CN112062868A - 淮山多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物多糖提取领域，公开了一种淮山多糖的提取方法，包括如下步骤：(1)将淮山和尿素‑氯化胆碱低共熔溶剂混合，加热提取，冷却后分离出提取液；(2)将步骤(1)所得提取液与酶混合进行酶解，将酶解产物进行固液分离，得到滤液；(3)醇沉步骤(2)得到的滤液并洗涤，得到粗淮山多糖沉淀。该提取方法能够有效去除淮山中所含有的淀粉，提高淮山多糖的提取效率，而且，该提取方法绿色高效，无污染。

Description

淮山多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及植物多糖提取领域，具体涉及一种淮山多糖的提取方法。
背景技术
淮山，又称山药、怀山药等，是我国优质的药、菜、粮兼用作物，富含多种营养物质，如淀粉、多糖、尿囊素、胆碱、皂苷、矿物质等，其中，多糖被认为是其主要的活性物质，含量达到0.5％-10.0％(DW)。活性多糖大多具有较好的药理活性和独特的理化性质，如：已用于临床治疗肿瘤的人参多糖、用作免疫强化剂的冬虫夏草多糖、还有作为食品添加剂的果胶等，淮山多糖也已被证实具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、免疫调节等功能，在一定条件下还有较好的乳化、凝胶、增稠等特性，在保健食品、医药、化妆品等领域的应用前景十分广阔。
目前，常用于淮山多糖的提取方法包括热水浸提法、超声辅助提取、微波辅助提取和酶法辅助提取，不过这些提取工艺普遍存在两大问题：一是缺乏有效的去除淮山淀粉的措施。淮山中淀粉质量分数高达70％(DW)，其中支链淀粉是直链淀粉的2-3倍，由于多糖提取温度普遍较高，支链淀粉经熬煮易糊化，若不对淀粉进行处理，会造成所提取的淮山多糖含有淀粉；二是传统提取方法用时长，溶剂消耗大，多糖得率低，造成资源的极大浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种淮山多糖的提取方法，该提取方法能够有效去除淮山中所含有的淀粉，提高淮山多糖的提取效率，而且，该提取方法绿色高效，无污染。
为了实现上述目的，本发明提供一种淮山多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)将淮山和尿素-氯化胆碱低共熔溶剂混合，加热提取，冷却后分离出提取液；
(2)将步骤(1)所得提取液与酶混合进行酶解，将酶解产物进行固液分离，得到滤液；
(3)醇沉步骤(2)得到的滤液并洗涤，得到粗淮山多糖沉淀。
优选地，所述步骤(1)中，以1g淮山为基准，尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的用量为30-50mL。
优选地，所述尿素-氯化胆碱低共熔溶剂中尿素和氯化胆碱的摩尔比为4-6:1，所述尿素-氯化胆碱低共熔溶剂含水量为18-25质量％。
优选地，所述淮山为粉状，粒径为178-250微米。
优选地，所述混合过程采用超声混合，所述超声功率为100-200W，所述超声时间为20-40min。
优选地，所述加热提取采用水浴加热提取，所述水浴加热温度为80-100℃，时间为40-60min。
优选地，所述步骤(2)中，所述酶选自α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶中的一种或多种。
优选地，所述酶解过程包括：
S1向步骤(1)得到的提取液物中加入α-淀粉酶水溶液，酶解得到一级酶解液；
S2向一级酶解液中加入普鲁兰酶水溶液，酶解得到二级酶解液；
S3向二级酶解液中加入糖化酶水溶液，酶解得到三级酶解液；
其中，所述α-淀粉酶水溶液的浓度为120-150U/mL，以提取液的体积为基准，所述α-淀粉酶水溶液的添加量为2-2.5体积％；
所述普鲁兰酶水溶液的浓度为200-250U/mL，以提取液的体积为基准，所述普鲁兰酶水溶液的添加量为1.5-2体积％；
所述糖化酶水溶液的浓度为2500-3000U/mL，以提取液的体积为基准，所述糖化酶水溶液的添加量为1-1.5体积％。
优选地，所述步骤S1中，酶解温度为50-52℃，酶解时间为40-60min；所述步骤S2中，酶解温度为55-57℃，酶解时间为50-60min；所述步骤S3中，酶解温度为55-57℃，酶解时间为50-60min。
优选地，所述步骤(3)中，醇沉的方法包括：向滤液中加入乙醇，并在2-8℃条件下静置10-15h；所述洗涤过程中采用的洗涤液为乙醇和/或丙酮。
优选地，所述洗涤的方法为离心洗涤，离心速度为2800-3200r/min，离心时间为5-10min，洗涤次数为2-4次。
优选地，所述提取方法还包括纯化粗淮山多糖的步骤，所述步骤包括：加水溶解步骤(3)得到的粗淮山多糖沉淀并洗涤，收集上层清液，去蛋白质，干燥；
其中，所述洗涤的方法为离心洗涤，离心速度为2800-3200r/min，离心时间为5-10min，洗涤次数为2-4次；
去蛋白质的方法包括：浓缩上层清液，得到浓缩液Ⅰ，加入sevag试剂，震荡后分液，收集去蛋白的上层液，重复次数使得去蛋白的上层液中蛋白质的含量不高于1％。
进一步优选地，所述sevag试剂为氯仿和正丁醇的混合溶液；
所述氯仿和所述正丁醇的体积比为4-6:1；
所述浓缩液Ⅰ与sevag试剂的体积比为3-5:1；
所述震荡时间为30-40min。
进一步优选地，溶解过程中，水与粗淮山多糖沉淀的质量比为15-25:1；
所述干燥的方法为真空冷冻干燥。
优选地，在真空冷冻干燥前，还包括浓缩所述去蛋白质的上层液，使其为原体积的50％-75％。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：该方法采用尿素-氯化胆碱低共熔溶剂作为溶剂，既能够保证酶的高活性，又能够提高酶解效率；酶解效率得到提高后，能够减少淮山高温提取的时间，从而减少淀粉的糊化以及降低高温对淮山多糖活性的影响，能够提高淮山多糖的得率和纯度。而且，本发明采用尿素-氯化胆碱低共熔溶剂作为提取溶剂，绿色、高效，且不会造成环境污染。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种淮山多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)将淮山和尿素-氯化胆碱低共熔溶剂混合，加热提取，冷却后分离出提取液；
