CN115926013B - 一种葛仙米多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种葛仙米多糖及其制备方法。所述葛仙米多糖的制备方法，包括以下步骤：S1、葛仙米的前处理；S2、低共熔溶剂的制备：加入氢键受体、氢键给体，加热，搅拌，加入水，备用；S3、酶解液配制：称取复合酶，溶解于磷酸缓冲液中，加入激活剂及半胱氨酸，调节溶液pH值，制得酶解液；S4、葛仙米多糖提取：以低共熔溶剂为提取溶剂，加入葛仙米、酶解液、助剂，搅拌，灭酶，分离，精滤，超滤，灭菌，浓缩，脱蛋白，得到葛仙米多糖。本发明的制备方法，能够有效提高对葛仙米多糖的提取率，同时有效去除葛仙米的土腥味。
Description
技术领域
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种葛仙米多糖及其制备方法。
背景技术
多糖是构成生命的四大基本物质之一，具有许多生物活性，如：抗肿瘤、免疫和降血糖及抗病毒等。葛仙米属蓝藻门念珠藻科的一种低等的单细胞蓝藻，研究表明，葛仙米含有丰富的多糖，主要由鼠李糖、墨角藻糖、木糖、甘露糖和半乳糖及葡萄糖等六种糖残基构成的多糖，其分子量分布非常广泛，葛仙米多糖是含有糖醛酸，不含乙酰基、硫酸根和蛋白质的酸性多糖，其中，中性糖含量为66.6％，酸性糖含量为12.8％。
现有从葛仙米中提取多糖的方法包括热水浸提法、超声辅助提取、微波辅助提取和酶法辅助提取，主要步骤包括分预处理、水提、浓缩、沉淀和干燥等步骤，其核心原理是利用多糖在高温下溶于水或者不同浓度的乙醇溶剂。工艺技术路线为:预粉碎→水提→过滤→真空浓缩→乙醇沉淀→冻干→粗品。以上提取工艺均不同程度的存在以下几种缺陷：一是提取方法用时长，溶剂消耗大，造成资源的极大浪费；二是提取过程中不能有效分离藻蛋白等杂质，降低了保湿活性；三是提取率偏低，尤其是中性多糖本身在水中的溶解度不高，导致中性多糖不能充分提取；四是由于需要在加热条件下提取，在提取过程中容易导致多糖不同程度的水解，影响多糖的生物活性；五是由于葛仙米腥味蛋白的影响，具有藻腥味，影响消费者的接受性，常用的脱腥方法主要有酸水解法、酶水解法、大分子包埋法、掩蔽法、发酵法、真空吸脱法、吸附法等，但往往操作步骤繁琐；六是由于纤维素的难溶性问题主要是它稳定的结构，因此较难水解发生水解，从而影响细胞壁活性物质的渗出。
发明内容
本发明旨在提供一种葛仙米多糖及其制备方法。该葛仙米多糖的制备方法，能够有效提高对葛仙米多糖的提取率，同时提取过程中还能够去除葛仙米的土腥味。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种葛仙米多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、葛仙米的前处理；
S2、低共熔溶剂的制备：
加入氢键受体、氢键给体，加热，搅拌，加入水，备用；
S3、酶解液配制：称取复合酶，溶解于磷酸缓冲液中，加入激活剂及半胱氨酸，调节溶液pH值，制得酶解液；
S4、葛仙米多糖提取：以步骤S2中得到的低共熔溶剂为提取溶剂，加入步骤S1前处理得到的葛仙米、步骤S3中配置得到的酶解液、助剂，搅拌，灭酶，分离，精滤，超滤，灭菌，浓缩，脱蛋白，得到葛仙米多糖。
优选地，所述步骤S1葛仙米的前处理包括以下步骤：
S11、清洗：用水洗去葛仙米内的杂质，沥水后于25～30℃条件下用蒸馏水浸泡24h，使葛仙米充分溶胀，每隔6～8h重复换水，脱色，备用；S12、脱色：将S11中蒸馏水浸泡后的葛仙米清洗好，沥去大部分水，加入适量的乙醇，可见溶液颜色逐渐加深，浸泡15～30min后抽滤，除去深褐色的乙醇液，重复3～5次，此时可见乙醇的颜色变为淡红色；
S13、烘干：将步骤S12处理后的葛仙米于40～50℃烘箱内烘干24～48h，备用；
S14、粉碎：将步骤S13烘干后的葛仙米粉碎，过60～80目筛，备用；
S15、脱脂：取过筛后的葛仙米置于提取器，圆底烧瓶内加入适量的甲醇，加热回流6～8h进行脱脂，备用。
优选地，所述葛仙米多糖的制备方法，至少包括以下(1)～(2)中的一项：
(1)所述氢键受体包括氯化胆碱、甜菜碱、尿囊素、小檗碱、咖啡碱、茶碱、脯氨酸中的至少一种；
