小分子多肽 caNKL2102-119，其合成序列短、分子量小，化学合成难度小，在能够良好特异性地杀死生物体内的病原菌的基础上，大大节约了规模化生产的成本，具有较高的经济价值。
(2)本发明所述的抗菌肽caNKL2102-119具有广谱抗菌活性，可杀灭或抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌，最低抑菌浓度MIC为3-6μg/mL，与其他重组NK-lysin的MIC相比，如卵形刺鲀为25-100μg/mL，大黄鱼为24-96μg/mL，本发明所述抗菌肽显示出更强的杀菌能力，并且其独特的破坏机制和胞内杀菌机制不易产生耐药性，为在水产养殖过程中控制抗生素滥用引起的细菌耐药和耐药基因的大规模筛选提供新的解决方案，具有较大的社会经济价值和广泛的应用前景。
(3)本发明所述的抗菌肽caNKL2102-119能够抑制SVCV病毒的复制，为水产抗病毒药物的制备提供了新思路，有利于相关水产病毒性疾病的防控。
附图说明
图1为本发明实施例1中NK-lysins氨基酸序列多重比对结果图；
图2为本发明实施例1中caNK-lysins1与caNK-lysins2以及caNKL2102-119的氨基酸序列比对结果图；
图3为本发明实施例1中caNK-lysins1与caNK-lysins2的二极结构预测结果图；
图4为本发明实施例1中caNK-lysins1与caNK-lysins2的蛋白质三维结构预测结果图；
图5为本发明实施例2中抗菌肽caNKL2102-119对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌的抑菌效果及其MIC曲线；
图6为本发明实施例3中抗菌肽caNKL2102-119的细胞毒性检测结果；
图7为本发明实施例4中抗菌肽caNKL2102-119对大肠杆菌和嗜水气单胞菌细胞膜作用的电镜检测结果；
图8为本发明实施例5中抗菌肽caNKL2102-119对SVCV病毒的抗病毒活性测定和病毒噬菌斑测定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1抗菌肽caNKL2102-119的选取与合成
1.鲫NK-lysins序列的获得
为了找出鲫中可能的AMP基因，以斑马鱼、草鱼、虹鳟、鲤等的AMP基因序列为参考，以鲫转录组与基因组为数据库，利用BLASTN与BLASTX程序搜索鲫AMP同源基因，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的 BLASTP搜索程序分析获得的鲫AMP同源序列与其他报道的鱼类AMP的相似性。并利用ClustalX 2.0对搜索到的AMP氨基酸序列进行多序列比对， MEGA 5.0软件构建系统发育树，结合PCR扩增以及组织定量数据确认获得鲫 NK-lysins序列2段分别命名为caNK-lysins1与caNK-lysins2，多序列比对结果发现NK-lysins序列均含有信号肽、saposin B结构域和6个保守的半胱氨酸(如图1和图2所示，其中图1为多序列比对结果，图2为caNK-lysins1与caNK-lysins2 的氨基酸序列比对结果)。
2.caNKL2102-119的选取与合成
使用Genetyx7.0软件分析NK-lysins的cDNA区域，SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信号肽的切割位点，结合I-TASSER 服务器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)拟合的蛋白质空间结 构，通过SOPMAtool(NPS@SOPMA secondary structure prediction results(ibcp.fr) 预测，其中caNK-lysins1与caNK-lysins2的二极结构预测结果如图3所示，结 果显示，caNK-lysin1二级结构为：a螺旋区域91个氨基酸，占62.76％；延伸链 有13个氨基酸，占8.97％；无规则卷曲区域有41个氨基酸，占28.28％。 caNK-lysin2含有a螺旋区域86个氨基酸，占68.25％；延伸链有7个氨基酸， 占5.56％；无规则卷曲区域有33个氨基酸，占26.19％。并通过蛋白质三维预测 比较caNK-lysin1与caNK-lysin2的3D空间结构，结果如图4-a和4-b所示，综 合比较后从中选取氨基酸序列(N-ELSTTDDAGTICANIGVC-C，如SEQ ID NO. 1所示)，即选取saposin B的共同区域部分，如图4-c所示，通过人工合成的方 式获得了一种新型抗菌肽，将其命名为caNKL2102-119。人工合成由Genscript公 司(中国南京)完成，纯度等级>95％，使用时甲酸作为溶剂溶解。
实施例2抗菌肽caNKL2102-119的抑菌活性验证
采用牛津杯法测试合成肽caNKL2102-119对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌的抗菌活性，用卡那霉素用作阳性对照，溶解载体为甲酸。
先将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌分别划线接种于LB固体培养基(Luria-Bertani培养基)，置于37℃恒温培养箱培养18h，挑取各个菌株的单菌落置于LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养12h。测量菌液的OD630值(溶液在630nm波长处的吸光值)，并将其稀释至1×106CFU/mL。然后将细菌与一系列不同终浓度(1.56至50μg/mL)的抗菌肽溶液在37℃条件下共同孵育24h，随后使用M200 PRO Nano Quant(Tecan,Switzerland)在每个时间点测量在630nm波长处的吸光度来评估对细菌生长的抑制。
同时，利用比浊法检测合成肽caNKL2102-119对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌的抑菌活性。具体方法为：利用PBS分别处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌使其OD630为0.5，并与合成肽caNKL2102-119(20 μg)混合至最终体积2mL，在28℃下孵育30min后利用检测OD630。