(2)将步骤(1)所得提取液与酶混合进行酶解，将酶解产物进行固液分离，得到滤液；
(3)醇沉步骤(2)得到的滤液并洗涤，得到粗淮山多糖沉淀。
具体地，淮山，又称山药、怀山药。所述淮山可以选用块状淮山、片状淮山和粉状淮山中的一种或多种，为了能提高提取效率，所述淮山优选为粉状淮山。所述粉状淮山可以采用任意方法制备出的粉状淮山，本发明的实施例中采用的是冷冻干燥法制备出来的淮山冻干粉。所述粉状淮山的粒径优选为178-250微米。
所述尿素-氯化胆碱低共熔溶剂中尿素和氯化胆碱可以是以任意比例混合，为了提高酶在尿素-氯化胆碱溶液中的活性，尿素和氯化胆碱的混合摩尔比优选为4-6:1，一般情况下，所述尿素-氯化胆碱低共熔溶剂中还含有水，该溶剂中的含水量为18-25重量％。
步骤(1)中的混合可以采用常规手段混合，如电磁搅拌、机械搅拌或者超声混合等，优选为超声混合，能够节省时间，而且可以使淮山和尿素-氯化胆碱溶液混合更为均匀。更优选地，所述超声混合的功率为100-200W，时间为20-40min。加热可以采用本领域常规的加热手段，优选为水浴加热，能够准确控制加热温度，且能保持整个反应体系内部受热均匀，提高提取效率。所述水浴加热的温度优选为80-100℃，时间优选为40-60min。
步骤(2)中酶解所用的酶可以是任意一种或多种能够使淀粉水解的酶。本发明的发明人发现，在采用步骤(1)的方法将淮山和尿素-氯化胆碱低共熔溶剂混合，加热提取得到提取液后再与酶混合酶解，α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶这三种酶均具有较高的酶解活性。因此，步骤(2)中酶解所用酶优选选自α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶中的一种或多种，更优选地，所述酶采用α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶的水溶液，以保证α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶在使用过程中的活性。
所述酶解过程可以一步完成，也可以分多步完成，优选地，所述酶解过程包括：
S1向步骤(1)得到的提取液中加入α-淀粉酶水溶液，酶解得到一级酶解液；
S2向一级酶解液中加入普鲁兰酶水溶液，酶解得到二级酶解液；
S3向二级酶解液中加入糖化酶水溶液，酶解得到三级酶解液。
其中，所述α-淀粉酶水溶液的浓度为120-150U/mL，可以为120U/mL、125U/mL、130U/mL、135U/mL、140U/mL、145U/mL、150U/mL以及这些点值中任意两个所构成的范围内的任意值，以提取液的体积为基准，所述α-淀粉酶水溶液的添加量为2-2.5体积％，可以为2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％以及这些点值中任意两个所构成的范围内的任意值；所述普鲁兰酶水溶液的浓度为200-250U/mL，可以是200U/mL、210U/mL、220U/mL、230U/mL、240U/mL、250U/mL以及这些点值中任意两个所构成的范围内的任意值，以提取液的体积为基准，所述普鲁兰酶水溶液的添加量为1.5-2体积％，可以为1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％以及这些点值中任意两个所构成的范围内的任意值；所述糖化酶水溶液的浓度为2500-3000U/mL可以是2500U/mL、2600U/mL、2700U/mL、2800U/mL、2900U/mL、3000U/mL以及这些点值中任意两个所构成的范围内的任意值，以提取液的体积为基准，所述糖化酶水溶液的添加量为1-1.5体积％，可以为1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％以及这些点值中任意两个所构成的范围内的任意值。
不同的酶种的最佳活性温度不同，为了能够保证酶具有较高的活性，从而提高其酶解效率，所述步骤S1中，酶解温度为50-52℃，酶解时间为40-60min；所述步骤S2中，酶解温度为55-57℃，酶解时间为50-60min；所述步骤S3中，酶解温度为55-57℃，酶解时间为50-60min。
在酶解完成后，还需要去除酶解液中的酶，本发明的实施例中采用加热酶解液的方法去除酶解液中的酶，然后再对酶解液进行固液分离，该固液分离可以采用现有技术中常用的固液分离手段，优选采用过滤的方法。
所述步骤(3)中，醇沉的方法包括：向滤液中加入乙醇，并在2-8℃条件下静置10-15h。所述洗涤过程中采用的洗涤液为乙醇和/或丙酮。
所述洗涤可以常规的洗涤方法，优选为离心洗涤，所述离心洗涤的离心速度为2800-3200r/min，离心时间为5-10min，洗涤次数为2-4次。
为了提高淮山多糖的纯度，所述提取方法还包括纯化粗淮山多糖的步骤，所述步骤包括：加水溶解步骤(3)得到的粗淮山多糖沉淀并洗涤，收集上层清液，去蛋白质，干燥。
其中，所述洗涤的方法为离心洗涤，离心速度为2800-3200r/min，离心时间为5-10min，洗涤次数为2-4次。
去蛋白质的方法包括：浓缩上层清液，得到浓缩液Ⅰ，加入sevag试剂，震荡后分液，收集去蛋白的上层液，重复次数使得去蛋白的上层液中蛋白质的含量不高于1％。为了进一步提高淮山多糖的纯度，优选地，重复次数使得去蛋白的上层液中蛋白质的含量不高于0.8％。
浓缩上层清液后，所述浓缩液Ⅰ为原上层清液体积的20％-25％，浓缩后需过滤掉浓缩液Ⅰ中的固体杂质。所述sevag试剂为氯仿和正丁醇的混合溶液；其中，所述氯仿和所述正丁醇的体积比为4-6:1；所述浓缩液Ⅰ与sevag试剂的体积比为3-5:1；所述震荡时间为30-40min。
所述溶解过程需要将淮山多糖在水中完全溶解，优选地，水与粗淮山多糖沉淀的质量比为15-25:1。