(2)所述氢键给体包括甘油、1，2-丙二醇、乙二醇、柠檬酸、尿素、草酸、乳酸、葡萄糖、丙酸、乙酸、乙酰丙酸中的至少一种。
优选地，所述步骤S3中的复合酶为木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比为(1～2)：(3～5)：(3～4)。
优选地，所述步骤S3中助剂为质量分数为50％的DMSO溶液。
优选地，所述助剂与低共熔溶剂的体积比为1：(3～5)。
优选地，所述葛仙米多糖的制备方法，至少包括以下(1)～(5)中的一项：
(1)步骤S2中所述氢键受体、氢键给体、水的摩尔比为1：(2～3)：0.3；
(2)步骤S4中所述低共熔溶剂的加入量为葛仙米总量的15～25倍；
(3)步骤S4中所述加入的酶解液与低共熔溶剂的体积比为1：(2～3)；
(4)步骤S4中所述搅拌的条件为于30～40℃搅拌6～8h；
(5)步骤S4中所述灭酶的条件为于95℃灭酶0.5h。
优选地，所述葛仙米多糖的制备方法，至少包括以下(1)～(3)中的一项：
(1)步骤S3中所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/ml，pH值为7.2；
(2)步骤S3中所述激活剂为EDTA；
(3)步骤S3中所述调节溶液pH值为调节溶液pH至6～7。
优选地，步骤S4中所述脱蛋白的操作方法为：将正丁醇与三氯甲烷的混合溶液，与浓缩后的溶液按1：1比例混合，充分振荡，20min后用离心机离心，得到葛仙米多糖。
本发明还请求保护一种所述葛仙米多糖的制备方法制备得到的葛仙米多糖。
本发明选用低共熔溶剂作为葛仙米的提取溶剂，辅助以复合酶进行提取，低共熔溶剂和多糖分子之间的氢键相互作用对葛仙米多糖的溶解度起着关键作用，而葛仙米多糖在低共熔溶剂中的溶解性又能够进一步影响酶促反应过程中的传质效应。同时本发明还在提取溶液中加入了助剂DMSO溶液，其特殊的结构特性，提高了生物质的孔隙率，增加了纤维素的溶解作用，继而表现为与复合酶产生协同作用，显著提高葛仙米多糖的提取率及纯度。
本发明选用特定比例的木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶作为复合酶进行葛仙米多糖的提取，可以有效水解葛仙米内大分子蛋白，显著降低葛仙米多糖的腥味以及提高制得产品的纯度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、借助天然低共熔溶剂性特性，增加复合酶的活性，从而增加对葛仙米的破壁作用，提高葛仙米多糖的提取率，另外利用复合酶的对于蛋白质水解特殊作用，在效地保持葛仙米多糖结构的同时，去除了土腥味，提高多糖的提取率。
2、本发明通过在低共熔溶剂中添加了一定比例的助剂溶液，与复合酶产生协同作用，有效提高对葛仙米多糖的提取率。
3、复合酶在低共熔溶剂中使葛仙米蛋白发生不同程度的水解，提高了葛仙米多糖的纯度，从而增加了葛仙米多糖的保湿作用。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的葛仙米多糖的液相色谱图。
图2为本发明实施例2制得的葛仙米多糖的液相色谱图。
图3为本发明实施例3制得的葛仙米多糖的液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例、对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例和对比例中对于葛仙米的前处理，具体步骤如下：
S11、清洗：称取葛仙米100克，加入三倍量的蒸馏水，用水洗去葛仙米内的杂质，沥水后于30℃条件下用蒸馏水浸泡24h，使葛仙米充分溶胀，每隔6h重复操作，脱色，备用；
S12、脱色：将步骤S11中蒸馏水浸泡后的葛仙米清洗好，沥去大部分水，加入适量的乙醇，可见溶液颜色逐渐加深，浸泡30min后抽滤，除去深褐色的乙醇液，重复3次，此时可见乙醇的颜色变为淡红色，停止脱色；
S13、烘干：将步骤S12处理后的葛仙米于50℃烘箱内烘干24h，备用；
S14、粉碎：将步骤S13烘干后的葛仙米粉碎，过60目筛，备用；
