CN103193854A - 桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法 - Google Patents

Abstract

桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法，它涉及桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法。本发明要解决现有制备桦木醇，分离桦木酸存在的收率低，纯度和转化率不高的问题，本发明方法为：对桦树皮原料在碱性条件下进行瞬间的高温高压处理，采用乙醇进行提取，过滤，结晶，再用氯仿/乙醇溶解重结晶，然后桦木醇氧化至桦木酮酸，将桦木酮酸还原至桦木酸；或者将枯草芽孢杆菌、高大毛霉或黄绿蜜环菌发酵菌液与桦木醇及缓冲液共同培养使桦木醇转化成桦木酸。本发明的方法工艺简单，产品纯度高，操作方便，成本低，经济效益显著。

Description

桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法

技术领域

本发明涉及桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法。 

背景技术

最近二十年，羽扇豆烷系列化合物的三萜类用于多种疾病的治疗。其中桦木醇为主要的一种三萜类化合物，广泛地分布在自然界中，并且被应用于好多领域。因此已有大量文献报告桦木醇及其衍生物研究和应用的有重要性。桦木醇及其衍生物的分子结构如下： 

其中，1为桦木醇结构式，2为桦木酸3为齐噋果烷结构式；在这些三萜类化合物中桦木醇是极其重要的一种，因为桦木醇及其衍生物表现有良好的生物学活性。 

桦木醇和桦木酸是两种天然化合物对各类瘤株的抑瘤率达到30%以上,对黑色素瘤B16的效果最好，抑瘤率为51.4%，桦皮素可促进巨噬细胞和脾细胞分泌肿瘤坏死因子(TNE)，增加巨噬细胞的细胞毒性活性。桦皮素的生物学功能包括：抗肿瘤、抗炎抗菌（尤其抗肺结核菌）、抗病毒（尤其艾滋病毒）、抗突变，抗衰老、抗氧自由基，抗缺氧，有戒毒作用，增加免疫机能，护肝保肝等功能。临床试验发现，桦木酸极有可能开发成抗癌药物应用于肝癌、肠癌、胃癌的治疗。另外桦皮素具有极强的抗结核杆菌作用，可用于治疗结核病。最近研究确定桦木醇调控血液中胆固醇，脂肪酸的含量和调节机体对胰岛素的敏感性，同时可减缓动脉粥样硬化斑块的形成，具有重要的研究开发于临床应用价值。现有制备桦木醇，分离桦木酸的方法存在纯度不高，收率较低的问题。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有制备桦木醇，分离桦木酸存在转化不高和收率较低的问题，而提供了桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学和生物转化方法。 

本发明的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，是按照以下步骤进行的： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表 面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为25℃~30℃、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：9~11mL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1：1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌； 

其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下： 

a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV；注入剂量为60×2.6×10¹³~200×2.6×10¹³ions／cm²、靶室真空度为2×10^-3Pa，脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28℃条件下，培养4~5d，挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4~5d，制成含孢子数约10⁵~10⁷cfu／mL的孢子悬浮液； 

b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40-50％的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化； 

所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖、3％的琼脂和余量的水组成； 

发酵液体培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖和余量的水组成； 

底物溶液为质量百分含量为90％的桦木醇溶解于二甲基亚砜而成的浓度为7~8mg／mL的溶液。 

本发明的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法是按照以下步骤进行的： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、取步骤三得到的桦木醇结晶品，在搅拌条件下，用丙酮溶解，然后冷却至5℃~10℃，按桦木醇结晶品与琼斯试剂摩尔比为1：5~7的比例混合均匀，在温度为20℃条件下反应3h，过滤，去除沉淀，收集滤液减压干燥，将干燥后的固相物用乙酸乙酯提取，收集有机相乙酸乙酯，依次用等体积的蒸馏水和等体积的质量百分含量为10%碳酸氢钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，得桦木酮酸粗品；用8~10倍体积乙醚溶解桦木酮酸粗品，过硅胶层析柱，收集柱层析液，减压干燥，得桦木酮酸纯品，然后用硼氢化钠/四氢呋喃还原，生成桦木酸粗提物；将桦木酸粗提物与甲醇按质量体积比为1g：20mL的比例混合，加热煮沸15~20min，冷却至室温重结晶，即得桦木酸； 

