CN110540576B - 一种具有ace抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽及其制备方法，一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽，包括：氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR，且氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽占总数的60％‑68％。一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：制备节旋藻蛋白液；Step2：蛋白变构；Step3：第一步酶解；Step4：第二步酶解；Step5：制备分离液；Step6：二次超滤分离蛋白肽；Step7：第一次洗脱；Step8：第二次洗脱；Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分。

Description

一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋食品加工技术领域，具体是一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽及其制备方法。
背景技术
高血压是一种典型的心血管代谢紊乱疾病，也是动脉粥样硬化、心梗、脑溢血及肾衰竭等疾病的重要诱因。美国心血管健康协会的报告显示，截至2018年全球有超过10亿的高血压患者，因此高血压已经成为全球性健康问题。机体代谢所产生的氧化自由基的积累会损伤内皮细胞，诱发血管炎症反应而造成血管堵塞，导致血压异常升高。血压调节的肾素-血管紧张素-醛固酮系统紊乱也是引起高血压的重要原因。血管紧张素转化酶，简称ACE，是整个调节体系的关键限速酶。一方面，ACE可以将血管紧张素I切割转化为血管紧张素II，引起血管收缩；另一方面，ACE会降解缓激肽，抑制血管舒张，从而导致血压升高。因此，改善氧化应激状态和抑制ACE活性已经成为降血压的重要研究方向。
利用蛋白酶解得到的生物活性肽作为改善某些疾病的功效因子已经成为目前研究的热点和趋势。这些生物活性肽相对于化学合成药物具有易吸收代谢、安全无毒等特点，也不会在体内积累而产生副作用。食源性生物活性肽已被广泛报道具有抗氧化、ACE抑制等多种功能活性，在改善高血压方面具有广阔前景。但目前关于酶解获得的藻蛋白来源的活性肽在抗氧化及ACE抑制活性评价方面鲜有报道。
发明内容
本发明正是针对现有技术存在的不足，提供一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽及一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽，包括：氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR，且氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽占总数的60％-68％。
一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，所述节旋藻粉和溶剂水的比例5:1-8:1；将上述混合溶液加热至95-100℃，搅拌30-60分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液；将得到的节旋藻溶液放入高速剪切机中，处理2-3分钟，得到节旋藻蛋白液；
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到70-75℃，利用超声波发生器经超声波处理20-30分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构；调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为7-10％；
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.4～0.9％；利用复合蛋白酶，在45～60℃的条件下进行酶解反应，反应持续1.5～2.5h，得到第一酶解液；
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.1～0.2％；利用风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续0.5～1.0h；得到第二酶解液；
Step5：制备分离液；往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.1-0.3％；通过硅藻土进行分离，收集分离液；
Step6：二次超滤分离蛋白肽；得到分子量小于2000的蛋白肽液；
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过SephadexG15凝胶分离，洗脱得到洗脱液，通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉；
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离；将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉；
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分；检测第二节旋藻蛋白粉的主要成分含量，确保合格。
作为上述技术方案的改进，在所述step1中，将得到的节旋藻溶液放置，冷却到65-75℃，再放入高速剪切机。
作为上述技术方案的改进，在所述Step2中，采用的超声波频率为60-90KHz。
作为上述技术方案的改进，所述Step3中所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为(1-2)：1：(1-2)。
作为上述技术方案的改进，在加入活性炭之前，将Step4中得到的第二酶解液在95～100℃下保温10-20分钟，再冷却至室温。
作为上述技术方案的改进，所述Step6中的二步超滤法，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
作为上述技术方案的改进，所述Step7中，所述洗脱液从280nm光谱的第二个洗脱峰下收集。
作为上述技术方案的改进，所述Step8中，RP-HPLC的分离以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取17-18分钟收集的分离蛋白肽溶液。
作为上述技术方案的改进，所述Step9中，通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，测定其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为60-68％。
本发明与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：(1)本发明开发的节旋藻蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，产品灰分含量低，小于0.3％。(2)本发明开发的产品具有较好的血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制的功能，IC50值为小于0.07mg/mL，能广泛应用于特需食品和营养食品。(3)本发明利用特定频率超声波技术处理的节旋藻蛋白液，可以明显改善节旋藻蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。(4)开发的产品安全，本发明采用的多种食品级复合蛋白酶，包括碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的节旋藻蛋白肽，不加任何添加剂，为100％节旋藻蛋白肽。(5)本发明开发的蛋白肽，通过活性炭过滤具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。(6)本发明开发节旋藻蛋白肽中分子量小于1000的肽的比例为82％以上，经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离，达到具有较明确的肽的组成，其中LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为60％以上。
附图说明
图1为本发明所述节旋藻蛋白肽的ACE抑制活性实验结果；
图2为本发明节旋藻蛋白肽的抗氧化活性试验结果；
图3为肽段LEILDGDIVR的检测质谱图；
图4为肽段SLIDLLK的检测质谱图；
图5为肽段GDFGISVGR的检测质谱图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。