S15、脱脂：取过筛后的葛仙米置于提取器，圆底烧瓶内加入适量的甲醇，加热回流6h进行脱脂，得到的葛仙米。
实施例1、本发明一种葛仙米多糖的制备方法
S1、葛仙米的前处理；
S2、低共熔溶剂的制备：
加入氯化胆碱、尿素，加热，搅拌，加入水，制成均一、稳定、透明的低共熔溶剂，备用；
S3、酶解液配制：称取100mg复合酶，溶解于100ml磷酸缓冲液(0.1mol/ml，pH＝7.2)中，加入20mg激活剂EDTA及5mg半胱氨酸，调节溶液pH至7，制得酶解液；
S4、葛仙米多糖提取：以100ml步骤S2中得到的低共熔溶剂为提取溶剂，加入步骤S1前处理得到的葛仙米5g、步骤S3中配置得到的酶解液50ml、质量分数为50％的DMSO溶液25ml，于40℃搅拌6h，之后于95℃灭酶0.5h，分离，精滤，超滤，灭菌，浓缩，得到浓缩液，将浓缩液和正丁醇-三氯甲烷混合溶液(正丁醇与三氯甲烷的体积比为5：2)混合，充分振荡，20min后用离心机离心，得到葛仙米多糖。
其中，氯化胆碱、尿素、水的摩尔比为1：2：0.3；
所述复合酶为木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比为1.9：4.6：3.5。
实施例2、本发明一种葛仙米多糖的制备方法
S1、葛仙米的前处理；
S2、低共熔溶剂的制备：
加入甜菜碱、草酸，加热，搅拌，加入水，制成均一、稳定、透明的低共熔溶剂，备用；
S3、酶解液配制：称取100mg复合酶，溶解于100ml磷酸缓冲液(0.1mol/ml，pH＝7.2)中，加入20mg激活剂EDTA及5mg半胱氨酸，调节溶液pH至6，制得酶解液；
S4、葛仙米多糖提取：以100ml步骤S2中得到的低共熔溶剂为提取溶剂，加入步骤S1前处理得到的葛仙米6g、步骤S3中配置得到的酶解液50ml、质量分数为50％的DMSO溶液33ml，于30℃搅拌7h，之后于95℃灭酶0.5h，分离，精滤，超滤，灭菌，浓缩，得到浓缩液，之后将浓缩液和正丁醇-三氯甲烷混合溶液(正丁醇与三氯甲烷的体积比为5：2)混合，充分振荡，20min后用离心机离心，得到葛仙米多糖。
其中，甜菜碱、草酸、水的摩尔比为1：3：0.3；
所述复合酶为木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比为1.5：5：4。
实施例3、本发明一种葛仙米多糖的制备方法
S1、葛仙米的前处理；
S2、低共熔溶剂的制备：
加入咖啡碱、乙二醇，加热，搅拌，加入水，制成均一、稳定、透明的低共熔溶剂，备用；
S3、酶解液配制：称取100mg复合酶，溶解于100ml磷酸缓冲液(0.1mol/ml，pH＝7.2)中，加入20mg激活剂EDTA及5mg半胱氨酸，调节溶液pH至7，制得酶解液；
S4、葛仙米多糖提取：以100ml步骤S2中得到的低共熔溶剂为提取溶剂，加入步骤S1前处理得到的葛仙米4g、步骤S3中配置得到的酶解液34ml、质量分数为50％的DMSO溶液20ml，于40℃搅拌8h，之后于95℃灭酶0.5h，分离，精滤，超滤，灭菌，浓缩，得到浓缩液，之后将浓缩液和正丁醇-三氯甲烷混合溶液(正丁醇与三氯甲烷的体积比为5：2)混合，充分振荡，20min后用离心机离心，得到葛仙米多糖。
其中，咖啡碱、乙二醇、水的摩尔比为1：2：0.3；
所述复合酶为木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比为1：3：3。
对比例1
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，步骤S3中用等量的木瓜蛋白酶替换复合酶。
制备方法参考实施例1。
对比例2
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，复合酶中的木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比为1：1：1。
制备方法参考实施例1。
对比例3
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，不加入质量分数为50％的DMSO溶液。
制备方法参考实施例1。
对比例4