其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为1g：2~5mL；步骤四中所述的固相物与乙酸乙酯的质量体积比为1g：10mL，桦木酮酸纯品与硼氢化钠/四氢呋喃的质量体积比为1g：3~5mL。 

本发明具有以下有益效果： 

利用本发明的方法可提高提取纯化生产桦木醇和桦木醇转化成桦木酸的收率，工艺简单（转化和纯化两步），操作方便，节约人力和化学试剂使成本低，经济效益显著。 

本发明桦木醇平均回收率为93.93%，提取收率为85%～90%，粗品纯度为60%~70%，重结晶纯度大于95%。 

本发明对桦树皮原料在碱性条件下进行瞬间的高温高压处理(温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa)，使桦木醇从所含细胞中释放出来以利于提取纯化。 

本发明首先将原料进行碱处理提取脂肪酸，然后是利用微生物的酶系统进行由桦木醇转化成桦木酸，酶法转化，条件温和，转化率较高。适用于规模化生产。 

本发明合成桦木酸的方法：路线短、产率高、操作方便等。桦木酸的a-OH异构体可通过重结晶除去，回收的ct-OH桦本酸再通过氧化还原转化为B-OH桦木酸，为桦木酸纯品，具有多种生物学活性。 

综上所述，本发明是利用生物工程技术和发酵，生化提取纯化方法，从天然桦树皮中提取纯化桦木醇，通过发酵获得黄绿蜜环菌新鲜菌体，以菌体作为生物反应器，将桦木醇转化为桦木酸及其他衍生物，成为临床用药或药物的前体，用于治疗多种肿瘤、降血脂、降胆固醇、降低动脉粥样硬化斑块的形成和提高对胰岛素的敏感性等疾病。因此本发明对于新药的开发和应用具有指导作用。 

附图说明

图1为桦木醇粗提物的HPLC谱图； 

图2为桦木醇粗品的HPLC图谱； 

图3为桦木醇对照品HPLC色谱图。 

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。 

具体实施方式一：本实施方式的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，是按照以下步骤进行的： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为25℃~30℃、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱， 收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：9~11mL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1：1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌； 

其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下： 

a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV；注入剂量为60×2.6×10¹³~200×2.6×10¹³ions／cm²、靶室真空度为2×10^-3Pa，脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28℃条件下，培养4~5d，挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4~5d，制成含孢子数约10⁵~10⁷cfu／mL的孢子悬浮液； 

b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40-50％的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化； 

所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖、3％的琼脂和余量的水组成； 

发酵液体培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖和余量的水组成； 

底物溶液为质量百分含量为90％的桦木醇溶解于二甲基亚砜而成的浓度为7~8mg／mL的溶液。 

利用本实施方式的方法可提高提取纯化生产桦木醇和桦木醇转化成桦木酸的收率，工艺简单（转化和纯化两步），操作方便，节约人力和化学试剂使成本低，经济效益显著。 

本实施方式桦木醇平均回收率为93.93%，提取收率为85%～90%，粗品纯度为60%~70%，重结晶纯度大于95%。 

本实施方式对桦树皮原料在碱性条件下进行瞬间的高温高压处理(温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa)，使桦木醇从所含细胞中释放出来以利于提取纯化。 

本实施方式首先将原料进行碱处理提取脂肪酸，然后是利用微生物的酶系统进行由桦木醇转化成桦木酸，酶法转化，条件温和，转化率较高。适用于规模化生产。 

本实施方式合成桦木酸的方法：路线短、产率高、操作方便等。桦木酸的a-OH异构体可通过重结晶除去，回收的ct-OH桦本酸再通过氧化还原转化为B-OH桦木酸，为桦木酸纯品，具有多种生物学活性。 

综上所述，本实施方式是利用生物工程技术和发酵，从天然桦树皮中提取纯化桦木醇， 通过发酵获得黄绿蜜环菌新鲜菌体，以菌体作为生物反应器，将桦木醇转化为桦木酸及其他衍生物，成为临床用药或药物的前体，用于治疗多种肿瘤、降血脂、降胆固醇、降低动脉粥样硬化斑块的形成和提高对胰岛素的敏感性等疾病。因此本实施方式对于新药的开发和应用具有指导作用。 

