JPH03112999A - ニガウリの生理活性蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄ：ｃａｃｈａｒａｎ
ｔｉａ）の種子に含まれる生理活性蛋白に関する。さら
に詳細には第１図記載のアミノ酸配列で特定される生理
活性蛋白に関する。

本願の蛋白は蛋白合成阻害活性を示す。

「従来技術および解決すべき課題〕 一般に、多くの植物の種子や葉、根には、レクチンと呼
ばれる赤血球凝集活性などを示す蛋白など、多くの生理
活性蛋白が存在していることが知られている。例えば、
ヒマ種子には、レクチン蛋白以外に蛋白合成阻害活性を
示す蛋白が存在し、両蛋白の一次構造はきわめて類似し
ている。

一方、ニガウリの種子にも、赤血球凝集作用を示す蛋白
と、ウィルス増殖抑制活性及び蛋白合成阻害活性を示す
蛋白が存在することが報告されている。この蛋白のウィ
ルス増殖抑制活性に関し、タバコモザイクウィルスの感
染に対して、病徴の抑制効果を示すことが報告されてい
る（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　３７
２５７　（１９８１））。

また、ヘルペスウィルスに対しても増殖抑制活性を示す
ことが報告されている（　Ｆｏａ−Ｔｏｍａｓ　ｉら、
Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７１３２
３　（１９８２））。

Ｂａｒｂｉｅｒｉらは、分子量１１５０００、等電点６
．　　Ｏの赤血球凝集作用を示すレクチン蛋白、及び、
分子量２３０００、等電点８．６の蛋白合成阻害活性を
示す蛋白の精製を報告している（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、　（１９８０）１８６４４３−４５２）。しかし、そ
れ以上の解析は行っておらず、生理活性蛋白の性質、ア
ミノ酸配列については、不明の点が多い。従って、様々
な方面での利用を考える場合、ニガウリの種子に存在す
る蛋白合成阻害活性を示す蛋白をその他の生理活性蛋白
とを正確に区別し、各々の生理活性を明らかにするため
、この蛋白をどうでいできる性質の解明が必要となる。

［課題解決の手段］ 本発明者は、ニガウリの種子に含まれる生理活性蛋白の
性質の解明および全−次構造の決定を目的として研究を
行い、本発明を完成した。

すなわち、まず、生理活性蛋白の精製方法を改良し、ゲ
ル濾過、イオン交換などのカラムクロマトを巧みに組み
合わせることにより、高純度の蛋白合成阻害活性を示す
蛋白を収率良く得ることに成功した。単離した蛋白の分
子量は２９４００、等電点は１０以上で、Ｂａｒｂｉｅ
ｒｉらの報告している蛋白とは異なることが明らかにな
った。次に、単離した本蛋白のトリプシン及びキモトリ
プシンなどのプロテアーゼ処理、及び、ブロムシアン処
理による断片化の条件、さらに、逆相ＨＰＬＣを用いた
各断片の精製条件を検討し、各断片の単離及びアミノ酸
配列の決定に成功した。そして、その結果得られたアミ
ノ酸配列データを総合することにより、本蛋白の一次構
造が第１図に示すアミノ酸配列で示されることを明らか
にした。

本発明により、全−次構造を決定したことから、リジン
等の類縁蛋白の一次構造と比較し、類縁蛋白について得
られている知見を参考にすることに・よって、機能を果
たすために重要な領域を推定することが出来る。また、
本蛋白の一部の配列をもつペプチドを化学合成すること
、もしくは、化学修飾を行うことなどによっても、機能
発現に重要な領域の推定、抗原決定部位の探索などが可
能である。さらに、このアミノ酸配列をコードする塩基
配列をもつＤＮＡを合成し、大腸菌や酵母などの微生物
や、動物もしくは植物などの細胞に導入し発現させるこ
とにより、本蛋白を大量に産生させることが可能である
。また、このアミノ酸配列の一部、もしくは、一部のア
ミノ酸残基を置換したアミノ酸配列をコードする塩基配
列をもつＤＮＡを合成し、大腸菌や酵母などの微生物や
、動物もしくは植物などの細胞に導入し、発現させ、産
生された蛋白の機能を調べることにより、本蛋白の構造
と機能の関係を解明し、より活性の高い有用な蛋白を創
製することができる。