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，低共熔溶剂中氯化胆碱、尿素、水的摩尔比为1：2：1。
制备方法参考实施例1。
对比例5
与实施例1相比，本对比例的区别仅在于，酶解液与低共熔溶剂的体积比为1：4。
制备方法参考实施例1。
试验例一、提取率测定
分别将实施例1～3与对比例1～5提取得到的葛仙米多糖采用苯酚-硫酸法进行含量测定，采用高效液相色谱法进行葛仙米多糖纯度的测定。实验结果如表1所示。
表1各样品的实验结果
从表1中的数据可以得知，本发明实施例的制备方法具有较高的葛仙米多糖提取率，提取得到的葛仙米的纯度较高。
试验例二、保湿效果测试
采用人体功效评价进行保湿功效测试，方法依据QB/T 4256-2011《化妆品保湿功效评价指南》，对实施例1～3以及对比例1～5得到的葛仙米多糖的保湿效果进行测试，测定方法如下：
1)按照QB/T 4256-2011中志愿者的要求，选择20名年龄在18～65岁之间的志愿者；
2)受试部位选择左或右前臂屈侧，共有两个测试区域，分别为产品涂抹区和空白对照区，随机分布在左右手臂标定位置，确保所有产品和空白区域位置在统计学上达到平衡，测试样品均为5％样品水溶液；
3)标记测试区域，试验区域面积至少3cm×3cm，每个测试区域之间间隔至少1cm；
4)使用干的面巾纸擦拭干净双手前臂内侧，在室内(温度20℃～22℃，湿度40％～60％)下适应20分钟，使用Antsci Skin-SP水分探头检测标记区域的初始皮肤水分含量，每个区域重复测试3次，取平均值作为最终测试值；
5)测试样品按(2.0±0.1)mg/cm2的用量进行单次涂抹，使用乳胶指套将试样均匀涂抹在测试区域内(约100ul受试物)，待完全吸收干燥后开始计时，分别在1.5h、3h、6h进行产品区域和对照区域的皮肤水分含量测量，每个区域平行测试3次，同样取平均值作为最终测试值。
实验结果如表2所示。
表2各样品的在不同时间段的皮肤水分含量(％)
| 组别 | 0h | 1.5h | 3h | 6h |
| 空白组 | 42 | 40 | 38 | 39 |
| 实施例1 | 42 | 60 | 55 | 50 |
| 实施例2 | 40 | 59 | 53 | 47 |
| 实施例3 | 41 | 57 | 52 | 46 |
| 对比例1 | 37 | 42 | 39 | 35 |
| 对比例2 | 45 | 50 | 46 | 40 |
| 对比例3 | 38 | 47 | 41 | 36 |
| 对比例4 | 46 | 49 | 48 | 42 |
| 对比例5 | 40 | 48 | 46 | 40 |
从表2中的数据可以得知，本发明实施例提取得到的葛仙米多糖具有较好的保湿效果。
对比例1中只选用单一的木瓜蛋白酶进行酶解，对比例2中加入的复合酶中木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比不合适，制得提取得到的葛仙米多糖的纯度较差，具有的保湿效果也差于实施例；对比例3中不加入DMSO溶液、对比例4加入的低共熔溶剂中氯化胆碱、尿素和水的质量比不合适、对比例5中加入的酶解液与低共熔溶剂的体积比不合适，提取得到的葛仙米多糖所具有的保湿性能较差。
试验例三、腥味测试
选取10名受过专业培训的人员对实施例1～3和对比例1～5制得的葛仙米多糖进行感官评定，感官评分结果越高越好。评分项目以及标准为：基本没有海带腥味，易于接受(80-100分)，稍有淡淡的腥味，能接受(60-80分)，有腥味或腥味过浓，不易接受(0-50分)。实验结果如下表3所示。
表3各样品的腥味评分结果
| 组别 | 腥味评分情况 |
| 实施例1 | 98 |
| 实施例2 | 95 |
| 实施例3 | 96 |
| 对比例1 | 88 |
| 对比例2 | 72 |
| 对比例3 | 80 |
| 对比例4 | 82 |
| 对比例5 | 90 |
从表3中的数据可以得知，本发明实施例1～3的制备方法制得的葛仙米多糖具有的腥味较低，基本不存在腥味，可以更好的满足消费者的需求。
试验例四
将实施例1～3制备得到的葛仙米多糖进行液相色谱分析，色谱分析条件如下所述，结果如附图1～3所示。