本发明以节旋藻为原料，经过大量的实验，开发了一种具有较好ACE抑制和抗氧化功能的节旋藻蛋白肽及其制备方法。
一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽，其特征在于，包括：氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR，且氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽占总数的60％-68％。所述蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，所述节旋藻粉和溶剂水的比例5:1-8:1。
将上述混合溶液加热至95-100℃，搅拌30-60分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液。将得到的节旋藻溶液放置，冷却到65-75℃，再放入高速剪切机中，处理2-3分钟，得到节旋藻蛋白液。
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到70-75℃，利用超声波发生器经超声波处理20-30分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构。调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为7-10％。
所述超声波的频率为60-90KHz。
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.4～0.9％。利用复合蛋白酶，在45～60℃的条件下进行酶解反应，反应持续1.5～2.5h，得到第一酶解液。
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.1～0.2％。利用风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续0.5～1.0h。得到第二酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为(1-2)：1：(1-2)。
Step5：制备分离液；将Step4中得到的第二酶解液在95～100℃下保温10-20分钟，再冷却至室温。往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.1-0.3％。通过硅藻土进行分离，收集分离液。
Step6：二次超滤分离蛋白肽；将Step5中所得的分离液通过二步超滤方法进行处理。利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过SephadexG15凝胶(即葡聚糖凝胶G15)分离，洗脱得到洗脱液，所述洗脱液为去离子水。在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的洗脱液。通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉。
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离，所述RP-HPLC的分离以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取17-18分钟收集的分离蛋白肽溶液。将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉。
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉的成分；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，确保其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为60～68％。
所述Step9中，LC-MS/MS为液相二级质谱，是将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测的方法。
根据上述步骤，改变其中参数，得到以下三个实施例：
实施例一
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉50g，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，将上述混合溶液加热至95℃，搅拌30分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液。将得到的节旋藻溶液放置，冷却到65，再放入高速剪切机中，处理2分钟，得到节旋藻蛋白液。
所述节旋藻粉和溶剂水的比例5:1。
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波处理20分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构。调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为7％。
所述超声波的频率为60KHz。
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.4％。利用复合蛋白酶，在45℃的条件下进行酶解反应，反应持续1.5h，得到第一酶解液。
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.2％。利用风味蛋白酶，在50℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续0.5h，得到第二酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为2：1：1。
Step5：制备分离液；将Step4中得到的第二酶解液在95℃下保温10分钟，再冷却至室温。往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.1％。通过硅藻土分离第二酶解液中的大分子大颗粒杂质，收集分离液。
Step6：二次超滤分离蛋白肽；将Step5中所得的分离液通过二步超滤方法进行处理。利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过SephadexG15凝胶(即葡聚糖凝胶G15)分离，洗脱得到洗脱液，所述洗脱液为去离子水。在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的洗脱液。通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉。
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离，所述RP-HPLC的分离以5％乙腈溶液作为洗脱液，取17分钟收集的分离蛋白肽溶液。将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉。
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，得到其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为61％。
测定后的蛋白肽成品为成品一。
实施例二
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉50g，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，将上述混合溶液加热至100℃，搅拌60分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液。将得到的节旋藻溶液放置，冷却到75℃，再放入高速剪切机中，处理3分钟，得到节旋藻蛋白液。
所述节旋藻粉和溶剂水的比例8:1。
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波处理30分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构。调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为10％。
所述超声波的频率为90KHz。
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.9％。利用复合蛋白酶，在60℃的条件下进行酶解反应，反应持续2.5h，得到第一酶解液。
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.1％。利用风味蛋白酶，在60℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续1.0h。得到第二酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为2：1：2。