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中所述的预备培养具体操作如下：取4mm²~5mm²斜面培养菌丝体，采用无菌水将黄绿蜜环菌丝体稀释成孢子数含量为10⁶cfu/mL的孢子悬浮液，将孢子悬浮液按1%的接种量接种于液体培养基中，在转速为120r/min，温度为25℃~30℃的条件下恒温振荡培养48h，得预备培养液；其中，液体培养基为马铃薯综合培养基，按质量百分含量计，是由2％的可溶性淀粉、1％的葡萄糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.3％的尿素、0.2％的KHPO₄、0.1％的MgSO₄·7H₂O、0.003％的FeSO₄和余量的水组成，pH为7.0。其它与具体实施方式一相同。 

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一至二不同的是：步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:5~8mL。其它与具体实施方式一至二相同。 

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：10mL。其它与具体实施方式一至三之一相同。 

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株50％的高转化率菌株。其它与具体实施方式一至四之一相同。 

具体实施方式六：本实施方式的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法是按照以下步骤进行的： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、取步骤三得到的桦木醇结晶品，在搅拌条件下，用丙酮溶解，然后冷却至5℃~10℃， 按桦木醇结晶品与琼斯试剂摩尔比为1：5~7的比例混合均匀，在温度为20℃条件下反应3h，过滤，去除沉淀，收集滤液减压干燥，将干燥后的固相物用乙酸乙酯提取，收集有机相乙酸乙酯，依次用等体积的蒸馏水和等体积的质量百分含量为10%碳酸氢钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，得桦木酮酸粗品；用8~10倍体积乙醚溶解桦木酮酸粗品，过硅胶层析柱，收集柱层析液，减压干燥，得桦木酮酸纯品，然后用硼氢化钠/四氢呋喃还原，生成桦木酸粗提物；将桦木酸粗提物与甲醇按质量体积比为1g：20mL的比例混合，加热煮沸15~20min，冷却至室温重结晶，即得桦木酸； 

其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为1g：2~5mL；步骤四中所述的固相物与乙酸乙酯的质量体积比为1g：10mL，桦木酮酸纯品与硼氢化钠/四氢呋喃的质量体积比为1g：3~5mL。 

利用本实施方式的方法可提高提取纯化生产桦木醇和桦木醇转化成桦木酸的收率，工艺简单（转化和纯化两步），操作方便，节约人力和化学试剂使成本低，经济效益显著。 

本实施方式桦木醇平均回收率为93.93%，提取收率为85%～90%，粗品纯度为60%~70%，重结晶纯度大于95%。 

本实施方式对桦树皮原料在碱性条件下进行瞬间的高温高压处理(温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa)，使桦木醇从所含细胞中释放出来以利于提取纯化。 

本实施方式合成桦木酸的方法：路线短、产率高、操作方便等。桦木酸的a-OH异构体可通过重结晶除去，回收的ct-OH桦本酸再通过氧化还原转化为B-OH桦木酸，为桦木酸纯品，具有多种生物学活性。 

综上所述，本实施方式是利用生物工程技术和发酵，从天然桦树皮中提取纯化桦木醇，通过发酵获得黄绿蜜环菌新鲜菌体，以菌体作为生物反应器，将桦木醇转化为桦木酸及其他衍生物，成为临床用药或药物的前体，用于治疗多种肿瘤、降血脂、降胆固醇、降低动脉粥样硬化斑块的形成和提高对胰岛素的敏感性等疾病。因此本实施方式对于新药的开发和应用具有指导作用。 

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:5~8mL。其它与具体实施方式六相同。 

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为1g：3.5mL。其它与具体实施方式六或七相同。 

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤四中所述的按桦木醇结晶品与琼斯试剂摩尔比为1：6的比例混合均匀。其它与具体实施方式六至八之一相 同。 

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：步骤四中所述的桦木酮酸纯品与硼氢化钠/四氢呋喃的质量体积比为1g：4mL。其它与具体实施方式六至九之一相同。 