色谱分析条件：采用Waters e2695高效液相系统配以凝胶色谱柱TSK PWXL6000和TSK PWXL4000串联，示差折光检测器、DAWN8+激光检测器分析多糖的分子量分布。流动相为含乙腈、0.05mol/L NaH2PO4和0.15mol/L的NaNO3溶液(pH 7.0 0.02％叠氮钠)；流速为0.5mL/min、色谱柱柱温恒定在35℃；激光检测器光源波长选用260nm。标准品：纯化后的葛仙米多糖。
从附图1～3中可以得知，本发明实施例1～3的液相色谱图具有的杂峰较少，表明制得的葛仙迷多糖纯净度较高。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种葛仙米多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、葛仙米的前处理；
S2、低共熔溶剂的制备：
加入氢键受体、氢键给体，加热，搅拌，加入水，备用；
S3、酶解液配制：称取复合酶，溶解于磷酸缓冲液中，加入激活剂及半胱氨酸，调节溶液pH值，制得酶解液；
S4、葛仙米多糖提取：以步骤S2中得到的低共熔溶剂为提取溶剂，加入步骤S1前处理得到的葛仙米、步骤S3中配置得到的酶解液、助剂，搅拌，灭酶，分离，精滤，超滤，灭菌，浓缩，脱蛋白，得到葛仙米多糖；
所述步骤S3中的复合酶为木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素水解酶和中性蛋白酶的质量比为(1～2)：(3～5)：(3～4)；
步骤S3中所述助剂为质量分数为50％的DMSO溶液；
所述氢键受体包括氯化胆碱、甜菜碱、尿囊素、小檗碱、咖啡碱、茶碱、脯氨酸中的至少一种；
所述氢键给体包括甘油、1，2-丙二醇、乙二醇、柠檬酸、尿素、草酸、乳酸、葡萄糖、丙酸、乙酸、乙酰丙酸中的至少一种；
步骤S2中所述氢键受体、氢键给体、水的摩尔比为1：(2～3)：0.3。
2.如权利要求1所述葛仙米多糖的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述葛仙米的前处理包括以下步骤：
S11、清洗：用水洗去葛仙米内的杂质，沥水后于25～30℃条件下用蒸馏水浸泡24h，使葛仙米充分溶胀，每隔6～8h重复换水，脱色，备用；
S12、脱色：将步骤S11中蒸馏水浸泡后的葛仙米清洗好，沥去大部分水，加入乙醇，浸泡15～30min后抽滤，除去乙醇液，重复3～5次；
S13、烘干：将步骤S12处理后的葛仙米于40～50℃烘箱内烘干24～48h，备用；
S14、粉碎：将步骤S13烘干后的葛仙米粉碎，过60～80目筛，备用；
S15、脱脂：取过筛后的葛仙米置于提取器，加热回流6～8h进行脱脂，备用。
3.如权利要求1所述葛仙米多糖的制备方法，其特征在于，所述助剂与低共熔溶剂的体积比为1：(3～5)。
4.如权利要求1所述葛仙米多糖的制备方法，其特征在于，至少包括以下(1)～(4)中的一项：
(1)步骤S4中所述低共熔溶剂的加入量为葛仙米总量的15～25倍；
(2)步骤S4中所述加入的酶解液与低共熔溶剂的体积比为1：(2～3)；
(3)步骤S4中所述搅拌的条件为于30～40℃搅拌6～8h；
(4)步骤S4中所述灭酶的条件为于95℃灭酶0.5h。
5.如权利要求1所述葛仙米多糖的制备方法，其特征在于，至少包括以下(1)～(3)中的一项：
(1)步骤S3中所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/ml，pH值为7.2；
(2)步骤S3中所述激活剂为EDTA；
(3)步骤S3中所述调节溶液pH值为调节溶液pH至6～7。
6.如权利要求1所述葛仙米多糖的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述脱蛋白的操作方法为：将正丁醇与三氯甲烷的混合溶液，与浓缩后的溶液按1：1比例混合，充分振荡，20min后离心，得到葛仙米多糖。
7.一种如权利要求1～6任一所述葛仙米多糖的制备方法制备得到的葛仙米多糖。
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