CN113336867A - 一种黑木耳多糖及其全破壁提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑木耳多糖及其全破壁提取方法和在制备抗应激药物中的应用，采用绿色化学协同微波处理，操作简便易行，时间短，能耗低，破壁效率高，多糖得率高达80％以上，且DPPH、ABTS自由基清除能力等抗氧化活性高；无异味、感官性状好，无需脱色等后处理。绿色化学协同微波加维生素C破壁的处理方式可使黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力(ABTS+清除率、DPPH自由基清除率)、秀丽隐杆线虫的运动能力与抗热应激能力显著提高。

Description

一种黑木耳多糖及其全破壁提取方法和应用
(一)技术领域
本发明涉及一种黑木耳多糖，及其全破壁提取方法和应用。
(二)背景技术
黑木耳Auricularia auricula(L.exHook.)Underwood，属于担子菌纲，木耳目、木耳科、木耳属，是世界上人工栽培的第一个菌菇品种。我国是黑木耳生产大国，产区广袤，品种多样，在黑龙江、陕西、安徽、浙江等地均有不同品种的黑木耳种植。从2006年至2015年，十年间我国黑木耳的产量由107.67万吨上升到了613.19万吨，产量增长了近6倍。2015年全国黑木耳总产量613.19万吨，其中黑龙江省达到303.28万吨，占全国总产量的49.5％，位居全国首位；河南、吉林两省产量均超过80万吨，浙江、湖北、山东等产区2015年产量都达到了20万吨以上，其中我省的龙泉市就拥有较大的黑木耳生产基地。我国黑木耳年产量可达世界总产量的95％以上，黑木耳产业具有极大的发展潜力。
多糖是黑木耳中重要的营养物质，占子实体干重的65％以上，在改善氧化应激、抗糖尿病等方面发挥重要功能。但黑木耳细胞壁内多糖的产量、分子结构和生物活性强烈依赖于所采用的破碎预处理方式，且破壁过程可能会引起多糖结构的不可逆变化，使多糖的化学组成、分子量、糖苷键类型与构象、生物活性等发生显著变化。因而，有效的破壁方式是获得高产量与高活性黑木耳多糖的关键步骤。
黑木耳作为担子纲真菌，其细胞壁结构不同于植物细胞壁，其壁层厚且质地异常坚韧(见图1)，其破碎难度远大于植物，适用于植物细胞壁的破碎方法对于真菌细胞壁往往效果不佳。
图1的结构图中，真菌细胞壁由内部区域的疏水坚硬层与水化流动层组成，其中疏水坚硬层由几丁质与β-1→3-葡聚糖组成，水化流动层由β-1→3-葡聚糖、β-1→4-葡聚糖与β-1→6-葡聚糖组成；外部区域高度流动的外壳层主要由β-1→3-葡聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖与蛋白质组成。
针对真菌细胞壁结构的复杂性与坚韧性，采用的破壁手段通常有机械法、物理法、化学法、生物酶法破壁等。机械法破壁手段有超声辅助、高压匀质、微波辅助、高速珠磨、蒸汽破法等，它们的共性是通过外界力量如声波、压力、电磁波、速度等进行有效破壁。不同的机械手段各有优势与不足，但大多具有对设备要求高、能耗大、破壁不充分、局部高温等缺点。物理法破碎手段有温差法、压力差法等，前者(如反复冻融)简单易行、较为常用，但需足够大(通常大于80℃)温差，仅适于实验室操作。生物酶法是利用不同种类酶的破壁位点差异，攻击真菌细胞壁的壁层，同时缓冲液渗透压的变化使细胞膜破裂，释放出胞内质。由于真菌细胞壁结构复杂，单一生物酶很难有效破壁。化学法是借助洗涤剂、渗透剂或者有机溶剂，使细胞破碎或细胞壁变脆弱，包括酸热或碱法破壁、酸碱结合破壁、化学试剂(如酒精、二甲基亚砜、甲醇等)破壁。其操作便利，对设备要求不高，但易引入杂质且存在安全性及环境污染等问题。
化学法除了上述常用试剂，近年来过氧化氢与天然深共晶溶剂作为绿色溶剂逐渐受到关注。过氧化氢是一种清洁绿色高效的氧化剂与典型的环保剂，其价格低廉、无污染、对设备要求低且能源消耗少；其易分解成水与氧气，在整个单元操作过程中不会留下任何残留物。在最新版“食品安全国家标准食品添加剂使用标准”(GB2760-2014)中，增加其作为加工助剂使用于食品工业中。深共晶溶剂(Deep eutectic solvent，DES)被称为天然深共熔溶剂(NADES)，由Abbott等人在2003年首次提出。作为新型的绿色溶剂，DES具有蒸汽压低、毒性小、电化学稳定和可生物降解等独特的理化性质。DES由氢键受体(通常为氯化胆碱)和氢键供体(通常为基于天然植物的有机离子，例如氨基酸，有机酸，糖等)组成。由于DES和离子液体(IL)具有相似的性质，因此DES可以作为IL的替代品。前人学者发现，DES不仅能够通过氢键相互连接，而且还能够提供或接受外部电子或质子形成氢键。在这种情况下，它们可以溶解各种各样的物质，包括盐、蛋白质、药物、氨基酸、表面活性剂等。
目前DES已用于提取，分离或纯化某些特定的生物聚合物，例如角叉菜胶。过氧化氢在木质素脱除、膳食纤维改性、天然大分子多糖降解等方面的研究不断受到关注。但有关DES与过氧化氢用于真菌细胞壁破壁预处理方面的研究还鲜有报道。
黑木耳是一种比较独特的食药用菌，其多糖具有极高的药用价值。本发明针对黑木耳极其坚韧与多层次的细胞壁结构特征，即具有复杂的空间网络结构，细胞壁层厚且异常坚韧，很难被常规的物理或化学条件破坏等，以多糖得率为响应值，辅以BBD的设计方法优化提取条件，以获得高得率、强生物活性(增加秀丽隐杆线虫的运动能力以及抗热应激能力)的黑木耳多糖，可实现黑木耳加工的新利用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种黑木耳多糖及其全破壁提取方法与应用，以黑木耳为原料，以过氧化氢水溶液及水化DES为提取剂，辅助微波处理，利用全破壁提取黑木耳多糖，获得高得率、强生物活性(增加秀丽隐杆线虫的运动能力以及抗热应激能力)的黑木耳多糖。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种黑木耳多糖，所述黑木耳多糖按如下全破壁方法制备：(1)黑木耳粉加入去离子水a溶胀，得到预处理后的黑木耳浆；将处理后的黑木耳浆中加入去离子水b和质量浓度30％的双氧水(即过氧化氢水溶液)，混匀，调pH至7.0，在500-800W(优选700W)条件下微波辅助提取100-300s(优选210-270s，更优选210s)，获得提取液a；(2)向提取液a中加入维生素C，水化DES，再在500-800W(优选700W)条件下微波辅助提取100-300s(优选150-210s，更优选150s)，获得提取液b；所述水化DES是指去离子水与深共晶溶剂(DES)的混合液；所述深共晶溶剂为氢键供体与氯化胆碱以物质的量之比0.1-5:1混合后，在80℃加热110min制成，所述深共晶溶剂的氢键供体包括甘醇、尿素或三乙二醇；(3)将提取液b离心，取沉淀用体积浓度95％乙醇水溶液溶解，静置，离心，取沉淀用去离子水溶解，采用sevag法脱蛋白，浓缩，干燥，获得黑木耳多糖。所述去离子水a和去离子水b均为去离子水，字母本身没有含义；所述提取液a和提取液b均为提取液，字母本身没有含义。