所述抗菌肽caNKL2102-119对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及嗜水气单胞菌 的抑菌效果及其MIC曲线如图5所示，结果显示，在含有大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌以及嗜水气单胞菌的LB培养基的孔中，合成肽caNKL2102-119周围出现了 透明的抑菌圈，而阴性对照组周围没有抑菌圈，结果表明caNKL2102-119具有杀 菌活性。检测抗菌曲线表明，caNKL2102-119以剂量依赖性方式抑制受试细菌的生 长，其最小抑菌浓度(MIC)为3-6μg/mL。
实施例3抗菌肽caNKL2102-119的细胞毒性测定
本实施例通过MTT实验检测细胞的活性，进而检验抗菌肽caNKL2102-119对鱼类细胞是否具有毒性。实验中用到的动物细胞为鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosumcyprini cell line，EPC)。
实验原理：进入活细胞的MTT，能够被细胞内的酶作用，生产蓝紫色的结晶，沉淀在细胞内。而死细胞无法形成蓝紫色的结晶。有机溶剂DMSO能够溶解形成的蓝紫色沉淀。用分光光度计，检测样品中蓝紫色结晶的吸光值，可以反映细胞的活性。样品中蓝紫色结晶的吸光值与活细胞数呈正相关。
具体步骤如下：
(1)细胞复苏，把保存在液氮中的鲤上皮瘤细胞(EPC)复苏，培养在 MEM培养基(含有10％的胎牛血清)中，放置在25℃二氧化碳培养箱中培养，传代2 3次，为后续实验做准备。
(2)用0.25％的胰酶处理贴壁的细胞，之后把细胞重悬在不含血清的培养基中，调整细胞浓度1×106个/ml。
(3)把细胞悬液添加到96孔板的小孔中，每孔加100μl，25℃二氧化碳培养箱中培养12h，使细胞贴壁生长。之后向每孔中添加指定浓度的所述抗菌肽 caNKL2102-119溶液孵育48h，PBS(pH7.4)为空白对照。每个样品设置3个平行样，之后把96孔板放在25℃二氧化碳培养箱中继续培养。
(4)向每孔中加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，之后把96孔板放在25℃二氧化碳培养箱中继续培养4h。
(5)4小时后用移液枪吸掉每孔中的液体，每孔加入150μl DMSO溶剂，检测样品在570nm波长时的吸光值。
(6)计算细胞的存活率，细胞存活率＝(处理组OD值/对照组OD值)×100％。
结果如图6所示，毒性实验表明，本发明所述的抗菌肽caNKL2102-119对EPC 的存活率没有明显影响，该结果初步说明本发明提供的抗菌肽caNKL2102-119对鱼类细胞没有毒性，可用于水产养殖中。
实施例4抗菌肽caNKL2102-119对于细菌细胞膜的破坏作用
抗菌肽凭借其快速杀菌效率，不易产生耐药性，成为抗生素最有力的替代者，本发明对caNKL2102-119的杀菌原理进行了初步探究，具体方法如下：
(1)先将大肠杆菌与嗜水气单胞菌分别划线接种于LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养18h，挑取各个菌株的单菌落置于LB液体培养基中， 37℃恒温振荡培养12h，以期达到对数生长期。
(2)取出1ml菌液8000rpm室温离心1min，取出850ul培养基，加入 150ulcaNKL2102-119，对照组添加等体积的PBS溶液，混匀后37℃孵育半小时， 8000rpm室温离心1min，弃上清，加入2.5％戊二醛，混匀，4℃过夜固定。
(3)乙醇梯度脱水：固定后8000rpm离心1min，去上清，PBS溶液清洗三次，按30％、50％、70％、80％、90％的顺序梯度用乙醇脱水，每次加入后静置15min，8000rpm离心1min，最后100％乙醇洗涤两次，条件同前，最后用 300～600ul无水乙醇重悬浮待用。
(4)真空冷冻干燥后，电镜观察细菌细胞膜情况。
电镜检测结果如图7所示，结果显示，所述抗菌肽caNKL2102-119能够与细菌的细胞膜结合，并且具有膜去极化活性，通过破坏细菌膜完整性的方式，诱导细菌死亡，因此不会产生传统抗生素所导致的耐药性问题。
实施例5抗菌肽caNKL2102-119抗病毒活性和病毒噬菌斑测定
本实施例用于验证所述抗菌肽caNKL2102-119的抗病毒活性，具体为抗抗鲤春病毒血症病毒(SVCV)活性。步骤如下：
接种EPC细胞于12孔板，待长到70～80％单层后，吸弃培养液，设置三组处理组，第一组不用caNKL2102-119合成肽进行处理，仅用0.1MOI的SVCV 100 μL吸附细胞，28℃孵育1h，记作SVCV组；另一组将20ug的caNKL2102-119合成肽和0.1MOI的SVCV 100μL共同孵育细胞，28℃孵育1h，记作NK+SVCV 组；第三组先加入20ug的caNKL2102-119合成肽预处理1h，用0.1MOI的SVCV 100μL吸附细胞，28℃孵育1h，记作NK→SVCV组。三组处理完毕后，洗去游离的病毒，加入10％血清的完全培养基，28℃、5％CO2培养箱中继续培养24 h(每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测SVCV-G基因表达水平，定量检测SVCV-G基因的引物序列如下：
F：CGACCTGGATTAGACTTG；
R：AATGTTCCGTTTCTCACT。
储存收集细胞和上清液，分别通过RT-qPCR和病毒斑块测定法检测病毒复制情况，对于噬菌斑的测定，将含病毒的上清液连续稀释10倍(从1×103到 1×106)，并将200μL的溶液接种到单层EPC细胞上，重复3次。吸收1h后， EPC细胞用无血清MEM培养基洗涤，并在含有5％FBS和1.5％羧甲基纤维素钠(Sigma-Aldrich)的MEM培养基中培养。在感染后3d计算可见斑块并计算病毒滴度。检测结果如图8所示，其中图8-a为不同处理组中SVCV-G基因的表达情况，图8-b为不同处理组的EPC细胞中的SVCV病毒滴度测定结果，图8-c 为不同处理组，不同稀释倍数下病毒噬菌斑的检测结果。