Step5：制备分离液；将Step4中得到的第二酶解液在100℃下保温20分钟，再冷却至室温。往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.3％。通过硅藻土进行分离，收集分离液。
Step6：二次超滤分离蛋白肽；将Step5中所得的分离液通过二步超滤方法进行处理。利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过SephadexG15凝胶(即葡聚糖凝胶G15)分离，洗脱得到洗脱液，所述洗脱液为去离子水。在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的洗脱液。通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉。
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离，所述RP-HPLC的分离以90％乙腈溶液作为洗脱液，取18分钟收集的分离蛋白肽溶液。将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉。
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，得到其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为63％。
测定后的蛋白肽成品为成品二。
实施例三
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉50g，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，将上述混合溶液加热至98℃，搅拌45分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液。将得到的节旋藻溶液放置，冷却到70℃，再放入高速剪切机中，处理2.5分钟，得到节旋藻蛋白液。
所述节旋藻粉和溶剂水的比例7:1。
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到73℃，利用超声波发生器经超声波处理25分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构。调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为8％。
所述超声波的频率为75KHz。
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.7％。利用复合蛋白酶，在50℃的条件下进行酶解反应，反应持续2h，得到第一酶解液。
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.15％。利用风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续0.8h。得到第二酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为1：1：1。
Step5：制备分离液；将Step4中得到的第二酶解液在98℃下保温15分钟，再冷却至室温。往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.2％。通过硅藻土进行分离，收集分离液。
Step6：二次超滤分离蛋白肽；将Step5中所得的分离液通过二步超滤方法进行处理。利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过SephadexG15凝胶(即葡聚糖凝胶G15)分离，洗脱得到洗脱液，所述洗脱液为去离子水。在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的洗脱液。通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉。
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离，所述RP-HPLC的分离以50％乙腈溶液作为洗脱液，取17分钟30秒收集的分离蛋白肽溶液。将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉。
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，得到其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为62％。
测定后的蛋白肽成品为成品三。
在得到以上三种成品后，确定成品一、成品二、成品三中特定序列的氨基酸含量达标后，还要继续对成品一、成品二、成品三进行血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力的测定试验，以确保其的确具有良好的ACE抑制能力。
按照如下方法进行ACE抑制率的测定：用高效液相色谱在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。
实验一
具体实验过程包括以下步骤：
Step1：确定试样样品，样品一、样品二、样品三分别对应成品一、成品二、成品三。样品四为由实施例的Step1所得的节旋藻蛋白液直接经过冷冻干燥得到的节旋藻蛋白粉。样品五为实施例的Step7中得到的节旋藻蛋白肽粉。样品六为实施例三的Step7中得到的节旋藻蛋白肽粉。
其中参照样品选取氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的多肽，所述参照样品中的多肽分别为根据氨基酸序列LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR人工合成的多肽。
Step2：配置试剂
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3。
ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其最终浓度为5mmol/L。
样品溶液：称取适量样品，加入磷酸盐缓冲液混合。
Step3：确定ACE抑制率的实验条件
调整确定使其实验条件如下：检测波长228nm。流速1mL/min。流动相A为含0.1％三氟乙酸的超纯水，流动相B为含0.1％三氟乙酸甲醇。进样量为10μL且手动进样。
Step4：测定ACE的活性抑制能力；
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100
式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
Step5：测定半抑制浓度；按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。结果见表1。
Step6：节旋藻蛋白肽中分子量分布的测定；
由表1可知，本发明制备的节旋藻蛋白肽具有很好的ACE抑制活性，其IC50值小于0.070mg/mL，节旋藻蛋白肽中分子量小于1000的达到82％以上。不同的酶解顺序，其ACE抑制活性有较大的差异。本方法的测定参照GB/T22729-2008方法测定。
其中，IC50，英文全称为halfmaximal inhibitory concentration，是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。
实验二
具体实验过程包括以下步骤：
Step1：确定试样样品，样品一、样品二、样品三分别对应成品一、成品二、成品三。样品四为由实施例的Step1所得的节旋藻蛋白液直接经过冷冻干燥得到的节旋藻蛋白粉。样品五为实施例的Step7中得到的节旋藻蛋白肽粉。样品六为实施例三的Step7中得到的节旋藻蛋白肽粉。
其中参照样品选取氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的多肽，所述参照样品中的多肽分别为根据氨基酸序列LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR人工合成的多肽。
Step2：清除DPPH自由基能力：取20μg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝[(空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值]×100
Step3：还原力测定：取20μg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH6.6)2.5mL和质量分数为1％的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入质量分数为10％的三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g条件下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和质量分数为1％的三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