进一步，步骤(1)中去离子水a与去离子水b和双氧水总体积为提取剂，提取剂体积用量以黑木耳粉质量计为60-80mL/g，其中去离子a与去离子水b体积比为0.6-1：1，去离子a与双氧水体积比为9.375-18.75：1。步骤(1)双氧水在提取剂中的加入终浓度为0.4％-1.6％，优选1.0％。
进一步，步骤(1)中微波辅助提取条件为：700W提取210s。
进一步，步骤(1)黑木耳粉过150～200目筛，加入去离子水a，25℃溶胀10-14h，得到预处理后的黑木耳浆。
进一步，步骤(2)中所述水化DES中去离子水体积浓度为20-80％，优选80％；所述深共晶溶剂为三乙二醇与氯化胆碱以物质的量之比2:1混合制成。
进一步，步骤(2)中维生素C与步骤(1)中双氧水质量比为1:1-3；所述水化DES体积用量以步骤(1)中黑木耳粉质量计为40-60mL/g，优选54mL/g。
进一步，步骤(2)中微波辅助提取条件为：700W提取150s。
进一步，步骤(3)按如下步骤进行：提取液b在8000rpm条件下离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.4-0.7倍(优选0.6倍)，冷却至4℃后，获得浓缩液；加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于浓缩液体积0.4-0.9倍(优选0.9倍)去离子水后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入去离子水体积0.1-0.4倍(优选0.3倍)Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至去离子水体积的25-35％，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量6％以下，获得黑木耳多糖。
本发明还提供一种所述黑木耳多糖在制备抗应激药物中的应用，所述抗应激药物为增强运动能力的药物。应激是机体受外界和内在环境中存在的生物、物理和化学等因子过度刺激后，随即产生的一系列非特异性全身适应性反应；抗应激指防治动物的应激行为，抗应激药物是指具有缓解、防治由应激源引起的应激综合症的药物。
与现有方法相比，本发明的有益效果主要体现在：
1.采用绿色化学协同微波处理，操作简便易行，时间短，能耗低，破壁效率高，多糖得率高达80％以上，且DPPH、ABTS自由基清除能力等抗氧化活性高；
2.针对担子菌纲黑木耳胶质菌细胞壁的壁层厚且呈多层网状，质地坚韧的结构特点，细胞壁内所含有的多糖类物质很难透过细胞壁，常规提取方法多糖得率低、粘度高不利于实际应用等问题，利用绿色化学协同微波处理可达到全破壁效果并独具脱色与降低多糖粘度的优势，结合BBD的设计方法，充分保证细胞壁的全破碎效果，不仅有利于壁内多糖的充分溶出，还有利于制备粘度低，破壁过程不破坏多糖“活性片段”的完整性、产量高的活性多糖，同时具有整个操作过程不引入杂质、无污染、对设备要求低且能耗少等诸多优势。
3.绿色化学协同微波破壁黑木耳制备的多糖产品无异味、感官性状好，无需脱色等后处理。操作在中性条件下进行，没有酸碱等化学试剂的引入。操作中所使用浓度低双氧水，操作结束后易分解成水与氧气，在整个单元操作过程中不会留下任何残留物。操作中在加DES溶剂前加入维生素C有助于黑木耳多糖的有效溶出及生物活性的增强，黑木耳多糖的提取得率、ABTS+与DPPH自由基清除率与不加维生素C相比，得率由66.84％提高到77.31％，ABTS+清除率由76.16％提高到95.48％，DPPH自由基清除率由86.25％提高到91.35％。与阴性对照组相比，绿色化学协同微波加维生素C破壁的处理方式可使黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力(ABTS+清除率、DPPH自由基清除率)、秀丽隐杆线虫的运动能力与抗热应激能力显著提高(p<0.05)。黑木耳多糖的提取得率与自由基清除能力(ABTS+与DPPH自由基)比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了26.47倍、1.75倍、2.36倍，比传统的采用机械粉碎的粗粉提取的黑木耳多糖分别提高了1.45倍、1.09倍、1.06倍。线虫运动能力(身体弯曲频率与摆动频率)比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了1.59倍与1.27倍，抗热应激能力比传统的采用热水提取的黑木耳多糖提高了1.28倍；比机械粗粉分别提高了1.26倍、1.07倍与1.08倍。跟生物酶法破壁比较，黑木耳多糖的提取得率比纤维素酶法提高了3.85倍。该工艺条件温和，绿色环保，符合保健食品的生产要求。线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了1.59倍、1.27倍、1.28倍。
(四)附图说明
图1真菌细胞壁结构。
图2苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量的标准曲线。
图3双氧水破碎不同单因素对提取黑木耳多糖得率的影响。
图4各因素交互作用的响应面和等高线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中双氧水以质量浓度30％双氧水形式加入。
实施例1
1材料与试剂
黑木耳(黑龙江省萝北县延军农场小兴安岭产)。
苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、过硫酸钾、氯仿、正丁醇、丙酮、硫酸亚铁、氯化亚铁、无水三氯化铁、铁氰化钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、双氧水、水杨酸、Tris碱、邻苯三酚、菲咯嗪(Ferrozine)、抗坏血酸(Vc)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)，实验所用水为去离子水。
N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和大肠杆菌(Escherichiacoli)OP50由浙江大学动物科学学院惠赠。
2实验仪器