所述干燥的方法可以为常规干燥方法，优选为真空冷冻干燥。进一步优选地，在真空冷冻干燥前，还包括浓缩所述去蛋白质的上层液，得到浓缩液Ⅱ，使浓缩液Ⅱ为原上层液体积的50％-75％，以减少冷冻干燥时间，降低冷冻干燥成本。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，蛋白质含量通过考马斯亮蓝法测定，用无水乙醇与80％H2PO4配置0.1mg/mL的考马斯亮蓝溶液，取5.0mL考马斯亮蓝溶液与2.0mL多糖提取液混合，摇匀，室温反应30min，于595nm处测定其吸光值，根据牛血清白蛋白标准曲线计算多糖提取液中蛋白质含量；淮山多糖的纯度通过蒽酮-硫酸法测定，具体步骤参照GB 1886.174-2016。
淮山购于湖南娄底；氯化胆碱(CAS:67-48-1)、尿素(CAS:57-13-6)、1,4-丁二醇(CAS:110-63-4)、甘油(CAS:56-81-5)、柠檬酸(CAS:5949-29-1)、乳酸(CAS:50-21-5)、氯仿(CAS:67-66-3)、正丁醇(CAS:71-36-3)、乙醇(CAS:64-17-5)和丙酮(CAS:67-64-1)均购于国药集团；α-淀粉酶(CAS:9000-90-2,Cat#G8290)、普鲁兰酶(CAS:9075-68-7,Cat#P9841)和糖化酶(CAS:9032-08-0,Cat#T8500)均购于上海索莱宝生物科技有限公司。
实施例1
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为30：14：11混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过80目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比5:1混合，得到sevag试剂；
(1)将400mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，100W条件下超声辅助提取30min，于100℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入9.2mL的α-淀粉酶水溶液(140U/mL)，50℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入7.2mL的普鲁兰酶水溶液(230U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入4.8mL的糖化酶水溶液(2800U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇和丙酮分别洗涤2次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于20倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3000r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以4:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡30min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.51％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例2
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为30:14:11混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过60目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比4:1混合，得到sevag试剂；
(1)将500mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，200W条件下超声辅助提取20min，于80℃水浴中提取60min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入10mL的α-淀粉酶水溶液(150U/mL)，51℃的条件下水解60min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入7.5mL的普鲁兰酶水溶液(250U/mL)，56℃的条件下水解60min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入5mL的糖化酶水溶液(3000U/mL)，56℃的条件下水解60min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入5倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3200r/min离心5min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤3次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于15倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，2800r/min离心10min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤4次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/4，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以3:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡40min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.57％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例3