本願の生理活性蛋白は以下の方法で取得できる。

ニガウリの種子を粉砕後、洗浄し、油性物質を除き、蛋
白質を抽出する。抽出液を遠心分離後、沈澱について同
じ操作を繰り返し、硫酸アンモニウムを飽和させて蛋白
を沈澱させ、沈澱を蒸留水に溶解させる。溶解液を脱イ
オン水及び酢酸緩衝液に対して透析後、同緩衝液で平衡
化したセファデックスＧ７５のカラムにかける。蛋白合
成阻害活性を示した溶出画分をリン酸緩衝液に対して透
析後、同緩衝液で平衡化したＣＭ−セルロースのカラム
にかけ、食塩の０から０．３Ｍまでの直線濃度勾配によ
り溶出する。０．０８Ｍの食塩で溶出された画分をリン
酸緩衝液に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎ
ｏ　Ｓカラムにかけ、食塩の０から０．５Ｍまでの直線
濃度勾配により溶出し、精製生理活性蛋白を得る。

得られた精製蛋白をギ酸に溶解して変性させたのち、大
量の脱イオン水に透析してギ酸を除去する。変性蛋白に
トリプシンを添加し、反応させた後、遠心分離により沈
澱と上清を分離し、各々から、逆相カラム（Ａｓａ旧四
ｋＣ，旭化成社）を用いたＨＰＬＣによりトリプシン分
解フラグメントを単離する。溶出は、０．１％のトリフ
ルオロ酢酸を含むアセトニトリルの０％から６０％まで
の直線濃度勾配により行う。同様に、ブロムシアン分解
フラグメントを単離する。

一方、精製蛋白をギ酸に溶解し、ブロムシアンを加え、
反応させ、反応液を大量の蒸留水に対して透析した後、
凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルをギ酸に溶かし、
同溶液で平衡化させたＢｉｏ−ｇｅｌ　　Ｐ−３０カラ
ムにかけ、ギ酸で溶出してゲル濾過し、ブロムシアン分
解フラグメントを精製する。

これらの分解フラグメントを用いて、Ｃｈａｎｇらの方
法（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　９３２０５　（１９７８）
）によりアミノ酸配列の決定を行なう。即ち、精製した
ペプチド断片を、４−Ｎ、Ｎ’　−ジメチルアミノアゾ
ベンゼンイソチオシアネート及びフェニルインチオシア
ネートと反応させる。生成したＤＡＢＩＴＣ−アミノ酸
を、１次元の展開溶媒として酢酸／水（ｌ：２）の混液
、２次元の展開溶媒としてトルエン／ｎ−へキサン／酢
酸（２：　ｌ　：　１）混液を用いた２次元薄層クロマ
トによってアミノ酸配列の決定を行なう。

精製蛋白の蛋白合成阻害活性は例えばＷｏｏｄｗａｒｄ
らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　ＸＸＸ　７２４（１９７４）　）に従い、測定でき
る。即ち、ウサギ網状赤血球ライセードを用いた蛋白合
成系混液に、トリス塩酸バッファーに溶解させた精製蛋
白溶液と、トリチウムラベルしたロイシン溶液を加えて
加温する。

反応混液をガラスのディスクにアプライし、トリクロロ
酢酸溶液中で加熱した後、トリクロロ酢酸溶液で洗浄す
る。ディスクをエタノール：エーテル混液（１：　ｌ）
　、次いでニーデルで洗浄して乾燥させ、残存している
放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する
。添加する精製蛋白の量の増加にともなってロイシンの
取り込みが減少し、精製蛋白の添加により蛋白合成が阻
害されていることを確認する。

以下に実施例をあげ本発明をさらに詳細に説明する。本
発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、この
分野における通常の技術により変更することができる。