通过以下试验验证本发明的有益效果： 

试验1 

本试验的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化技术的具体操作方法： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗至pH中性，在温度为55~60℃的条件下干燥2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用200mL的质量百分含量为95%的乙醇对步骤一得到15g的处理原料进行回馏提取2h，重复回流提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在60℃，采用布氏漏斗抽滤，收集滤液在温度为4℃条件下结晶，滤出结晶，然后在压力为0.06Mpa，温度为55~60℃的条件下干燥2h，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出杂质，收集溶液在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶，在压力为0.06Mpa，温度为55~60℃的条件下干燥2h，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿与无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、取步骤三得到的10g的桦木醇结晶品，在搅拌条件下，用20mL的丙酮溶解，然后冷却至5~10℃，加入琼斯试剂（桦木醇结晶品与琼斯试剂的摩尔比为1:6，琼斯试剂要缓慢地滴加到桦木酮酸纯品溶液中，同时搅拌，这样以保证高转化效率），然后在温度为20℃条件下反应3h，过滤除去墨绿色沉淀，在压力为0.06Mpa，温度为55~60℃的条件下干燥2h，蒸出丙酮，将残液用乙酸乙酯提取（乙酸乙酯与残液的比例是等体积），收集有机相乙酸乙酯，用等体积的蒸馏水和等体积的质量百分含量为10%碳酸氢钠溶液洗涤，然后有机相用无水硫酸镁干燥，得桦木酮酸粗品；用2倍体积乙醚溶解桦木酮酸粗品，过硅胶层析柱，收集柱层析液，压力为0.06Mpa，温度为55~60℃的条件下干燥2h，得桦木酮酸纯品8.5克，取0.5克桦木酮酸然后用硼氢化钠/四氢呋喃还原，所得到桦木酸粗提物溶解于200毫升甲醇中，加热煮沸20~25min，冷却重结晶，即得0.46克桦木酸。 

本试验得到的桦木酸平均回收率可达97．97%，桦木酸含量可达到96．53%。 

本试验的桦木酸合成路线： 

试验2 

本试验的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化技术的具体操作方法： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗至pH中性，在温度为55~60℃的条件下干燥2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用200mL的质量百分含量为95%的乙醇对步骤一得到15g的处理原料进行回馏提取2h，重复回流提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在4℃，采用布氏漏斗抽滤，收集滤液在温度为4℃条件下结晶，滤出结晶物，然后在压力为0.06Mpa，温度为55~60℃的条件下干燥2h，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出杂质，收集溶液在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶，在压力为0.06Mpa，温度为55~60℃的条件下干燥2h，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿与无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、在液体培养基中加入黄绿蜜环菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液（预备培养液中的黄绿蜜环菌活性细胞浓度为300g/L）；向培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为28℃，转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向100mL的桦木酸转化液中加入100mL的正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸。 

本试验步骤四中所述的预备培养具体操作如下：取4mm²~5mm²斜面培养黄绿蜜环菌丝体，采用无菌水将黄绿蜜环菌丝体稀释成孢子悬浮液（孢子数为10⁶cfu/mL），取1mL孢子悬浮液接种于30mL液体培养基中，然后在转速为120r/min，温度为28℃的条件下恒温振荡 培养5天，得预备培养液；其中，液体培养基为马铃薯综合培养基，按质量百分含量计，是由2％的可溶性淀粉、1％的葡萄糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.3％的尿素、0.2％的KHPO₄、0.1％的MgSO₄·7H₂O、0.003％的FeSO₄和余量的水组成，2%的氢氧化钠调节pH至5.0，然后在温度为12l℃条9件下灭菌30min。 

本试验的黄绿蜜环菌为优化的黄绿蜜环菌，原始菌株保存在黑龙江省科学院微生物研究所菌种保存中心，黄绿蜜环菌的拉丁名为Armillaria luteo-virens，编号为HW006。 

本试验的黄绿蜜环菌优化步骤如下： 

一、选择出发菌株为黄绿密环菌(Armillaria luteo—virens Saec)HW-001，已发表文献详细描述了其获取、培养方法和形态（参见白桦脂醇生产白桦脂酸菌株的低能离子注入选育研究，生物技术2011 3（4）），该菌株保藏于黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心(HW-001)，作为出发菌株其桦木酸的生物转化率为2.0％； 

二、取斜面培养的黄绿密环菌出发菌株，加入10mL无菌水洗脱孢子，得孢子悬浮液，取1mL孢子悬浮液均匀涂布于无菌空平皿，吹干，取镜检无细胞重叠者进行N+离子注入，注入能量为20keV，注入剂量分别为0(CK)、60×2.6×10¹³ions／cm²、80×2.6×10¹³ions／cm²、100×2.6×10¹³ions／cm²、120×2.6×10¹³ions／cm²、200×2.6×10¹³ions／cm²，靶室真空度为2×10^-3Pa，将平皿置于水冷靶台上，以5s脉冲式注入，间隔55s，然后取出平皿，以2mL无菌水洗脱，备用； 