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为30:14:11混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过80目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比6:1混合，得到sevag试剂；
(1)将300mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，150W条件下超声辅助提取30min，于90℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入7.5mL的α-淀粉酶水溶液(120U/mL)，52℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入6mL的普鲁兰酶水溶液(200U/mL)，57℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入4.5mL的糖化酶水溶液(2500U/mL)，57℃的条件下水解50min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3200r/min离心8min，收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于25倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3200r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以6:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡40min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.66％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例4
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为12:7:4混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过50目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比5:1混合，得到sevag试剂；
(1)将400mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，150W条件下超声辅助提取30min，于100℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入9.2mL的α-淀粉酶水溶液(140U/mL)，50℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入7.2mL的普鲁兰酶水溶液(230U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入4.8mL的糖化酶水溶液(2800U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇和丙酮分别洗涤2次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于20倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3000r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以4:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡30min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.59％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例5
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为30：14：11混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比5:1混合，得到sevag试剂；
(1)将200mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山切片混合，150W条件下超声辅助提取30min，于100℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入4.6mL的α-淀粉酶水溶液(140U/mL)，50℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入3.6mL的普鲁兰酶水溶液(230U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入2.4mL的糖化酶水溶液(2800U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇和丙酮分别洗涤2次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于20倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3000r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以4:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡30min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.60％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例6