JP-250A-2型高速多功能粉碎机，上海市久品工贸有限公司；FA224上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-S数显恒温水浴锅，金坛市国旺实验仪器厂；SHA-B数显恒温振荡器，常州天瑞仪器有限公司；L535-1低速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；紫外可见光分光光度计i3，海能仪器；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵，郑州科率仪器设备有限公司；VS-840K-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；智能生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；KeyenceRE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司。
3实验方法
3.1黑木耳粉
将黑木耳子实体置于50℃烘箱烘干至质量含水量为12％以下，粉碎，过150～200目筛，即为黑木耳粉。
3.2绿色化学协同微波破壁提取黑木耳多糖工艺的优化
3.2.1深共晶溶剂(DES)以及水化DES含水量的筛选
(1)DES的筛选。制备3种DES，分别为甘醇-氯化胆碱、尿素-氯化胆碱与三乙二醇-氯化胆碱。分别将DES中的两种溶剂按照摩尔比各自为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4混合，在80℃加热110min后，混合液即为DES。称取黑木耳粉(过150～200目筛)1g，按1g/50mL的量加入DES，采用微波提取，在“中火”(700W)条件下提取5min后，8000rpm离心15min，记录上清液体积。取1.0mL上清液，采用苯酚-硫酸法(参照GB/T 15672-2009)检测上清液中多糖含量，并折算为得率。
(2)水化DES中含水量的筛选。3种DES，按步骤(1)筛选出的最佳物质的量配比的DES(即摩尔比为2:1的三乙二醇与氯化胆碱)提取黑木耳多糖。称取黑木耳粉(过150～200目筛)1g，按1g:50mL的量，分别加入50mL去离子水，50mL去离子水体积浓度80％的水化DES(即深共晶溶剂与去离子水体积比20:80的混合液)，50mL去离子水体积浓度60％的水化DES(即深共晶溶剂与去离子水体积比40:60的混合液)，50mL去离子水体积浓度40％的水化DES(即深共晶溶剂与去离子水体积比60:40的混合液)，50mL去离子水体积浓度20％的水化DES(即深共晶溶剂与去离子水体积比80:20的混合液)，50mL DES(即不含去离子水)，同步骤(1)条件下进行提取，采用苯酚-硫酸法检测上清液中多糖含量，并折算为得率。
(3)多糖含量检测方法：参照GB/T 15672-2009。
多糖得率(％)＝[c*V*F*10-6/M*(1-w)]*100。
式中，c—根据标准曲线(图2)得到的待测多糖样品的浓度(μg/mL)；V—提取多糖样品的上清液体积(mL)；F—稀释倍数；M—黑木耳粉的质量(g)；W—黑木耳粉的含水量(％)。
3.2.2绿色化学协同微波全破壁提取黑木耳多糖工艺的优化
取黑木耳粉，分别以料液比、双氧水浓度、水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)用量、双氧水处理时间及DES处理时间为单因素，置于微波中用“中火”档处理黑木耳粉(“高火”时提取液易爆沸，“低火”及“中低火”时提取效率低)，以多糖得率为响应值进行单因素实验，具体方法如下：
(1)液料比：称取黑木耳粉(过150～200目筛)1.0g，分别按40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1(mL/g)料液比加入质量浓度为30％的双氧水和去离子水，使得双氧水加入质量终浓度均为1.0％，pH7.0，微波(700W)提取3min后，再加入水化DES 30mL，微波(700W)提取2min后，8000rpm离心15min，记录上清液体积。取1.0mL上清液，采用苯酚-硫酸法检测上清液中多糖含量，并折算为得率。
(2)水化DES用量：称取黑木耳粉(过150～200目筛)1.0g，按1g/50mL料液比加入质量浓度为30％的双氧水和去离子水使得双氧水加入质量终浓度为1.0％，pH7.0，微波(700W)提取3min后，加入水化DES 20、30、40、50、60、70mL。其他步骤同步骤(1)。
(3)双氧水浓度：称取黑木耳粉1.0g(过150～200目筛)，按1/50(g/mL)料液比分别加入质量浓度30％双氧水和去离子水，使双氧水加入质量终浓度分别为0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％与1.6％，pH7.0，微波(700W)提取3min后，加入水化DES 30mL。其他步骤同步骤(1)。
(4)双氧水处理时间：称取黑木耳粉1.0g(过150～200目筛)，按1g/50mL料液比加入质量浓度30％的双氧水和去离子水使得双氧水加入质量终浓度为1.0％，pH7.0，微波(700W)提取120、150、180、210、240、270s后，加入水化DES 30mL。其他步骤同步骤(1)。
(5)DES处理时间：称取黑木耳粉1.0g(过150～200目筛)，按1g/50mL料液比加入质量浓度30％的双氧水和去离子水使得双氧水加入质量终浓度为1.0％，pH7.0，微波(700W)提取180s后，加入水化DES 30mL，微波(700W)提取60、90、120、150、180、210s。其他步骤同步骤(1)。
3.3响应面设计
根据单因素结果，选取影响黑木耳多糖得率显著的三个因素(料液比、水化DES用量、双氧水浓度)为自变量，黑木耳多糖得率为响应值，采用Box-Behnken Design方法(三因素三水平)设计响应面实验。
根据中心组合试验原理，采用Design-Expert.V8.0.6软件设计了三因素三水平响应面分析试验，响应面实验因素水平见表1。
称取黑木耳粉(过150～200目筛)1.0g，分别按表1料液比加入质量浓度30％双氧水和去离子水使得双氧水浓度不同，pH7.0，微波(700W)提取3min后，再按表1加入不同体积的水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)，微波(700W)提取2min后，8000rpm离心15min，记录上清液体积。取1.0mL上清液，采用苯酚-硫酸法检测上清液中多糖含量，并折算为得率。
表1绿色化学协同微波破壁提取黑木耳多糖的实验设计因素水平表
编码水平 A:液料比(mL/g) B:水化DES用量(mL) C:双氧水浓度(％)
-1 60 40 0.8
0 70 50 1.0
1 80 60 1.2
3.4体外抗氧化指标检测
按4.2.3方法制备黑木耳多糖液，按3.2.1的方法检测多糖含量后，用去离子水稀释成多糖含量0.5mg/mL的多糖溶液，测定以下抗氧化指标：