三、将步骤二洗脱后的菌液涂覆在斜面培养基上，于恒温箱中在28℃温度下培养4~5d，观察菌落生长，挑选与黄绿密环菌出发菌株的菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4-5d时间，用无菌水将培养后的菌株制成孢子悬浮液(孢子数为10⁶cfu／mL)，取1mL孢子悬浮液接种于30mL的发酵液体培养基的250mL三角瓶中，置于温度为28℃、转速为120r/min的旋转式摇床上培养2d，然后加入0.2mL的浓度为7.5mg／mL底物溶液(底物溶液为质量百分含量为90％的桦木醇溶解于二甲基亚砜)，继续于温度为28℃、转速为120r／min的摇床上转化培养4d，测定发酵液中桦木醇含量，筛选出桦木酸转化得率高于出发菌株10％的高转化率黄绿密环菌株45株，将45株黄绿密环菌进行编号，编号顺序为HW001至HW045； 

四、在步骤三得到的45株菌中有9株桦木酸转化率为4％的菌株，对这9株菌株进行桦木酸转化率进行验证；其中，菌株HW001、HW002、HW003和HW006桦木酸转化率均高于4％，转化能力较稳定，HW006的桦木酸转化率达到5.34%与出发菌株(桦木酸平均得率2.01％)相比，桦木酸转化率提高165.7％。因此，确定HW006菌株为生物转化桦木酸的应用菌株； 

五、对步骤四得到的HW006菌株连续传代5次，分别发酵培养，测定桦木酸产率平均在 5.20%，即完成黄绿蜜环菌优化；其中，步骤三中的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，按质量百分含量计，是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖、3％的琼脂和余量的水组成；步骤三中的发酵液体培养基，按质量百分含量计，是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖和余量的水组成。 

本试验的桦木醇粗品纯度在60~70%；桦木醇结晶品纯度大于95%，桦木酸平均回收率可达85%。 

通过以下方法验证本发明的桦木醇及桦木酸提取效果： 

1）不同提取方法对桦木醇收率的影响 

通过对“质量百分含量为95%的乙醇、苯、氯仿和甲醇”溶剂提取桦木醇粗提物进行考察，结果表明见表1所示，由表1可知，用甲醇和乙醇作为提取溶剂，收率相同且高于其他溶剂，乙醇对人体健康危害低，所以选用乙醇作为提取溶剂较为理想。 

以质量百分含量为95%的乙醇为提取溶剂获得桦木醇粗提物的纯用HPLC方法测定，测定条件：色谱柱为ODSC18;流动相为甲醇:水(88:12)，紫外检测波长为210nm，柱温30℃；柱压6.4MPa，流速1mL/min。方法：测定样品用0.45μm微孔滤膜过滤，待高效液相基线平稳后，用微量注射器吸取10μl进样(排除注射器中小气泡)，每一样品连续进样三次取平均值，得出峰面积，计算出含量； 

结果如表2和图1所示，粗提取的桦木醇纯度为50~70%，桦木醇收率为70~85%。虽然热回流法提取收率较高，但杂质较多，对检测有一定干扰，故采用本发明方法之前，先用碱性纯水加热煮沸10~30min然后过滤，再用质量百分含量为95%的乙醇溶液正常热回流提取桦木醇，使桦木醇粗提物的收率与纯度均有所提高。 

由此可知，本发明采用“碱性纯水加热煮沸10~30min然后过滤，再用质量百分含量为95%的乙醇溶液正常热回流提取桦木醇”，能够提高桦木醇粗提物的收率与纯度。 

表1 不同提取溶剂对桦木醇粗提物收率的影响 

表2 质量百分含量为95%的乙醇回流溶液提取桦木醇的纯度 

2）不同溶剂体系对桦木醇重结晶效果的影响 

对本发明提取的桦木醇粗品，分别用“乙醇、乙酸乙酯、异丙醇和乙醇/氯仿”溶剂体系进行重结晶处理，结果见表3所示，由表3可知，不同溶剂体系对结晶效果有显著影响，从表中数据可见，氯仿:乙醇(1:20)溶剂体系得到的重结晶桦木醇的纯度与结晶收率最高，是理想的重结晶溶剂体系。 

