CN110407950A

CN110407950A - 一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法

Info

Publication number: CN110407950A
Application number: CN201910803274.7A
Authority: CN
Inventors: 冯国坚; 侯雪丹; 林凯鹏; 张永昊; 蓝兹聪
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110407950B

Abstract

本发明属于活性物质提取的技术领域，尤其涉及一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法。本发明公开的利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法，绿色溶剂包括氢键受体和氢键供体，氢键受体选择甜菜碱或氯化胆碱，包括以下步骤：步骤1、将组合物的水溶液与霉菌混合，得到混合物，组合物包括氢键受体和氢键供体，氢键受体选择甜菜碱或氯化胆碱；步骤2、将混合物离心分离，取上清液；步骤3、用乙醇与上清液混合以析出多糖。本发明公开组合物在工业废弃生物资源回收方面的应用，用于解决现有技术霉菌提取多糖方法中存在的提取效率低，提取多糖纯度低，纯化成本高以及污染环境的技术缺陷，同时提高生物废弃资源的利用价值。

Description

一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法

技术领域

本发明属于活性物质提取的技术领域，尤其涉及一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法。

背景技术

我国发酵工业每年生产大量发酵菌丝体，目前，大量的废弃霉菌菌丝体多采用常规方法进行提取，例如超声波浸提法或热水浸提法，但是现有技术霉菌提取多糖方法中存在的提取效率低，提取多糖纯度低、纯化成本高以及污染环境的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法，有效解决现有技术霉菌提取多糖方法中存在的提取效率低，提取多糖纯度低，纯化成本高以及污染环境的技术缺陷。

本发明公开了一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法，包括以下步骤：

步骤1、将绿色溶剂与霉菌混合，得到混合物，其中，所述绿色溶剂包括氢键供体和氢键受体，所述氢键受体包括甜菜碱或氯化胆碱，所述氢键供体选自丙三醇、1，2-丙二醇、1，3丙二醇、乙二醇、山梨醇、尿素、氨基酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、乙酸和草酸中的一种或多种；

步骤2、将所述混合物离心分离，取上清液；

步骤3、将乙醇与所述上清液混合以析出多糖。

其中，本申请公开的绿色溶剂包括氢键受体和氢键供体，本申请提供的氢键供体为天然、可再生的原料，对环境友好，且成本低，还能重复利用，因此称之为绿色溶剂。

作为优选，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为(1～3)：(1～9)。

更为优选，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为(1～3)：(1～4)。

更为优选，所述氢键供体选自1，2-丙二醇、乳酸或苹果酸。

作为优选，所述霉菌选自黑曲霉菌、红曲霉、华根霉、米根霉等中的一种或多种。

更为优选，所述黑曲霉菌可以为正常发酵后的黑曲霉，也可以为经过酶提取的废弃工业黑曲霉菌。其中，废弃工业黑曲霉菌是经过72-96h发酵后的并经过酶提取的黑曲霉菌，废弃工业黑曲霉具有更丰富的多糖。

作为优选，所述绿色溶剂的制备方法为将所述氢键供体和所述氢键受体在60℃～120℃条件下混合1～4h获得。

更为优选，所述绿色溶剂的制备方法为将所述氢键受体与所述氢键供体在80℃下混合2h制得。

作为优选，步骤1中，将所述绿色溶剂与所述霉菌在30-60℃条件下混合0.5-3h，得到混合物。

作为优选，所述霉菌为预先破壁和除去蛋白的霉菌。

其中，预先破壁的霉菌使得所述绿色溶剂能充分与霉菌胞内多糖接触从而提取多糖，且，除去蛋白杂质，能提高提取多糖的纯度。

作为优选，所述霉菌占所述混合物的质量分数为0.5％-5％。

作为优选，所述绿色溶剂还包括水，所述绿色溶剂中水的质量分数为10％-50％。

更为优选，废弃工业黑曲霉菌为发酵72-96h后，经过机械破壁、化学破壁或酶破壁后，再用Sevag试剂除去蛋白，本申请还可使用其他方法或试剂除去蛋白，本申请不作具体赘述。