(1)ABTS+清除率的测定。采用pH 7.4的PBS配制7.4mmol/L的ABTS储备液。然后制备ABTS工作液，即将ABTS储备液1mL与K2S2O8储备液1mL(2.6mmoL/L，溶剂为去离子水)混匀，静置过夜，即为ABTS工作液。取1.0mL ABTS工作液，用PBS(pH 7.4)稀释至734nm处吸光度值为0.7±0.02，即为ABTS使用液。取1.0mL多糖溶液(0.5mg/mL)，与ABTS使用液4mL混合均匀，常温避光静置6min，于734nm波长测吸光度。95％乙醇代替样品做为空白，与样品等浓度的Vc水溶液作阳性对照。ABTS+清除率的计算公式如下：清除率＝(A空白-A样品)/A空白×100％。
(2)DPPH自由基清除率的测定。取2mL多糖溶液(0.5mg/mL)于试管中，加入DPPH(0.1mmol/L)的无水乙醇溶液2mL，于涡旋振荡器上混合均匀，室温下避光静置30min。517nm处测定吸光度，记为A样品。去离子水代替多糖溶液做空白，记为A空白；去离子水代替DPPH乙醇溶液做对照，记为A对照；与样品等浓度的Vc水溶液作阳性对照。DPPH自由基清除率的计算公式如下：
清除率＝(A空白-A样品+A对照)/A空白×100％
3.5体内生物活性指标检测
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)生长培养基(NGM培养基)的配制：1000mL的NGM培养基含2.5g蛋白胨，3g NaCl，17g琼脂，25mL PBS缓冲液(pH 6.0,1M)，975mL去离子水，灭菌后加入1mL胆固醇水溶液(5mg/mL)，1mL MgSO4水溶液(1M)，1mL CaCl2水溶液(1M)。
1000mL的LB培养基含10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，以5M NaOH调至中性，溶剂为蒸馏水。
1000mL的M9缓冲液含l5.12 g Na2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、5g NaCl、0.25gMgSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
裂解液：0.5mL去离子水，0.3mL NaClO，0.2mL 10mol/L NaOH水溶液，现配现用。
线虫培养：E.coli OP50接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，获得E.coli OP50培养液，置于4℃备用。将E.coli OP50培养液涂布至NGM培养基上，37℃培养48h至细菌生长良好后，接种秀丽隐杆线虫N2，于20℃恒温培养72h后，可见培养基上有大量成虫和幼虫。
线虫同步化：选择线虫生长良好的平板，吸取1.5mL M9缓冲液于平板上，洗涤平板数次直至将大部分虫体洗下，吸取1mL线虫悬浊液于1.5mL EP管中，3000rpm离心1min，弃去上清液，用0.25mL去离子水复溶沉淀。然后加入0.15mL裂解液，漩涡振荡5min，4000rpm离心1min，弃去上清液，再加入1mL M9缓冲液复溶，涡旋洗涤，4000rpm离心1min，重复洗涤直至无次氯酸钠的味道。将裂解出的虫卵置于未涂布E.coli OP50的NGM培养基上，于20℃培养箱中培养16h后，为L1期线虫。用M9缓冲液将虫体洗下，置于已涂布E.coli OP50的NGM培养基上，在20℃培养箱中培养48h，得同步化完成的L4期线虫。
黑木耳多糖对C.elegans运动能力的影响。将涂布E.coli OP50的NGM培养基平板设置阴性对照组、阳性对照组及多糖组，阴性对照组加入150μL的M9缓冲液，阳性对照组添加150μL的Vc水溶液(0.1mg/mL)，多糖组分别添加150μL不同浓度4.2.3方法制备的黑木耳多糖溶液(0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL)。分别挑取30条同步化处理后L4期的线虫至各个平板上，于20℃培养48h。然后转移至含50mM甲基紫精的96孔板上，于20℃培养3h后，测定以下指标。①身体弯曲频率测定：将C.elegans挑取至没有食物的NGM培养基上观察其身体弯曲频率，观察前先让C.elegans自由运动1min，然后在显微镜下观察并记录20s内C.elegans的身体弯曲次数，作为身体弯曲频率的指标。1次弯曲定义为C.elegans相对于身体长轴方向上的一个波长移动。②头部摆动频率测定：将C.elegans挑取至没有食物的NGM培养基上，观察其头部摆动频率，观察前先让C.elegans自由摆动恢复1min，在显微镜下观察并记录30s内C.elegans的头部摆动次数，作为头部摆动频率的指标。1次头部摆动定义为其头部摆动方向改变，改变必须转过其身体朝向方向。
黑木耳多糖对C.elegans热应激反应的影响。将涂布E.coli OP50的NGM培养基平板设置阴性对照组、阳性对照组及多糖组，阴性对照组加入150μL的M9缓冲液，阳性对照组添加150μL的Vc水溶液(0.1mg/mL)，多糖组分别添加150μL不同浓度4.2.3方法制备的黑木耳多糖溶液(0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL)。分别挑取30条同步化处理后L4期的线虫至平板上，于20℃培养48h。然后将C.elegans放置35℃条件下培养6h，再转移至20℃培养。从转移当天(寿命实验第0d)起计算C.elegans存活天数，并每天记录C.elegans存活和死亡条数，实验持续至最后一条C.elegans死亡为止，以铂金丝碰触C.elegans仍然不动即判定为死亡。
4实验结果
4.1DES试剂以及DES含水量对黑木耳多糖得率的影响
(1)DES的筛选。分别以甘醇-氯化胆碱、尿素-氯化胆碱与三乙二醇-氯化胆碱为提取试剂，在DES中两种试剂摩尔比分别为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4时提取黑木耳多糖，多糖的提取得率见表2。
表2不同DES对黑木耳多糖提取得率的影响
Figure BDA0003088377130000101
Figure BDA0003088377130000111
由表2可知，不同DES以及每种DES中两种物质的摩尔比对黑木耳多糖提取得率的影响不同。三乙二醇-氯化胆碱中三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为3:1到1:1时，黑木耳多糖的提取得率较高；当三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1时，黑木耳多糖的得率最高(17.28％)，以下实验选取三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1配制DES，进行含水量的筛选。