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为36:14:5混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过80目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比5:1混合，得到sevag试剂；
(1)将400mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，150W条件下超声辅助提取30min，于100℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入9.2mL的α-淀粉酶水溶液(140U/mL)，50℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入7.2mL的普鲁兰酶水溶液(230U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入4.8mL的糖化酶水溶液(2800U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇和丙酮分别洗涤2次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于20倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3000r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以4:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡30min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.64％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例7
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为30:14:19混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过80目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比5:1混合，得到sevag试剂；
(1)将400mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，150W条件下超声辅助提取30min，于100℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入9.2mL的α-淀粉酶水溶液(140U/mL)，50℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入7.2mL的普鲁兰酶水溶液(230U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；向二级酶解液中加入4.8mL的糖化酶水溶液(2800U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到三级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇和丙酮分别洗涤2次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于20倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3000r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以4:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡30min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.62％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
实施例8
尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的配置：将尿素、氯化胆碱和水以质量比为36:14:16.7混合，得到尿素-氯化胆碱低共熔溶剂；
淮山冻干粉的制备：选择真空冷冻干燥的淮山，粉碎后过80目筛，得淮山冻干粉；
sevag试剂的配置：将氯仿和正丁醇按体积比5:1混合，得到sevag试剂；
(1)将400mL尿素-氯化胆碱低共熔溶剂与10g淮山冻干粉混合，150W条件下超声辅助提取30min，于100℃水浴中提取40min，提取完成后，冷却至室温，收集提取液备用；
(2)向上述提取液中加入9.2mL的α-淀粉酶水溶液(140U/mL)，50℃的条件下水解50min，得到一级酶解液；向一级酶解液中加入4.8mL的糖化酶水溶液(2500U/mL)，55℃的条件下水解50min，得到二级酶解液；然后沸水水浴灭酶6min后，过滤，收集滤液；
(3)向滤液中加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，3000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用无水乙醇和丙酮分别洗涤2次，即得粗多糖沉淀。
(4)将粗多糖沉淀溶于20倍淮山冻干粉重量的蒸馏水，充分溶解，3000r/min离心5min，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2次，合并上清液，加热减压浓缩至原体积的1/5，过滤掉固体杂质；将浓缩液与sevag试剂以4:1的比例混合，漩涡震荡仪振荡30min后，倒入分液漏斗，静置，待溶液分层后，收集上层，重复操作上述步骤3次，测得其蛋白质含量为0.70％，加热减压浓缩上层溶液至原浓缩液体积的2/3，将浓缩液置于-50℃冰箱冷冻，待冻实后，真空冷冻干燥即得淮山多糖。