作为优选，步骤1中，将所述绿色溶剂与所述霉菌在30-60℃混合0.5-3h，得到混合物。

更为优选，步骤1中，将所述绿色溶剂与所述霉菌在35-50℃混合1-2h，得到混合物。

作为优选，所述提取方法，还包括多糖的纯化，步骤4包括除去所述多糖中的蛋白。

其中，步骤4可以为采用现有常规的Sevag试剂除去多糖中的蛋白，然后采用乙醇析出沉淀，将沉淀洗涤后冷冻干燥得到高纯度的多糖，步骤4也可以作为一种除去其他多糖中蛋白的方法。

具体的，将粗多糖溶于水中形成多糖水溶液，加入Sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(v/v)]，按Sevag试剂：多糖水溶液＝1：4的体积比例混合剧烈震荡，离心后，弃去中间蛋白层和下层有机溶剂，得上清液与其1/4倍的Sevag试剂继续混合，分别按上述步骤重复两次，得到提取液。

作为优选，步骤4中，所述乙醇析出沉淀为采用95％乙醇，所述洗涤具体包括采用95％乙醇洗涤3次。

本发明的目的针对现有技术中霉菌胞内多糖的提取方法存在的效率低、纯度低、纯化成本高和污染环境的技术问题。因此，本发明公开的绿色溶剂成分简单，绿色溶剂包括氢键受体和氢键供体，本申请发现由氢键受体和氢键供体组成的绿色溶剂可以高选择性地溶解和萃取霉菌的胞内多糖，得到的多糖不仅效率高，纯度也相当高，本申请发现，醇类化合物和酸类化合物作为氢键供体具有高效、高选择性提取霉菌胞内多糖的特性。同时，本申请提供的氢键供体为天然、可再生的原料，对环境友好，且成本低，本申请的所采用的绿色溶剂还能重复利用。综上所述，本申请提供一种绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法，且本申请公开的提取方法条件温和、操作简便、提取效率高(约130-250mg多糖/g霉菌菌丝体)、多糖纯度高(纯度>78％)、杂蛋白少、原料廉价易降解，是一种实验室分析以及工业生产中高效地、高选择性地提取霉菌菌丝体尤其是废弃霉菌菌丝体中多糖的方法。

具体实施方式

本发明提供了一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法，用于解决现有技术霉菌提取多糖方法中存在的提取效率低，提取多糖纯度低，纯化成本高以及污染环境的技术缺陷。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，以下实施例所用原料均为市售或自制，废弃工业黑曲霉菌丝体为发酵72h后经机械破壁并进行提取发酵产品后的废弃菌丝体，以下实施例所用的废弃工业黑曲霉菌丝体为购买所得。

实施例1

本申请实施例提供第一种绿色溶剂提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、制备绿色溶剂：将甜菜碱和1，2-丙二醇以1:4的摩尔比例混合，于80℃，150rpm搅拌混合2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温制得。

2、提取多糖：精确称量5g步骤1的绿色溶剂的水溶液(50％w/w)于烧瓶中。加入200mg废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁并进行提取发酵产品后的废弃菌丝体)，加入搅拌子并置于磁力搅拌器上。在温度50℃，150rpm条件下，提取2小时。随后冷却至室温，将混合液离心分离，取上清液；将上清液加入乙醇纯析，通过醇析沉淀出粗多糖。

3、多糖的纯化：将粗多糖溶于20ml水中形成多糖水溶液，加入Sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(v/v)]，按Sevag试剂：多糖水溶液＝1：4的体积比例混合剧烈震荡20min后，3000r/min离心15min，弃去中间蛋白层和下层有机溶剂，得上清液与其1/4倍的Sevag试剂继续混合，分别按上述步骤重复两次，得到提取液。

4、将提取液用95％乙醇沉淀，并用95％乙醇洗涤3次。最后经冷冻干燥，获得高纯度的多糖。

5、多糖含量及其纯度的测定：对原料、步骤2(纯化前)以及步骤4(纯化后)中的多糖样品采用苯酚-硫酸法进行测定，结果如表1所示。

实施例2

本申请实施例提供第二种绿色溶剂提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、制备绿色溶剂：将甜菜碱与乳酸以1:2的摩尔比例混合，于80℃，150rpm搅拌混合2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温制得。