［実施例］ 〔ニガウリの種子からの生理活性蛋白の精製］ニガウリ
の種子（タキイ種苗社）をミキサーで粉砕後、石油エー
テルで洗浄し、油性物質を除いた。脱脂粉末に５倍量の
脱イオン水を加え、１０％の塩酸を加えてｐＨを４．０
に調製し、４−６℃で３時間ミキサーで撹はんして蛋白
質を抽出した。遠心分離後、沈澱について同じ操作を繰
り返し、得られた抽出液を合わせ、硫酸アンモニウムを
飽和させて蛋白を沈澱させ、沈澱を少量の蒸留水に溶解
させた。溶解液を脱イオン水及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（
ｐＨ５，０）に対して透析後、同緩衝液で平衡化したセ
ファデックスＧ７５（ファルマシア社）のカラムにかけ
た。溶出パターンを第２図に示す。次に、蛋白合成阻害
活性を示した溶出画分（第２図（、−２画分）を５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）に対して透析後、同緩衝液
で平衡化したＣＭ−セルロース（ファルマシア社）のカ
ラムにかけ、食塩の０から０．３Ｍまでの直線濃度勾配
により溶出した。溶出パターンを第３図に示す。０．０
８Ｍの食塩で溶出された画分（第３図　Ｃ−１画分）を
、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）に対して透析後
、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ　Ｓカラム（ファルマ
シア社）にかけ、食塩の０から０．５Ｍまでの直線濃度
勾配により溶出し、生理活性蛋白をさらに精製した。溶
出パターンを第４図に示す。

〔トリプシン分解フラグメントの分離〕精製蛋白５ｍｇ
を０．５ｍｌのギ酸に溶解して変性させたのち、大量の
脱イオン水に透析してギ酸を除去した。変性蛋白に０．
１ｍｇのトリプシン（シグマ社）を添加し、ｐＨ８，０
で３７°Ｃで７時間反応させた。遠心分離により沈澱と
上清を分離し、各々から、逆相カラム（Ａｓａｈｉｐａ
ｋ　Ｃ；旭化成社）を用いたＨＰＬＣにより分解フラグ
メントを単離した。溶出は、０．１％のトリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの０％から６０％までの直線濃
度勾配により行った。分離した結果の一例を第５図に示
す。

〔ブロムシアン分解フラグメントの分離〕精製蛋白１０
ｍｇを３００μｌの７０％ギ酸に溶解し、ブロムシアン
３５ｍｇを加え、室温、暗所で２００時間反応せた。反
応液を大量の蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥した
。凍結乾燥したサンプルを５０％ギ酸に溶かし、同溶液
で平衡化させたＢｉｏ−ｇｅｌ　　Ｐ−３０カラム（バ
イオラッド社）にかけ、５０％ギ酸で溶出してゲル濾過
し、分解フラグメントを精製した。

〔アミノ酸配列の決定〕

Ｃｈａｎｇ　らの方〆去（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　　９
３２０５　（１９７８））により決定した。　即ち、精
製したペプチド断片を、４−Ｎ、Ｎ’　　−ジメチルア
ミノアゾベンセンイソチオシアネート（ＤＡＢ　ＩＴＣ
、ピアス社）及びフェニルインチオシアネート（ＰＩＴ
Ｃ；半井化学）と反応させた。生成したＤＡＢ　ＩＴＣ
−アミノ酸を、１次元の展開溶媒として酢酸／水（１：
２）の混液、２次元の展開溶媒としてトルエン／ｎ−へ
キサン／酢酸（２：　ｌ　：　ｌ）混液を用いた２次元
薄層クロマト（２，５ｃｍｘ　２．　５　ｃｍ、メルク
社）によって決定した。

〔蛋白合成阻害活性の測定〕

精製蛋白の蛋白合成阻害活性をＷｏｏｄｗａｒｄらの方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｘ
ＸＸ　７２４　（１９７４））を用いて調べた。即ち、
ウサギ網状赤血球ライセードを用いた蛋白合成系混液１
．５０μｌに、２０ｍＭのトリス塩酸バッファー（ｐＨ
７，８）に溶解させた精製蛋白溶液３０μｌと、同しく
２０ｍＭのトリス塩酸バッファー（ｐＨ７，８）に溶解
させた２０μｌのトリチウムラベルしたロイシン（１０
μＣｉ／ｍｌ）溶液を加えて３０℃で６０分間加温した
。反応混液５０μｌをガラスのディスクにアプライし、
１０％トリクロロ酢酸溶液中で１５分間９０−１００℃
で加熱した後、５％のトリクロロ酢酸溶液で洗浄した。