测量计算淮山多糖的得率和纯度。
对比例1
按照实施例1的方法提取淮山多糖，不同的是，步骤(1)中，用水代替尿素-氯化胆碱低共熔溶剂提取淮山冻干粉中的淮山多糖。
对比例2
按照实施例1的方法提取淮山多糖，不同的是，步骤(1)中，采用柠檬酸-氯化胆碱低共熔溶剂代替尿素-氯化胆碱低共熔溶剂提取淮山冻干粉中的淮山多糖。
上述测量结果如表1所示：
淮山多糖得率％ 淮山多糖纯度％
实施例1 10.22 78.51
实施例2 9.91 77.28
实施例3 9.37 77.10
实施例4 8.84 76.32
实施例5 8.56 76.86
实施例6 8.17 76.03
实施例7 8.43 76.34
实施例8 7.05 67.57
对比例1 1.89 33.2
对比例2 4.11 72.19
通过对比表1中实施例和对比例1的数据可知，采用低共熔溶剂作为淮山多糖的萃取溶剂，能够有效提高淮山多糖的萃取率，从而有效提高淮山多糖的得率和纯度。
此外，通过对比表1中实施例1-7和实施例8的数据可知，与α-淀粉酶和糖化酶两种复合酶酶解效果相比，采用α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶三种酶复合酶水解提取液，可更有效地去除淮山淀粉，提高淮山多糖的得率和纯度。
此外，通过对比表1中实施例和对比例2的数据可知，酶在尿素-氯化胆碱低共熔溶剂中的活力与在柠檬酸-氯化胆碱低共熔溶剂中相比，在尿素-氯化胆碱低共熔溶剂中的活力更高，能够有效提高淮山提取液中的淀粉的酶解效率，从而有效提高淮山多糖的得率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种淮山多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将淮山和尿素-氯化胆碱低共熔溶剂混合，加热提取，冷却后分离出提取液；
(2)将步骤(1)所得提取液与酶混合进行酶解，将酶解产物进行固液分离，得到滤液；
(3)醇沉步骤(2)得到的滤液并洗涤，得到粗淮山多糖沉淀。
2.根据权利要求1所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，以1g淮山为基准，尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的用量为30-50mL；
优选地，所述尿素-氯化胆碱低共熔溶剂中尿素和氯化胆碱的摩尔比为4-6:1，所述尿素-氯化胆碱低共熔溶剂的含水量为18-25质量％；
优选地，所述淮山为粉状，粒径为178-250微米。
3.根据权利要求2所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述混合过程采用超声混合，所述超声功率为100-200W，所述超声时间为20-40min；
优选地，所述加热提取采用水浴加热提取，所述水浴加热温度为80-100℃，时间为40-60min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述酶选自α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶中的一种或多种；
优选地，所述酶解过程包括：
S1向步骤(1)得到的提取液中加入α-淀粉酶水溶液，酶解得到一级酶解液；
S2向一级酶解液中加入普鲁兰酶水溶液，酶解得到二级酶解液；
S3向二级酶解液中加入糖化酶水溶液，酶解得到三级酶解液；
其中，所述α-淀粉酶水溶液的浓度为120-150U/mL，以提取液的体积为基准，所述α-淀粉酶水溶液的添加量为2-2.5体积％；
所述普鲁兰酶水溶液的浓度为200-250U/mL，以提取液的体积为基准，所述普鲁兰酶水溶液的添加量为1.5-2体积％；
所述糖化酶水溶液的浓度为2500-3000U/mL，以提取液的体积为基准，所述糖化酶水溶液的添加量为1-1.5体积％。
5.根据权利要求4所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，酶解温度为50-52℃，酶解时间为40-60min；
所述步骤S2中，酶解温度为55-57℃，酶解时间为50-60min；
所述步骤S3中，酶解温度为55-57℃，酶解时间为50-60min。
6.根据权利要求4所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，醇沉的方法包括：向滤液中加入乙醇，并在2-8℃条件下静置10-15h；所述洗涤过程中采用的洗涤液为乙醇和/或丙酮。
7.根据权利要求4或6所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述洗涤的方法为离心洗涤，离心速度为2800-3200r/min，离心时间为5-10min，洗涤次数为2-4次。
8.根据权利要求4所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括纯化粗淮山多糖的步骤，所述步骤包括：加水溶解步骤(3)得到的粗淮山多糖沉淀并洗涤，收集上层清液，去蛋白质，干燥；
其中，所述洗涤的方法为离心洗涤，离心速度为2800-3200r/min，离心时间为5-10min，洗涤次数为2-4次；
去蛋白质的方法包括：浓缩上层清液，得到浓缩液Ⅰ，加入sevag试剂，震荡后分液，收集去蛋白的上层液，重复次数使得去蛋白的上层液中蛋白质的含量不高于1％。
9.根据权利要求8所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，所述sevag试剂为氯仿和正丁醇的混合溶液；
所述氯仿和所述正丁醇的体积比为4-6:1；
所述浓缩液Ⅰ与sevag试剂的体积比为3-5:1；
所述震荡时间为30-40min。
10.根据权利要求8或9所述的淮山多糖的提取方法，其特征在于，溶解过程中，水与粗淮山多糖沉淀的质量比为15-25:1；
所述干燥的方法为真空冷冻干燥，优选地，在真空冷冻干燥前，还包括浓缩所述去蛋白质的上层液，使其为原体积的50％-75％。
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