根据以上实验，得到的表2为实验样品的抗氧化活性测试结果。从表2可以看出，本发明节旋藻蛋白肽具有较好的抗氧化能力，在20μg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到90％以上，还原力达到0.89以上，是一种较好的抗氧化肽。
本发明针对节旋藻蛋白粉的原料特点，通过对节旋藻的高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有特定氨基酸多肽序列(LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR)的具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽，建立了一套简单高效的多功能藻蛋白肽的制备方法。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽，其特征在于，包括：占总数60%-68%的氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽；
且所述藻蛋白肽由以下方法制备，制备方法包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，所述节旋藻粉和溶剂水的比例5:1-8:1；将上述混合溶液加热至95-100℃，搅拌30-60分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液；将得到的节旋藻溶液放入高速剪切机中，处理2-3分钟，得到节旋藻蛋白液；
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到70-75℃，利用超声波发生器经超声波处理20-30分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构；调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为7-10%；
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.4～0.9%；利用复合蛋白酶，在45～60℃的条件下进行酶解反应，反应持续1.5～2.5h，得到第一酶解液；所述Step3中所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为（1-2）：1：（1-2）；
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.1～0.2%；利用风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续0.5～1.0h；得到第二酶解液；
Step5：制备分离液；往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.1-0.3%；通过硅藻土进行分离，收集分离液；
Step6：二次超滤分离蛋白肽；得到分子量小于2000的蛋白肽液；
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过Sephadex G15凝胶分离，洗脱得到洗脱液，通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉；
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离；将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉；
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分；检测第二节旋藻蛋白粉的主要成分含量，确保合格；
在所述step1中，将得到的节旋藻溶液放置，冷却到65-75℃，再放入高速剪切机；
在所述Step2中，采用的超声波频率为60-90 KHz；
在加入活性炭之前，将Step4中得到的第二酶解液在95～100℃下保温10-20分钟，再冷却至室温；
所述Step6中的二步超滤法，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
所述Step7中，所述洗脱液从280nm光谱的第二个洗脱峰下收集；
所述Step8中，RP-HPLC的分离以5～90%乙腈溶液作为洗脱液，取17-18分钟收集的分离蛋白肽溶液；
所述Step9中，通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，测定其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为60-68%。
2.一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉，将节旋藻粉置于符合饮用水卫生标准的水中，所述节旋藻粉和溶剂水的比例5:1-8:1；将上述混合溶液加热至95-100℃，搅拌30-60分钟，让节旋藻粉完全溶解，得到节旋藻溶液；将得到的节旋藻溶液放入高速剪切机中，处理2-3分钟，得到节旋藻蛋白液；
Step2：蛋白变构；将Step1中得到的节旋藻蛋白液，温度调整到70-75℃，利用超声波发生器经超声波处理20-30分钟，改变节旋藻蛋白的组织结构；调节节旋藻蛋白液中蛋白的含量，使其含量为7-10%；
Step3：第一步酶解；往Step2中得到的节旋藻蛋白液中加入复合蛋白酶进行第一步酶解，其中复合蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.4～0.9%；利用复合蛋白酶，在45～60℃的条件下进行酶解反应，反应持续1.5～2.5h，得到第一酶解液；所述Step3中所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为（1-2）：1：（1-2）；
Step4：第二步酶解；往Step3中得到的第一酶解液中加入风味蛋白酶，所述风味蛋白酶的质量为节旋藻蛋白液质量的0.1～0.2%；利用风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行第二步酶解反应，反应持续0.5～1.0h；得到第二酶解液；
Step5：制备分离液；往第二酶解液中加入活性炭，所述活性炭的质量为第二酶解液质量的0.1-0.3%；通过硅藻土进行分离，收集分离液；
Step6：二次超滤分离蛋白肽；得到分子量小于2000的蛋白肽液；
Step7：第一次洗脱；取分子量为小于2000的蛋白肽液，经过Sephadex G15凝胶分离，洗脱得到洗脱液，通过浓缩、冷冻干燥，得到第一节旋藻蛋白肽粉；
Step8：第二次洗脱；将Step7中得到的第一节旋藻蛋白肽粉，用RP-HPLC，即反相高效液相色谱进行分离；将得到的蛋白肽溶液浓缩，再经过冷冻干燥和打磨，得到具有特定功能的第二节旋藻蛋白肽粉；
Step9：测定第二节旋藻蛋白粉成分；检测第二节旋藻蛋白粉的主要成分含量，确保合格；
所述Step6中的二步超滤法，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤分离液，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜超滤分离液，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
所述Step7中，所述洗脱液从280nm光谱的第二个洗脱峰下收集；
所述Step8中，RP-HPLC的分离以5～90%乙腈溶液作为洗脱液，取17-18分钟收集的分离蛋白肽溶液；
所述Step9中，通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，测定其氨基酸序列为LEILDGDIVR、SLIDLLK、GDFGISVGR的肽的含量为60-68%。
3.根据权利要求2所述的一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述step1中，将得到的节旋藻溶液放置，冷却到65-75℃，再放入高速剪切机。
4.根据权利要求2所述的一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述Step2中，采用的超声波频率为60-90 KHz。
5.根据权利要求2所述的一种具有ACE抑制和抗氧化功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在加入活性炭之前，将Step4中得到的第二酶解液在95～100℃下保温10-20分钟，再冷却至室温。
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