ディスクをエタノール：エーテル混液（１：　１）　、
次いでエーテルで洗浄して乾燥させ、残存している放射
活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。測
定結果を、第６図に示す。添加する精製蛋白の量の増加
にともなってロイシンの取り込みか減少し、精製蛋白の
添加により蛋白合成が阻害されていることが確認できた
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、決定したニガウリの種子に含まれる生理活性
蛋白の全アミノ酸配列を示す。 第２図は、ニガウリの種子に含まれる生理活性蛋白をセ
ファデックスＧ７５のカラムで精製したときの溶出パタ
ーンを示す。 ２８０ｎｍでの吸光度（縦軸）とフラクション番号（横
軸）の関係を表す。 第３図は、ニガウリの種子に含まれる生理活性蛋白をＣ
Ｍ−セルロースカラムで精製したときの溶出パターンを
示す。 一線は２８０ｎｍでの吸光度（縦軸）とフラクション番
号（横軸）の関係を表す。 線はＮ　ａ　Ｃｌ濃度を表す。 第４図は、ニガウリの種子に含まれる生理活性蛋白をＭ
ｏｎｏ　Ｓカラムで精製したときの溶出パターンを示す
。 一線は２８０ｎｍでの吸光度（縦軸）と保持時間（横軸
）の関係を表す。 ・・・線はＮａＣｌｉ度を表す。 第５図は、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによりニガウリ
の種子の生理活性蛋白のトリプシン分解フラグメントを
単離した時の溶出パターンを示す。 −線は２２０ｎｍでの吸光度（縦軸）と保持時間（横軸
）の関係を表す。 線はアセトニトリルの直線濃度勾配を示す。 第６図は、精製蛋白の蛋白合成阻害活性の測定における
精製蛋白添加量とロイシン取込み量の関係を示す図であ
る。 縦軸はコントロール（本願の蛋白添加量が０の時のロイ
シン取込み量）を１００とした時のロイシン取込み量を
表す。 横軸は本願の精製蛋白添加量を示し、蛋白量を２８０ｎ
ｍでの吸光度で表示している。 第１図 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓ
ｅｒ　Ｇ１３ｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒ＋Ｌｅｕ　Ａｒ
ｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒ１
ＨＧｌｕ　Ｖａｌ　ＴｙＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｙ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｈｌｓ
　Ｌｅ＋ＶａｌΔｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　ＭｅＰｈｅ　Ｐ
ｈｅ　Ａｓｎ　　Ｇｕｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｕ　　Ｌｅｕ　Ａｌａ　５ｅ１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　
Ｔｈｒ　Ｇｌ＋Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒ
ｏ工ｌｅ　Ｇｕｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ工１１Ｔｙ
ｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ
　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅ＋Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｉ
ｎ　Ｉｌｅ　ＧｌｘＳｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　
Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｒｌＡｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒ（Ａｒｇ、Ｖａ
ｌＧｉｎＩｌｅＴｈｒＡｓｎＶａｌＴｈｒＳｅｒＬｙｓ
Ｖａコ）Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ ｒ　　Ａｓｎ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒ。 Ｊ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ しＧｌｙＴｙｒＬｅｕ ｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ Ｊ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ ＝　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ Ｊ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ ｌＧｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ ）Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ ）Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　工１ｅ Ｌ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ 工ｌｅ　　Ａｌａ　Ａｌａ 工ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｎ Ａｓｎ　　工ｌｅ　　Ｇｉｎ 工ｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。 Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｈｌｓ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　　Ｐｒ。 工ｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ Ｌｅｕ 第２図 ００ ００ フラクンジン番号 第３図 フラグジョン番号 第４図 保持時間（分） 第５図 保持時間（分）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図記載のアミノ酸配列で特定される生理活性
   蛋白
2. （２）特許請求の範囲第１項記載の蛋白を含有すること
   を特徴とする蛋白合成阻害剤
3. （３）ニガウリの種子から生理活性蛋白を抽出し、精製
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白
   の製造方法