(2)水化DES中的含水量对黑木耳多糖提取得率的影响。三乙二醇与氯化胆碱按摩尔比为2:1配制的DES，与去离子水的不同配比对黑木耳多糖提取得率的影响见表3。
表3水化DES含水量对黑木耳多糖提取得率的影响
Figure BDA0003088377130000112
由表3可知，随着含水量的增加，深共晶溶剂对于黑木耳多糖的提取得率逐渐增加，在含水量达到80％时，黑木耳多糖的提取得率最大。深共晶溶剂本身由于流动性不好，具有较高的粘度，影响了其对黑木耳多糖的提取。当深共晶溶剂中加入去离子水时，它的粘度逐渐降低，其对黑木耳多糖的提取得率逐渐增大，当去离子水含量达到80％达到黑木耳多糖提取得率最高(19.06％)。以下实验选取含水量为80％的DES试剂(三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)提取黑木耳多糖。
4.2绿色化学协同微波全破壁提取黑木耳多糖的单因素实验及响应面优化
4.2.1绿色化学协同微波全破壁提取黑木耳多糖的单因素实验
料液比、水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)用量、双氧水浓度、双氧水处理时间与DES处理时间对黑木耳多糖提取得率的影响见图3。
如图3所示，料液比、水化DES用量与双氧水浓度三个因素对黑木耳多糖的影响，均随着水平数的增加多糖得率不断提高，至折点时多糖得率达到最大值，随后随着水平数的增加，多糖得率出现下降趋势。因而，料液比、水化DES用量与双氧水浓度这三个因素的中心点分别选为70mL/1g、50mL(与黑木耳粉的比例为50:1mL/g)与1.0％。双氧水与DES处理时间这两个因素对黑木耳多糖的影响，均随着水平数的增加多糖得率不断提高，最后趋于平缓，没有出现拐点。因而，双氧水与DES处理时间分别设定为210s与150s。
4.2.2绿色化学协同微波全破壁提取黑木耳多糖的响应面优化
根据中心组合试验原理，采用Design-Expert.V8.0.6软件设计了三因素三水平响应面分析试验。实验设计及结果见表4。
表4绿色化学协同微波全破壁提取黑木耳多糖实验设计及及实验结果0.8
Figure BDA0003088377130000121
对表4中的试验数据进行多元回归拟合，得到以多糖得率(Y)为响应值的回归方程：
Y＝80.18+3.19A+2.86B-0.54C-0.31AB+3.50AC+2.32BC-6.28A2-4.47B2-3.13C2
对回归方程进行方差分析，结果见表5。
表5双氧水破壁提取黑木耳多糖得率的回归模型分析
Figure BDA0003088377130000122
Figure BDA0003088377130000131
方程相关系数R2＝0.9596，说明模型相关性良好；调整相关系数R2 adj＝0.9077，说明方程能解释90.77％的响应值变化，拟合程度良好；变异系数为2.46％，表明模型可信度较高。因此，可以用该方程推测试验结果。
由方差分析结果可知，3个因素中一次项A、B对响应值影响极显著；二次项中A2、B2、C2对响应值曲线效应影响极显著；交互项AC、BC对响应值曲面效应影响极显著，交互项AC对响应值曲面效应影响不显著，表明料液比和双氧水浓度、双氧水浓度和水化DES用量之间均存在明显的协同增效作用，而料液比和水化DES用量之间则无协同增效效应；由F值大小可推断3个因素对多糖得率影响的主次顺序为：A>B>C，即料液比＞水化DES用量＞双氧水浓度；即料液比和双氧水浓度(AC)的交互效应强于水化DES用量和双氧水浓度(BC)。
依据回归方程作响应面和等高线图如图4。
响应面图坡度大表明因素对响应值影响大，等高线密集呈椭圆形表示两因素交互影响较大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反。图4中，料液比与双氧水浓度、双氧水浓度和水化DES用量两组的交互效应等高线趋近椭圆，表明两者存在明显交互作用。
利用模型优化的最佳条件为：液料比为73.187mL/g，水化DES用量为53.817mL，双氧水浓度为1.046％(质量分数)，此条件下多糖溶出率可达75.51％。结合实际实验室条件，最优调整为：液料比73mL/g，水化DES用量54mL，双氧水浓度为1.05％。为了进一步验证该模型与实际情况的有效性与准确性，按响应面试验优选出的提取条件进行3次平行实验，黑木耳多糖得率可以达到77.31％±1.06％，与预测值一致，说明响应面分析方法可靠，与实际情况拟合较好，从而验证了回归方程的有效性。
4.2.3绿色化学协同微波全破壁提取黑木耳多糖的制备方法
根据4.2.2优化的最佳提取参数，黑木耳多糖提取方法如下：(1)取10g黑木耳粉(过150～200目筛)加入300mL去离子水a中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。取预处理后的黑木耳浆310g，加入404.5mL去离子水b，再加入质量分数为30％的双氧水25.5mL，此时双氧水的质量终浓度为1.05％，调pH至7.0，混匀，此时黑木耳与提取液(去离子水a、去离子水b和双氧水的总体积)的液料比为73mL/g，置于微波炉中在“中火”档(700W)提取210s后，获得提取液a；(2)向步骤(1)提取液a中再加入维生素C 3.825g，水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)540mL，微波(700W)提取150s，获得提取液b；(3)然后提取液b在8000rpm条件下离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.6倍，冷却至4℃后，得到浓缩液，加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)200mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL(即浓缩至去离子水体积的1/3)，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5％，获得黑木耳多糖7.731g，用于以下生物活性检测。
4.3黑木耳多糖的体外清除自由基能力
按4.2.3方法制备黑木耳多糖，ABTS+清除率与DPPH自由基清除率见下表6。
表6黑木耳多糖清除自由基的效果
Figure BDA0003088377130000141
由表6可知，绿色化学协同微波全破壁制备的黑木耳多糖对ABTS+与DPPH自由基清除能力均随着多糖浓度的增加而加强，均具有浓度依赖关系。可见，绿色化学协同微波的全破壁方法除能极大提高黑木耳多糖的得率，还可以保证破壁过程不破坏多糖“活性片段”的完整性，所提取的多糖仍具有较强的自由基清除能力。
4.4黑木耳多糖对线虫运动能力与抗热应激能力的影响效果
按4.2.3方法制备黑木耳多糖，对C.elegans运动能力的影响见表7。