结果显示，caNKL2102-119合成肽共孵育(NK+SVCV组)处理后，SVCV-G的 mRNA转录水平明显降低，而先利用caNKL2102-119处理后再进行病毒感染 (NK→SVCV组)同样可以抑制SVCV-G的mRNA转录，但是效果不如其前者。根据噬菌斑和病毒滴度测定结果显示，caNKL2102-119合成肽实验的两组 (NK+SVCV)与(NK→SVCV)均拥有更少的病毒粒子，说明caNKL2102-119抑制了SVCV病毒的复制，从而达到抗SVCV病毒感染的作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种抗菌肽及其在水产养殖中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Leu Ser Thr Thr Asp Asp Ala Gly Thr Ile Cys Ala Asn Ile Gly
1 5 10 15
Val Cys

Claims (10)

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽来源于鲫的NK-lysin蛋白。
3.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽通过与细菌的细胞膜结合并对细胞膜产生去极化活性，破坏细胞膜的完整性，诱导细菌死亡。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌感染包括：大肠杆菌感染和/或金黄色葡萄球菌感染和/或嗜水气单胞菌感染。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽的最小抑菌浓度为3-6μg/mL。
7.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗病毒感染药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗病毒感染为抗鲤春病毒血症病毒感染。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽通过抑制鲤春病毒血症病毒的复制，达到抗鲤春病毒血症病毒感染的作用。
10.如权利要求1所述的抗菌肽在制备用于治疗水产养殖中细菌性感染和/或病毒性感染所致疾病的药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114875036A (zh) * 2022-05-24 2022-08-09 河南师范大学 黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用
CN115894661A (zh) * 2022-08-11 2023-04-04 电子科技大学 一种抗菌肽及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103145822A (zh) * 2013-02-04 2013-06-12 中国科学院海洋研究所 一种鱼类NK-lysin效应因子及其应用
US20130330335A1 (en) * 2010-03-23 2013-12-12 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
CN110295173A (zh) * 2019-06-28 2019-10-01 上海市水产研究所 分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性
CN112940082A (zh) * 2021-04-23 2021-06-11 扬州市扬大康源乳业有限公司 一种抗菌肽及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130330335A1 (en) * 2010-03-23 2013-12-12 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
CN103145822A (zh) * 2013-02-04 2013-06-12 中国科学院海洋研究所 一种鱼类NK-lysin效应因子及其应用
CN110295173A (zh) * 2019-06-28 2019-10-01 上海市水产研究所 分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性
CN112940082A (zh) * 2021-04-23 2021-06-11 扬州市扬大康源乳业有限公司 一种抗菌肽及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: ""antimicrobial peptide NK-lysin-like [Carassius auratus]"", 《GENBANK》 *
YUJUN ZHANG 等: ""Investigation of putative antimicrobial peptides in Carassius gibel, revealing a practical approach to screening antimicrobials"", 《FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY》 *
赖隆永 等: ""抗菌肽NK-lysin生物信息学分析及其抑菌作用研究"", 《江西农业学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114875036A (zh) * 2022-05-24 2022-08-09 河南师范大学 黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用
CN114875036B (zh) * 2022-05-24 2024-02-23 河南师范大学 黄河鲤抗菌肽hepcidin基因酵母表达产物及其应用
CN115894661A (zh) * 2022-08-11 2023-04-04 电子科技大学 一种抗菌肽及其应用
CN115894661B (zh) * 2022-08-11 2024-05-28 电子科技大学 一种抗菌肽及其应用

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