2、提取多糖：精确称量5g步骤1的绿色溶剂的水溶液(20％w/w)，加入烧瓶中。加入200mg废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁并进行发酵产品提取后的菌丝体)，加入搅拌子并置于磁力搅拌器上。在温度35℃，150rpm条件下，提取3小时。随后冷却至室温，将混合液离心分离，取上清液，将上清液加入乙醇纯析，通过醇析沉淀出粗多糖。

实施例3

本申请实施例提供第三种绿色溶剂提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、制备绿色溶剂：将氯化胆碱：乳酸以1:1的摩尔比例混合，于80℃，150rpm搅拌混合2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温制得。

2、提取多糖：精确称量5g步骤1的绿色溶剂的水溶液(10％w/w)，加入烧瓶中。加入200mg废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁并进行发酵产品提取后的菌丝体)，加入搅拌子并置于磁力搅拌器上。在温度40℃，150rpm条件下，提取1.5小时。随后冷却至室温，将混合液离心分离，取上清液，将上清液加入乙醇纯析，通过醇析沉淀析出粗多糖。

实施例4

本申请实施例提供第四种绿色溶剂提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、制备绿色溶剂：将氯化胆碱：苹果酸以3:1的摩尔比例混合，于80℃，150rpm搅拌混合2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温制得。

2、提取多糖：精确称量5g步骤1的绿色溶剂的水溶液(30％w/w)，加入烧瓶中。加入200mg废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁并进行发酵产品提取后的菌丝体)，加入搅拌子并置于磁力搅拌器上。在温度50℃，150rpm条件下，提取1小时。随后冷却至室温，将混合液离心分离，取上清液，将上清液加入乙醇纯析，通过醇析沉淀出粗多糖。

实施例5

本申请实施例提供第五种绿色溶剂提取黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

本实施例与实施例3基本相同，不同之处在于，所用提取对象为仅进行发酵72h的黑曲霉菌丝体，该黑曲霉菌丝体未经机械破壁以及发酵产品提取处理，结果如表1所示。

实施例6

本申请实施例提供第六种绿色溶剂提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，绿色溶剂的原料种类和配比不相同，甜菜碱和1，2-丙二醇的终摩尔比为1：9，结果如表1所示。

对比例1

本申请对比例提供对比产品1提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、将氯化胆碱：葡萄糖以3:1的摩尔比例混合，于80℃，150rpm搅拌混合2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温制得产品1。

2、提取多糖：精确称量5g产品1的水溶液(50％w/w)，加入烧瓶中。加入200mg废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁并进行发酵产品提取后的菌丝体)，加入搅拌子并置于磁力搅拌器上。在温度60℃，150rpm条件下，提取3小时。随后冷却至室温，将混合液离心分离，取上清液，将上清液加入乙醇纯析，通过醇析沉淀析出粗多糖。

对比例2

本申请对比例提供对比产品2提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、将甜菜碱：葡萄糖以1:1的摩尔比例混合，于80℃，150rpm搅拌混合2h，待混合物变澄清停止加热，冷却至室温制得产品2。

2、提取多糖：精确称量5g产品2的水溶液(50％w/w)，加入烧瓶中。加入200mg废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁并进行发酵产品提取后的菌丝体)，加入搅拌子并置于磁力搅拌器上。在温度50℃，150rpm条件下，提取2小时。随后冷却至室温，将混合液离心分离，取上清液，将上清液加入乙醇纯析，通过醇析沉淀析出粗多糖。

对比例3

本申请对比例提供超声波浸提法提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、多糖提取：将250mL蒸馏水加入烧瓶中，加入10g废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁和发酵产物提取后的菌丝体)，然后，以超声波破碎，功率400W超声浸提30min，将超声破碎仪探头置于液面下约1cm处，超声过程在75℃恒温水浴中进行。