表7黑木耳多糖对C.elegans运动能力的影响
Figure BDA0003088377130000151
注：“*”指各实验组与阴性对照组比较存在显著性差异(p<0.05)
由表7可知，在0.4-0.8mg/mL浓度范围内，黑木耳多糖对C.elegans的身体弯曲频率与头部摆动频率均有增强作用，且浓度越高，频率越高。所有浓度(0.1-0.8mg/mL)的黑木耳多糖对C.elegans身体弯曲频率的影响与阴性对照组比较均有显著差异(p<0.05)。高浓度(0.4-0.8mg/mL)的黑木耳多糖对C.elegans头部摆动频率的影响与阴性对照组比较均有显著差异(p<0.05)。实验结果表明，采用绿色化学协同微波破壁制备的黑木耳多糖能够显著增强C.elegans的运动能力；另外，运动行为亦可以用来评价植物提取物的抗氧化保护作用，而摆动头部和弯曲身体的频率通常作为运动行为的分析参数，这也说明所制备的黑木耳多糖也能够显著减缓C.elegans的氧化应激损伤程度。
按4.2.3方法制备黑木耳多糖，对C.elegans抗热应激能力的影响见表8。
表8黑木耳多糖对C.elegans抗热应激能力的影响
Figure BDA0003088377130000152
注：“*”指各实验组与阴性对照组比较存在显著性差异(p<0.05)
由表8可以得出，C.elegans经热应激反应且经过高浓度黑木耳多糖(0.4-0.8mg/mL)处理后，其平均存活时间显著高于阴性对照组(p<0.05)，低浓度黑木耳多糖(0.1-0.2mg/mL)对C.elegans平均存活时间与阴性对照组比较无差异(p>0.05)，说明(p<0.05)的对热应激下C.elegans平均存活时间的影响具有浓度依赖关系。另一方面，热应激效应会引起细胞的氧化应激，导致机体组织细胞内氧化代谢产物增加，氧自由基、过氧化物含量增高，抗氧化酶分解氧化物速度很难跟上氧化代谢反应的速度，严重影响机体正常的生理代谢，引起组织损伤。因此，黑木耳多糖亦能够显著减缓C.elegans的应激损伤程度。
比较例1
将10g黑木耳粉(150-200目筛)，按料液比1g:30mL加入去离子水300mL，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。
预处理后的黑木耳浆310g加入去离子水300mL，在80℃条件下提取4h，离心(8000rpm,20min)，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于60mL去离子水中后，采用实施例1的sevag法脱蛋白至280nm没有吸收峰，浓缩至体积为20mL后，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5.0％，获得水提法黑木耳多糖0.292g，多糖得率、自由基清除能力与体内生物活性分析测试同实施例1，结果见表9。
表9不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标
Figure BDA0003088377130000161
由表9可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率及体外生物活性影响很大，绿色化学协同微波破壁提取可使黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力、运动能力与抗热应激能力明显提高，其中提取得率、ABTS+与DPPH自由基清除比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了26.47倍、1.75倍、2.36倍；线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了1.59倍、1.27倍、1.28倍。
比较例2
将实施例1的4.2.3中，黑木耳粉改为过40目筛，其他操作同实施例1中4.2.3，黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力与体内生物活性指标见表10。
表10不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标
Figure BDA0003088377130000171
由表10可知，黑木耳预处理工艺对多糖的提取得率有一定影响，粉碎后过150-200目筛的预处理方式可使黑木耳多糖的提取得率提高，比传统的机械粉碎的粗粉提取的黑木耳多糖提高了1.45倍；ABTS+与DPPH自由基清除率分别提高了1.09倍、1.06倍；线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间比机械粉碎粗粉提取的黑木耳多糖分别提高了1.26倍、1.07倍、1.08倍。
比较例3
将10g黑木耳粉采用实施例1的4.2.3方法预处理后，加入0.8g纤维素酶，以600mL去离子水为提取剂(不加维生素c)，在作用温度55℃、pH 4.8、料液比1g/60mL条件下作用3.0h。采用实施例1方法检测黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力与体内生物活性指标，结果见表11。
表11不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标
Figure BDA0003088377130000172
由表11可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率有很大影响，绿色化学协同微波破壁处理方式可使黑木耳多糖的提取得率明显提高，比纤维素酶处理提取的黑木耳多糖提高了3.85倍；对ABTS+与DPPH自由基清除率，以及线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间的影响没有差异。
比较例4
按实施例1的4.2.3方法中的预处理与提取方法，不加维生素C，其他操作相同。采用实施例1方法检测黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力与体内生物活性指标，结果见表12。
表12不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标
Figure BDA0003088377130000181
由表12可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率及自由基清除率有一定影响，提取时加维生素C的提取方式可使黑木耳多糖的提取得率、ABTS+与DPPH自由基清除率明显提高，比不加维生素C提取的黑木耳多糖分别提高了1.12倍、1.41倍、1.08倍；对线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间的影响没有差异。