本发明采用氯仿:乙醇(1:20)体系，溶解桦木醇粗品，完全溶解后，滤除杂质，溶液在4℃重结晶，滤出结晶，减压干燥，得到结晶品。重结晶桦木醇，经HPLC测定，测定条件：色谱柱为ODSC18;流动相为甲醇:水(88:12)，紫外检测波长为210nm，柱温30℃；柱压6.4MPa，流速1mL/min。方法：测定样品用0.45μm微孔滤膜过滤，待高效液相基线平稳后，用微量注射器吸取10μl进样(排除注射器中小气泡)，每一样品连续进样三次取平均值，得出峰面积，计算出含量； 

结果如图2所示，箭头指出重结晶桦木醇峰（帮助加上没有画上），由图2可以得出结论:重结晶桦木醇的纯度很高。 

表3 不同溶剂体系对结晶效果的影响 

Claims (10)

1.桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法是按照以下步骤进行的：

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料；

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品；

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成；

四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为25℃~30℃、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：9~11mL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1：1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌；

其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下：

a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV；注入剂量为60×2.6×10¹³~200×2.6×10¹³ions／cm²、靶室真空度为2×10^-3Pa，脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28℃条件下，培养4~5d，挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4~5d，制成含孢子数约10⁵~10⁷cfu／mL的孢子悬浮液；

b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40-50％的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化；

所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖、3％的琼脂和余量的水组成；

发酵液体培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖和余量的水组成；

底物溶液为质量百分含量为90％的桦木醇溶解于二甲基亚砜而成的浓度为7~8mg／mL的溶液。

2.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤四中所述的预备培养具体操作如下：取4mm²~5mm²斜面培养菌丝体，采用无菌水将黄绿蜜环菌丝体稀释成孢子数含量为10⁶cfu/mL的孢子悬浮液，将孢子悬浮液按1%的接种量接种于液体培养基中，在转速为120r/min，温度为25℃~30℃的条件下恒温振荡培养48h，得预备培养液；其中，液体培养基为马铃薯综合培养基，按质量百分含量计，是由2％的可溶性淀粉、1％的葡萄糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.3％的尿素、0.2％的KHPO₄、0.1％的MgSO₄·7H₂O、0.003％的FeSO₄和余量的水组成，pH为7.0。

3.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:5~8mL。

4.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：10mL。

5.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于所述的筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株50％的高转化率菌株。

6.桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法是按照以下步骤进行的：

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料；

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品；

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成；

四、取步骤三得到的桦木醇结晶品，在搅拌条件下，用丙酮溶解，然后冷却至5℃~10℃，按桦木醇结晶品与琼斯试剂摩尔比为1：5~7的比例混合均匀，在温度为20℃条件下反应3h，过滤，去除沉淀，收集滤液减压干燥，将干燥后的固相物用乙酸乙酯提取，收集有机相乙酸乙酯，依次用等体积的蒸馏水和等体积的质量百分含量为10%碳酸氢钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，得桦木酮酸粗品；用8~10倍体积乙醚溶解桦木酮酸粗品，过硅胶层析柱，收集柱层析液，减压干燥，得桦木酮酸纯品，然后用硼氢化钠/四氢呋喃还原，生成桦木酸粗提物；将桦木酸粗提物与甲醇按质量体积比为1g：20mL的比例混合，加热煮沸15~20min，冷却至室温重结晶，即得桦木酸；

其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为1g：2~5mL；步骤四中所述的固相物与乙酸乙酯的质量体积比为1g：10mL，桦木酮酸纯品与硼氢化钠/四氢呋喃的质量体积比为1g：3~5mL。

7.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:5~8mL。

8.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于步骤四中所述的桦木醇结晶品与丙酮的质量体积比为1g：3.5mL。

9.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于步骤四中所述的按桦木醇结晶品与琼斯试剂摩尔比为1：6的比例混合均匀。

10.根据权利要求6所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学转化方法，其特征在于步骤四中所述的桦木酮酸纯品与硼氢化钠/四氢呋喃的质量体积比为1g：4mL。

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