2、乙醇沉淀：随后在4000r/min转速下离心15min提取混合物，收集提取液，上清液减压蒸发浓缩至原体积的1/4至1/5，加入4倍无水乙醇，使乙醇浓度为80％，4℃醇析24h，4000r/min离心15min，去上清。沉淀物依次用无水乙醇和乙醚各洗3次，4000r/min离心5min，去上清液，沉淀物80℃下干燥至恒重，得到粗多糖。于干燥容器中保存以待进一步纯化。

3、多糖纯化：将30mg多糖加入蒸馏水中溶解并定容到100ml形成多糖水溶液，加入Sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(v/v)]，按Sevag试剂：多糖水溶液＝1：4的比例混合剧烈震荡20min后，3000r/min离心15min，弃去中间蛋白层和下层有机溶剂，得上清液与其1/4倍的Sevag试剂继续混合，分别按上述步骤重复两次，到提取液。

5、多糖含量及其纯度的测定：对原料、步骤2(纯化前)以及步骤4(纯化后)中的多糖样品采用苯酚-硫酸法进行测定。

对比例4

本申请对比例提供热水浸提法提取废弃工业黑曲霉菌丝体多糖的实验，具体步骤如下：

1、多糖提取：将250mL蒸馏水加入烧瓶中，加入10g废弃工业黑曲霉菌丝体(发酵72h后经机械破壁和产物提取后的菌丝体)，在90℃恒温水浴中进行提取，浸提120min后冷却至室温。

2、乙醇沉淀：随后在4000r/min转速下离心15min提取混合物，收集提取液，上清液减压蒸发浓缩至原体积的1/4至1/5，加入4倍无水乙醇，使乙醇浓度为80％，4℃冰箱醇析24h，4000r/min离心15min，去上清。沉淀物依次用无水乙醇和乙醚各洗3次，4000r/min离心5min，去上清液，沉淀物80℃下干燥至恒重，得到粗多糖。于干燥容器中保存以待进一步纯化。

3、多糖纯化：将30mg多糖加入蒸馏水中溶解并定容到100ml形成多糖水溶液，加入Sevag试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(v/v)]，按Sevag试剂：多糖水溶液＝1：4的体积比例混合剧烈震荡20min后，3000r/min离心15min，弃去中间蛋白层和下层有机溶剂，得上清液与其1/4倍的Sevag试剂继续混合，分别按上述步骤重复两次，得到提取液。

表1实施例1-6、对比例1-4所得对废弃工业黑曲霉菌丝体所提取的多糖质量

从表1可知，当氢键供体选自1，2-丙二醇、乳酸或苹果酸，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为(1～3)：(1～4)，绿色溶剂的溶质的质量分数为10％-50％，将绿色溶剂与霉菌在35-50℃混合1-2h时，从霉菌中提取胞内多糖的提取率远高于现有技术(超声波浸提法和热水浸提法)的提取率，所得多糖纯度也远高于现有技术(超声波浸提法和热水浸提法)所得多糖的纯度。

表1还可知，实施例5选择的霉菌未经过破壁的处理，使得实施例5得到的多糖含量较低，多糖纯度也较低；从对比例1和2可知，当氢键供体选自葡萄糖时，发现葡萄糖作为氢键供体时，所得溶剂提取霉菌胞内多糖的效率很低。，多糖提取率远低于本申请提取方法所得的提取率，且所提取的多糖纯度也低于本申请的提取方法所得的纯度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用绿色溶剂提取霉菌胞内多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2、将所述混合物离心分离，取上清液；

步骤3、将乙醇与所述上清液混合以析出多糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氢键受体与氢键供体的摩尔比为(1～3)：(1～9)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述霉菌选自黑曲霉菌、红曲霉、华根霉和米根霉中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述霉菌选自黑曲霉菌选自废弃工业黑曲霉。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绿色溶剂的制备方法为将所述氢键供体和所述氢键受体在60℃～120℃条件下混合1～4h获得。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，将所述绿色溶剂与所述霉菌在30-60℃条件下混合0.5-3h，得到混合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述霉菌为依次预先破壁和除去蛋白的霉菌。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述霉菌占所述混合物的质量分数为0.5％-5％。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绿色溶剂还包括水，所述绿色溶剂中水的质量分数为10％-50％。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，还包括步骤4，步骤4包括除去所述多糖中的蛋白。