比较例5
按实施例1的4.2.3方法中的预处理与提取方法，但维生素C是在加双氧水之前加入，其他操作相同。采用实施例1方法检测黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力与体内生物活性指标，结果见表13。
表13不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标
Figure BDA0003088377130000182
由表13可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率及自由基清除率有一定影响，加DES之前加维生素C的提取方式可使黑木耳多糖的提取得率、ABTS+与DPPH自由基清除率明显提高，比加双氧水之前加维生素C提取的黑木耳多糖分别提高了1.16倍、1.25倍、1.06倍；对线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间的影响没有差异。
比较例6
按实施例1的4.2.3方法中的预处理与提取方法，只加双氧水，不加维生素C与DES，其他操作相同。采用实施例1方法检测黑木耳多糖的提取得率、自由基清除能力与体内生物活性指标，结果见表14。
表14不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标
Figure BDA0003088377130000191
由表14可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率及自由基清除率有一定影响，绿色化学协同微波破壁的处理方式可使黑木耳多糖的提取得率、ABTS+与DPPH自由基清除率明显提高，比双氧水协同微波破壁提取的黑木耳多糖分别提高了1.22倍、1.36倍、1.12倍；线虫身体弯曲频率、头部摆动频率与平均存活时间分别提高了1.12倍、1.11倍、1.16倍。
实施例2
(1)准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水a中，25℃溶胀10h，得到预处理后的黑木耳浆310g。预处理后的黑木耳浆310g，加入468mL去离子水b，再加入质量分数为30％的双氧水32mL，此时双氧水的质量终浓度为1.20％，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为80mL/g，调pH至7.0，置于微波炉中在“中火”档(700W)提取210s后，获得提取液a；(2)向提取液a中再加入加入维生素C 3.2g，水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)400mL，微波(700W)提取150s，获得提取液b。(3)提取液b在8000rpm离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.6倍，冷却至4℃后，获得浓缩液，加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)200mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL(即浓缩至去离子水体积的1/3)，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5％，获得黑木耳多糖7.54g。多糖得率平均值为75.4％，ABTS+清除率为94.16％、DPPH自由基清除率为90.13％，线虫身体弯曲频率16.98，头部摆动频率77.11，平均存活时间14.12d。
实施例3
(1)准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水a中，25℃溶胀14h，得到预处理后的黑木耳浆310g。预处理后的黑木耳浆310g，加入468mL去离子水b，再加入质量分数为30％的双氧水32mL，此时双氧水的终浓度为1.20％，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为80mL/g，调pH至7.0，置于微波炉中在“中火”档(700W)提取210s后，获得提取液a；(2)向提取液a中再加入加入维生素C 4.8g，水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)500mL，微波(700W)提取150s，获得提取液b。(3)提取液b在8000rpm离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.6倍，冷却至4℃后，获得浓缩液；加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)200mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL(即浓缩至去离子水体积的1/3)，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5％，获得黑木耳多糖7.62g。多糖得率平均值为76.2％，ABTS+清除率为93.88％、DPPH自由基清除率为90.06％，线虫身体弯曲频率17.03，头部摆动频率76.17，平均存活时间14.76d。
实施例4
(1)准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水a中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。预处理后的黑木耳浆310g，加入280mL去离子水b，再加入质量分数为30％的双氧水20mL，此时双氧水的终浓度为1.00％，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为60mL/g，调pH至7.0，置于微波炉中在“中火”档(700W)提取210s后，获得提取液a；(2)向提取液a中再加入加入维生素C2.0g，水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)600mL，微波(700W)提取150s，获得提取液b。(3)提取液b在8000rpm离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.6倍，冷却至4℃后，获得浓缩液；加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)200mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL(即浓缩至去离子水体积的1/3)，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5％，获得黑木耳多糖7.49g。多糖得率平均值为74.9％，ABTS+清除率为94.16％、DPPH自由基清除率为90.13％，线虫身体弯曲频率16.98，头部摆动频率77.11，平均存活时间14.12d。
实施例5
(1)准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水a中，25℃溶胀14h，得到预处理后的黑木耳浆310g。预处理后的黑木耳浆310g，加入284mL去离子水b，再加入质量分数为30％的双氧水16mL，此时双氧水的终浓度为0.80％，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为60mL/g，调pH至7.0，置于微波炉中在“中火”档(700W)提取210s后，获得提取液a；(2)向提取液a中再加入加入维生素C 4.8g，水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)600mL，微波(700W)提取150s，获得提取液b。(3)提取液b在8000rpm离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.6倍，冷却至4℃后，获得浓缩液；加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)200mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL(即浓缩至去离子水体积的1/3)，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5％，获得黑木耳多糖7.53g。多糖得率平均值为75.3％，ABTS+清除率为93.87％、DPPH自由基清除率为90.41％，线虫身体弯曲频率16.43，头部摆动频率77.67，平均存活时间14.69d。
实施例6
(1)准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水a中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。预处理后的黑木耳浆310g，加入282mL去离子水b，再加入质量分数为30％的双氧水18mL，此时双氧水的终浓度为0.90％，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为60mL/g，调pH至7.0，置于微波炉中在“中火”档(700W)提取210s后，获得提取液a；(2)向提取液a中再加入加入维生素C1.8g，水化DES(去离子水体积浓度80％，三乙二醇与氯化胆碱的摩尔比为2:1)500mL，微波(700W)提取150s，获得提取液b。(3)提取液b在8000rpm离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.6倍，冷却至4℃后，获得浓缩液；加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)200mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL(即浓缩至去离子水体积的1/3)，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为-30℃，真空度为80Pa)至质量含水量5％，获得黑木耳多糖7.61g。多糖得率平均值为76.1％，ABTS+清除率为94.03％、DPPH自由基清除率为90.04％，线虫身体弯曲频率16.13，头部摆动频率76.51，平均存活时间14.33d。

Claims (9)

1.一种黑木耳多糖，其特征在于所述黑木耳多糖按如下全破壁方法制备：(1)黑木耳粉加入去离子水a溶胀，得到预处理后的黑木耳浆；将处理后的黑木耳浆中加入去离子水b和质量浓度30％的双氧水，混匀，调pH至7.0，在500-800W条件下微波辅助提取100-300s，获得提取液a；(2)向提取液a中加入维生素C，水化DES，再在500-800W条件下微波辅助提取100-300s，获得提取液b；所述水化DES是指去离子水与深共晶溶剂的混合液；所述深共晶溶剂为氢键供体与氯化胆碱以物质的量之比0.1-5:1混合后，在80℃加热110min制成，所述深共晶溶剂的氢键供体包括甘醇、尿素或三乙二醇；(3)将提取液b离心，取沉淀用体积浓度95％乙醇水溶液溶解，静置，离心，取沉淀用去离子水溶解，采用sevag法脱蛋白，浓缩，干燥，获得黑木耳多糖。
2.如权利要求1所述黑木耳多糖，其特征在于步骤(1)中去离子水a与去离子水b和双氧水总体积为提取剂，提取剂体积用量以黑木耳粉质量计为60-80mL/g。
3.如权利要求2所述黑木耳多糖，其特征在于步骤(1)双氧水在提取剂中的加入终浓度为0.4％-1.6％。
4.如权利要求2所述黑木耳多糖，其特征在于步骤(1)黑木耳粉过150～200目筛，加入去离子水a，25℃溶胀10-14h，得到预处理后的黑木耳浆。
5.如权利要求1所述黑木耳多糖，其特征在于步骤(2)中所述水化DES中去离子水体积浓度为20-80％；所述深共晶溶剂为三乙二醇与氯化胆碱以物质的量之比2:1混合制成。
6.如权利要求1所述黑木耳多糖，其特征在于步骤(2)中维生素C与步骤(1)中双氧水质量比为1:1-3；所述水化DES体积用量以步骤(1)中黑木耳粉质量计为40-60mL/g。
7.如权利要求2所述黑木耳多糖，其特征在于步骤(3)按如下步骤进行：提取液b在8000rpm条件下离心20min，取上清液，浓缩至提取液b体积的0.4-0.7倍，冷却至4℃后，获得浓缩液；加入4倍浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于浓缩液体积0.4-0.9倍去离子水后，沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入去离子水体积0.1-0.4倍Sevag试剂，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至去离子水体积的25-35％，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥至质量含水量6％以下，获得黑木耳多糖；所述Sevag试剂为体积比4:1的氯仿：正丁醇。
8.一种权利要求1所述黑木耳多糖在制备抗应激药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述抗应激药物为增强运动能力的药物。
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